İn Vivo Domuzdan Hindlimb Dorsiflexor İzometrik Tork Ölçümü

Özet

Bu protokol, anestezi uygulanan domuzlarda ortak peroneal sinirin elektriksel stimülasyonu yoluyla elde edilen in vivo tork verilerinin değerlendirilmesi ve yorumlanması ile ilgili kısa deneysel ayrıntıları açıklamaktadır.

Özet

İskelet kas gücünün güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi hastalığı ve yaralanma çalışmalarında, özellikle rejeneratif tedavilerin etkinliğini değerlendirirken, tartışmasız en önemli sonuç ölçüsüdür. Ek olarak, birçok rejeneratif terapiyi çevirmenin kritik bir yönü, büyük bir hayvan modelinde ölçeklenebilirliğin ve etkinliğin gösterilmesidir. Temel bilim çalışmalarında, özellikle küçük hayvan modellerinde intrinsik kas fonksiyon özelliklerini değerlendirmek için çeşitli fizyolojik preparatlar oluşturulmuştur. Uygulamalar şu şekilde kategorize edilebilir: in vitro (izole lifler, lif demetleri veya tüm kas), in situ (sağlam vaskülarizasyon ve innervasyona sahip kas, ancak bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlı distal tendon) ve in vivo (kas veya kas ünitesinin yapıları bozulmadan kalır). Bu hazırlıkların her birinin güçlü ve zayıf yönleri vardır; Bununla birlikte, in vivo mukavemet testinin açık bir avantajı, aynı hayvanda tekrarlanan ölçümler yapabilme yeteneğidir. Burada, anestezi uygulanan domuzlarda standart peroneal elektriksel stimülasyona yanıt olarak arka bacak dorsiflekstor kasları tarafından üretilen izometrik torku in vivo olarak güvenilir bir şekilde değerlendirmek için kullanılan materyal ve yöntemler sunulmuştur.

Giriş

İskelet kasının birincil işlevi, sonuçta nefes alma, yeme ve ambulasyon gibi aktiviteleri mümkün kılan kuvvet üretmektir. İskelet kası fonksiyonel kapasitesini azaltan koşullar, performansın azalmasına (mesleki veya spor), sakatlığa veya ölüme neden olabilir. Örneğin, yaşlanan toplumlarda kas kütlesinin ve fonksiyonunun korunması, yaşam kalitesi ve günlük yaşamın temel ve enstrümantal aktivitelerini gerçekleştirme kapasitesi ile pozitif ilişkilidir ^1,2. Duchenne musküler distrofisi hastalarında kas gücünün azalması, ambulasyon yetersizliği ve solunum yetmezliği ile sonuçlanır ve sonuçta erken mortaliteye katkıda bulunur ^3,4,5. Bu nedenle, kas gücü ölçümü, nöromüsküler hastalık veya yaralanma içeren çalışmalarda kritik bir sonuç ölçüsüdür.

Maksimum gönüllü izometrik veya izokinetik tork (ve / veya yorulma indeksi) genellikle klinik çalışmalarda fonksiyonel kapasitenin bir indeksi olarak kullanılır⁶. Hayvan çalışmalarında, anestezi altındayken elektriksel sinir stimülasyonu kullanılarak in vivo olarak benzer ölçümler yapılabilir. Özellikle, in vivo preparatlar kas sistemi, tendonlar, vaskülatür ve innervasyon bozulmadan kalan minimal invazivdir ve bu nedenle tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmelere izin verir 7,8,9,10,11. Bu preparat genellikle küçük kemirgen modellerinde ve daha az ölçüde tavşan¹², köpekler 13,14, koyun¹⁵ ve domuzlar ^16,17 gibi daha büyük hayvan modellerinde kullanılır. Bu metodolojinin genel kullanımı, spinal müsküler atrofinin (SMA) genetiği değiştirilmiş domuz (domuz) modellerinde olduğu gibi birçok translasyonel araştırma çalışmasına etkili ^olabilir18. Bu yazıda, in vivo olarak domuz dorsiflekstor kas grubunun sinir stimülasyonuna bağlı maksimal izometrik torkunu değerlendirme yöntemleri sunulmuştur. Sunulan teknikler başlangıçta fare ön krural kas torku 19,20'yi değerlendirmek için orijinal olarak geliştirilenlerden uyarlandı ve daha sonra yaralanma sonrası tork üretme kapasitesini araştıran deneyimlerle rafine edildi 17,21,22,23,24,25,26,27,28 ve geliştirme sırasında çeşitli domuz modellerinde¹⁶.

Bu protokol, bir yük hücresi ve elektriksel uyarıcı ile entegre bir bilgisayar gerektiren metodolojiyi kullanarak in vivo izometrik tork ölçümünü vurgulamaktadır. Burada sunulan yöntemler, ticari olarak temin edilebilen entegre bir Domuz İzometrik Ayak Plakası Test Aparatı, platform aparatı ve ilgili yazılımı kullanır (bkz. Bununla birlikte, metodoloji ticari olarak temin edilebilen veya ısmarlama diğer yazılımları, veri toplama cihazlarını ve uyarıcıları kullanacak şekilde uyarlanabilir. Bu yöntemler, aşağıdakiler gibi standart ekipmanlarla dolu özel bir büyük hayvan cerrahi süitinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır: kilitleme cerrahi masası, test platformu için eşit yükseklikte ikinci kilitleme masası, ventilatör ve izleme cihazları ve vücut ısısını korumak için ısıtma matı veya diğer cihazlar.

Bu yöntemleri uygulamak için aşağıdaki ekip üyelerine ihtiyaç vardır: fonksiyonel testi gerçekleştirmek için bir yetenekli anestezi teknisyeni ve iki çalışma personeli. Bu insanlar, platform aparatı üzerindeki uzuvların ilk stabilizasyonu için birlikte çalışacaklardır. Daha sonra, iki personelden biri elektrot yerleştirme / konumlandırma ve diğeri test sırasında bilgisayar uygulamalarından sorumlu olacaktır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Refahı Yasası, Hayvan Refahı Yönetmeliklerinin uygulanması ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ilkelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Önceki testler, bu yöntemlerin güvenilir²⁶ olduğunu ve domuzun sağlığı veya uzuv fonksiyonu üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığını göstermiştir. Test, herhangi bir olumsuz olay olmadan haftalık olarak sık sık gerçekleştirilmiştir²³. Ek olarak, aynı gün boyunca cerrahi öncesi ve sonrası müdahalelerin test edilmesi, hayvan üzerinde istenmeyen stres oluşturmadan veya nöromüsküler disfonksiyona neden olmadan yapılabilir.

1. Bilgisayar kurulumu

1. Aparat ve bileşenlerin ilk setinin ve kalibrasyonunun üretim spesifikasyonları altında yapıldığından emin olun (bakınız Malzeme Tablosu). 0,2-2,5 kg arasında bir ağırlık aralığı kullanılarak kalibrasyon yapılması önerilir.
   NOT: Tork, 50 Newton-metre (N·m) kapasiteli doğrusal bir tork sensörüne bağlı 140 mm ayak pedalı (0,14 m) ile ölçülür. Cihazın kazancı, beklenen tork üretimine daha iyi uyması için varsayılan olarak 25 N·m kapasiteye ölçeklendirilecek şekilde ayarlanmıştır. Kalibrasyon, ayak pedalına bilinen bir mesafede (örneğin, dönüş ekseninden 100 mm) bilinen bir kütle (örneğin, 1 kg) uygulanarak ve tork hesaplanarak gerçekleştirilir. Örneğin, 0,1 m'de uygulanan 1 kg eşittir 9,806 N, 0,9806 N·m torktur. Daha sonra tork sensörüne uygulanan tork ile tork sensörü tarafından karşılık gelen voltaj çıkışı arasında bir ilişki kurulabilir. Yazarın tork sensörleri, belirli bir 40 cm'lik kalibrasyon plakasına uygulanan 0,2-20 kg'lık bu ilişkinin doğrusallığını doğrulamıştır. Standart pedalın uzunluğu nedeniyle, 0,2-2,5 kg'lık bir kalibrasyon aralığı önerilir. Bu, ölçek faktörünü doğrusal regresyonla hesaplamak için yeterli sinyal üretir.
2. Elektrik özelliklerini etkileyebilecek ısıya bağlı malzeme değişikliklerinin stabilizasyonuna izin vermek için testten yaklaşık 30 dakika önce bilgisayarı, uyarıcıyı, dönüştürücü sistemini ve analog-dijital arayüzü açın. Uygun ve bağlı veri toplama (DAQ) cihazını seçin.
3. Yazılımda deneysel parametreleri gerektiği gibi ayarlayın; yazılım kaydedilmiş bir etüt şablonu için izin verir. Yeni Etüt Çalışma kitabı oluştur seçeneğini kullanarak yeni bir etüt oluşturmak için denemeyi (yani etüt şablonunu) ayarlamaya hazırlanın.
   NOT: Deneysel parametreler çalışmaya başlamadan önce önceden yüklenebilir, bu da cinsiyet, vücut kütlesi, doğum tarihi, testin zaman noktası, tedavi grubu veya gerektiğinde benzer değişkenler gibi ek spesifik deney bilgilerinin dahil edilmesine neden olur. Etüt kurulum parametreleri kaydedilebilir ve deney boyunca kullanılabilir.
4. Her değerlendirmenin başında daha önce oluşturulmuş etüdü seçin. Bu, test edilecek domuz için ilk testse Yeni Bir Hayvan ekleyin ve değişkenlerin etüde girilmesi için istemi izleyin.
5. Elektrot yerleşimini optimize etmek için gerekli olacak çalışmaya başlamaya hazır olduktan sonra Deneyi Hazırla'ya tıklayın. Elektrotlar yerleştirildikten sonra optimal yerleşimi belirlerken sinire tekrar seğirmeler verin (bkz. adım 3.6.).
6. Önce Instant Stim'i Yapılandır'a tıklayın ve ardından darbe frekansını, darbe genişliğini, darbe sayısını, tren frekansını ve çalışma süresini ayarlayın.
7. Ardından, tekrarlanan seğirmeler sunmak için Instant Sim'e tıklayın. Alternatif olarak, manuel olarak bir seğirme vermek için Stimülatör ünitesindeki Manuel Tetik düğmesine basın.
8. Kasılmaların gerçek zamanlı olarak araştırılmasına/görselleştirilmesine izin vermek için tüm deneyi başlatmaya hazır olduğunuzda çalışma protokolü sırasında Canlı Veri İzleyicisi'ni açın. Denemeye başlamak için hazırlandığınızda Denemeyi Çalıştır'a tıklayın (hayvan hazırlığının ardından 2. adıma bakın).

2. Anestezi hazırlama ve bakım

1. Hızlı erkek veya dişi domuzlar, 40-90 kg, anestezi olayından bir gece önce, su ad libituma izin verir. İşlem gününde domuzun doğru vücut ağırlığını elde edin ve kaydedin.
2. Kas içi tiletamin / zolzepam (Telazol, 4-6 mg / kg), ksilazin (1-3 mg / kg) ve propofol (2.6 mg / kg) enjeksiyonları ile anesteziyi indükleyin. Başlangıçta, yüz maskesi aracılığıyla% 5 izofluran ile koruyun.
3. Domuzu bir endotrakeal tüp ile entübe edin ve otomatik bir ventilatöre yerleştirin. Domuzu 20_{cm H 2}O'da pik basınçta, 10 mL / kg'lık bir başlangıç gelgit hacminde ve solunum hızlarında 8-12 nefes / dak'da tutun.
4. 40 ± 5 mmHg'lik bir son gelgit PCO_2'yi korumak için ventilatör ayarını yapın. Anesteziyi %30-%37_O2'de %1-%3 izofluran ile sürdürün.
5. Protokol süresince domuzun vücut sıcaklığını 37 ° C'de tutun. Gerektiğinde sıvı verilmesi ve idrar toplanması için kulak damarı ve Foley kateterleri yerleştirin.
   NOT: Cerrahi düzlem anestezisinin kullanılması, test sırasında, özellikle gluteal kaslardan gelen ikincil kasılmaları önleyecektir.
6. Anestezinin derinliğini göz refleksi ve pozisyonu, çene tonu eksikliği, kalp atış hızı (aralık 80-150 bpm), sistolik kan basıncı (aralık 120-70 mmHg) veya tüm bu belirtilerin bir kombinasyonu ile izleyin.
7. Domuz tamamen uyuşturulduktan ve stabil hale getirildikten sonra, herhangi bir döküntüyü gidermek için önce uzuvları sabun ve suyla temizleyerek hem sağ hem de sol arka bacakları hazırlayın ve ardından saçları deriden tıraş edin. Daha sonra elektrot yerleştirilmesi için kullanılacak olan lateral diz bölgesine çok dikkat edin.
8. Domuzu bir ameliyat masasına taşıyın ve sırtüstü pozisyonda güvenli bir şekilde yerleştirin. Domuzu masanın ayağına doğru yerleştirin, gluteal kaslar masanın ucunda veya biraz üzerinde.
   NOT: Bu, test aparatını tutan cerrahi masa ve masanın dayanmasını sağlayacaktır.
9. Testten sonra domuzu ekstübe edin ve iyileşmelerine izin verin. Standart domuz maması ve suyu, domuz tamamen geri kazanıldıktan ve kafes içinde serbestçe dolaşabildikten sonra değiştirilmelidir.
   NOT: İşlem sonrası analjezi tek başına in vivo test için gereksizdir; Bununla birlikte, veteriner tavsiyesi üzerine karprofen ve / veya buprenorfin SR sağlanabilir. Yerel bir veterinere danışılması teşvik edilir. Burada listelenen anestezi ve ilaçlar sadece rehberlik amaçlıdır ve şu anda Minnesota Üniversitesi'nde onaylanmıştır. İzofluran ile anestezinin sürdürülmesi, hızlı başlangıcı ve ofseti ve in vivo sinir stimülasyonu üzerindeki minimum etkisi uyarılmış tork^29'a göre seçildi. Çalışmalar arasında anestezi parametrelerinde tutarlılığa sahip olmaya özen gösterin. Protokol süresince 15 dakikalık aralıklarla anestezi değerlendirme ve kayıt işlemi yapılır; kayıt, yerel Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) yönergelerine ve gereksinimlerine dayanarak gerçekleştirilir.

3. İn vivo izometrik torkun değerlendirilmesi

1. Ayağı kuvvet dönüştürücünün ayak plakasına yerleştirin. Ayağı ayak plakasına bağlamak için esnek bir yapışkan bandaj kullanın.
   NOT: Ayak başına tam bir rol gereklidir; İdeal olarak, 4 inç x 5 yarda rolü yeterlidir.
2. Ayağı ayak bileği nötr (A) olacak şekilde ayak plakası üzerinde yerinde tutun ve yapışkan bandajı ayağın ve ayak plakasının etrafına kapalı bir sepet örgüsü ayak bileği bantlama (B) tarzında sararak ayağı plakaya sabitleyin.
   NOT: İki çalışma personelinin bireysel (A) ve (B) görevlerini aynı anda yerine getirmeleri gerekecektir.
3. Ayak ayak plakasına sabitlendikten sonra ayak bileğini dik açıyla konumlandırın, plantar veya dorsifleksiyon derecelerinin referansı için 0 ° veya nötr olarak tanımlanır.

Şekil 1: Çeşitli görüş noktalarından gelen resimler, ayak plakasına domuz bağlantısını ve çerçeveye anatomik hizalamayı göstermektedir. Anterior kompartman kasları, fibüler baş, diz, tibial plato ve femur için anatomik işaretler not edilmiştir. Subdermal elektrot çiftlerinin bacağın lateral tarafına yerleştirilmesine dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Diz ve ayak bileğini dik açılarda stabilize edin.
5. İlk olarak, uzuv sıkma çubuklarını gerekli yerlere yakın konumlandırın. Hazır olduğunda, ekstremitenin medial yönünden başlayarak, uzuv sıkma çubuğunu yaklaşık tibial platoya hizalayın.
6. Ardından, lateral ekstremite sıkma çubuğunu femur distal kafasına hizalayın.
   NOT: Her bir uzuvun ucu arasında, sıkıştırma çubuğu, çubuğa bitişik cildi korumak için katlanmış 4 x 4 gazlı bez kullanır.
7. Kilitleme vidalarını kullanarak çubukları sıkıca sabitleyin.
   NOT: Uzuv sıkma çubukları birbirleriyle aynı hizada olmayacak, ancak domuzun anatomisine uygun olacaktır.
8. Fibüler kafanın etrafındaki cildi, amaçlanan elektrot yerleşiminin merkezinden başlayarak ve dışa doğru hareket eden eşmerkezli dairelerde temiz gazlı bez yoluyla % 70 alkol uygulayarak temizleyin. Steril perkütan iğneyi (50 mm, 26 G monopolar) ve elektromiyografi (EMG) tarzı elektrotları (bakınız Malzeme Tablosu) peroneal sinir üzerine yerleştirin. İmplant elektrotları subdermal olarak, yaklaşık 5-10 mm.
9. Uyarıcıda ayarlandığı gibi artan akım genliklerini kullanarak elektrot yerleşimini optimize edin. 100 mA'dan başlayın ve gerektiğinde artırın.
   NOT: En yüksek seğirme torku için genellikle 300-500 mA gereklidir.
10. Canlı veri görünümünde ve domuzun ön bölmesinde seğirme tork büyüklüğünü görselleştirin; toynaklar da süzülebilir ve yukarı doğru hareket edebilir.
11. Arka kompartmanın veya tibia sinirinin stimülasyon sırasında aktive edilmediğinden emin olun. Stimülasyon sırasında arka bölme kasılmasını ve toynakların aşağı doğru hareketini görsel olarak inceleyin ve palpe edin.
12. Tetanik kasılmanın plato bölgesini, canlı tork zamanı izlemesinden, antagonist kas alımı eksikliği (yani, bu protokol için plantarfleksiyon) eksikliği açısından aşağıdaki adımlarda inceleyin.
13. Aşağıdaki stimülasyon parametrelerini kullanarak maksimum izometrik tetanik tork ortaya çıkarın: Elektrot yerleştirme ve stimülasyon genlikleri optimize edildikten sonra, 100 Hz, 0.1 ms darbe genişliği, 800 ms tren¹⁷ üzerinde.
    NOT: Bu parametreler çeşitli kontraktil değerlendirmeler için kullanılabilir.

4. Tork-bağlantı açısı analizi için protokol

1. Maksimum izometrik tetanik torku, nötrden plantarfleksiyonun yakın uç aralıklarına veya 0-50 ° plantarfleksiyona kadar değişen bir dizi ayak bileği pozisyonunda ölçün.
   NOT: 10° artışların kullanılması altı kasılma gerektirecektir ve artımlı değişim belirli deneysel sorular için ayarlanabilir.
2. Derz açıları arasında hareket etmek için gonyometre aşamasının her iki kilitleme vidasını gevşetmeye başlayın. Bir sonraki büzülmeden önce her iki kilitleme vidasının da sıkıldığından emin olun.
   NOT: Gonyometre, hassas hizalamayı sağlamak için derece işaretleri ile işaretlenmiştir. Muhtemelen gonyometre üzerinde 180 ° ile dengelenen plantar fleksiyonun 0 ° 'sidir. Amaçlanan konumlandırmayı sağlamak için dikkatli olun.
3. Kasılmalar arasındaki süreyi deneysel olarak belirleyin; ancak, yorgunluğu önlemek için 2 dakika yeterlidir.
   NOT: Ayak bileği eklem açısı kademeli olarak değiştikçe, iğne elektrotları kayabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, elektrotların seğirme kasılmaları ile yerleştirildiğini doğrulamak gerekebilir (bkz. adım 3.8).

5. Tork-frekans analizi için protokol

1. Ayak bileğini istenen eklem açısına yerleştirin. Her seferinde aynı eklem açısında test yapmak için deneysel olarak dikkatli olun.
   NOT: Tipik olarak, tork-frekans analizleri, tork-mafsal açısı analizinden türetilen pik izometrik torka karşılık gelen tek bir bağlantı açısında gerçekleştirilir. Tepe torku ~ 30-35 ° plantarfleksiyonda üretilir.
2. Maksimum izometrik torku, tamamen kaynaşmış tetaniyi indükleyenlerin ötesinde ve ötesinde kaynaşmamış seğirme trenlerini indükleyen bir dizi stimülasyon frekansı üzerinden ölçün.
   NOT: Bu, yorgunluğu önlemek için her kasılma arasında 2 dakika ile 10, 20, 40, 60 ve 100 Hz'de (0,1 ms darbe genişliği; 800 ms tren) uyarılarak elde edilebilir. Tam deneysel sorulara ve belirli domuz modellerine bağlı olarak, frekanslar uyarlanabilir. Hücre içi ATP'yi korumak için 800 ms'lik bir kasılma sırasında kullanılan biyoenerjetik substrat büyük olasılıkla fosfokreatin^30'dur ve fosfokreatinin yeniden sentezi fosfokreatin mekiği^31'e dayanır. Fosfokreatin geri kazanım kinetiği, kasılma³⁰ bittikten sonra 90-120 s arasında% 90 veya daha fazla dikkat çekici bir iyileşme olduğunu gösterir. Bu nedenle kasılmalar arasında önerilen dinlenme aralıkları 90-120 sn'dir. Bununla birlikte, bu kas hastalığı, yaralanma ve / veya yaşlanma dahil olmak üzere deneysel tasarımlardan etkilenebilir.

6. Veri analizi

1. Analiz penceresini açmak için hala yazılımdaysa Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Alternatif olarak, Analiz programını doğrudan açın.
2. İster otomatik bir veri platformu ister manuel analiz kullanın, bireysel izometrik dalga formlarını analiz ederken farklı değişkenleri hesaplayın.
   NOT: Bu değişkenler şunları içerir: maksimum seğirme torku, maksimum tetanik tork ve seğirmeler ve tetani ile ilgili kasılma özellikleri, örneğin zirveye ulaşma süresi ve yarı gevşeme. Birçok deneysel değişken, vücut ağırlığı, MRG (manyetik rezonans görüntüleme) veya BT (bilgisayarlı tomografi) veya terminal kas ağırlığından belirlenen kas hacmi gibi kuvveti normalleştirebilir. Hem mutlak tork (N·m) hem de vücut kütlesine normalleştirilmiş tork (N·m/kg) sunulur. Ayak plakasına yerleştirilen dinlenme torku, deneyler arasında farklılık gösterecektir. Gerçek maksimum seğirme ve tetanik torkların kaydedildiğinden emin olmak için dinlenme torku için bir taban çizgisi düzeltmesi uygulanmalıdır. Her bağlantı açısındaki temel tork kaydedilir ve pasif torktaki değişiklikleri gösterebilir.

Sonuçlar

Domuzun ön bölmesinin in vivo test parametrelerinin güvenilirliği ve optimizasyonu daha önce bildirilmiştir²⁶. Tork frekansı için kemirgenler ve domuzlar arasında karşılaştırmalı veriler de bildirilmiştir²⁷.

İn vivo değerlendirme sırasında, uygun ön bölme aktivasyonunu sağlamak için tork dalga formunun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesi gerekir. Dalga formları sadece dorsifleksiyonu yansıtmalıdır. Dalga formları pürüzsüz, yuvarlak bir görünüme ve belirgin bir tetanik platoya sahip olmalıdır (Şekil 2A). Dalga formundaki tutarsızlıklar veya bozulmalar, yetersiz stimülasyon, yanlış elektrot yerleştirme veya yetersiz anestezi derinliği gibi çeşitli deneysel sınırlamaları gösterir (Şekil 2B).

Şekil 3A , %50 maksimum torku gösteren bir ok ile bir seğirme torku zamanı izlemesidir. Zirveye ulaşma süresi büzülmesi, uyarıcının başlangıcında başlamalı ve maksimum seğirme torku elde edildiğinde sona ermelidir (izlemenin altında temsili zaman çubukları gösterilmiştir). Bir seğirme için yarı gevşeme, maksimum seğirme torkunda başlamalı ve% 50 maksimum seğirme torkunda sona ermelidir (temsili zaman çubukları izlemenin altında gösterilmiştir). Şekil 3B , %50 maksimum torku gösteren bir ok ile tetanik bir tork zamanı izlemesidir. Kesin ve zamanında maksimum tork açısından ideal olan seğirmelerin aksine, tetanik kasılmalar, uyarıcının ne zaman başlayıp ne zaman bittiği ile ilgili maksimum tork zamanlamasında daha fazla değişkenliğe sahiptir ve kasılma özelliği analizine daha nüanslı bir yaklaşım gerektirir. Zirveye ulaşma süresi, uyarıcının başlatılmasıyla başlamalı ve maksimum torkun% 90 ila% 100'ü arasında bir yerde durmalıdır. Şekil 3B'deki zaman çubukları %95 maksimum tork kesimini göstermektedir. Bu, seçilen temsili veriler gibi durumlarda yararlıdır, çünkü maksimum torka plato fazının sonlarına kadar ulaşılmaz. Zirveye ulaşma süresinin tamamlayıcı bir analizi, ortalama kasılma oranıdır. Tork zamanı izlemenin yükselen uzuvlarındaki kesikli çubuklar, %30-%70 maksimum tork aralığını temsil eder. Ortalama büzülme hızı, stimülasyonun başlangıcında başlatılmalı ve %30-%70 maksimum tork arasındaki ortalama hız değişimini yakalamalıdır. Bunlar önerilen aralıklardır ve bireysel araştırma grupları ideal aralığı %50 civarında belirleyebilir (örneğin, ±%10). Önemli olan, çalışmalar içinde ve arasında tutarlı olmaktır. Seğirmenin aksine, tetanik büzülme yarı gevşeme, yukarıda belirtilen aynı nedenden dolayı maksimum tork yerine stimülasyonun sonunda başlamalıdır. Şekil 3B'deki zaman çubukları, stimülasyonun sona ermesi ile %50 gevşemeye ulaşması arasındaki süreyi temsil eder. Yarı gevşemenin tamamlayıcı bir analizi, ortalama gevşeme oranıdır. Tork izlemenin alçalan uzuvlarındaki kesikli çubuklar, yükselen uzuvla aynı %30-%70 maksimum tork aralığını temsil eder. Ortalama gevşeme oranı, stimülasyonun sonunda başlamalı ve %30-%70 maksimum tork arasındaki ortalama değişim oranını yakalamalıdır. Yine, bunlar önerilen aralıklardır. Kritik bir not: Ortalama kasılma/gevşeme oranını maksimum kasılma/gevşeme oranıyla karıştırmayın. Maksimum hız, iki bitişik veri noktası arasındaki en dikkat çekici tek oran değişimini temsil eder ve geniş ölçüde değişken olabilir.

İskelet kaslarının lif tipi ve uyarılma-kasılma kuplajları hakkında fikir edinmek için çeşitli seğirme ve kasılma özellikleri analiz edilebilir ^10,32. Seğirme ve kasılma özelliklerinin aşırı yorumlanması konusunda uyarılır; daha fazla hücresel düzeyde sorgulama için önerileri ve gerekçeleri temsil ederler ve mutlaka gösterge niteliğinde değildirler. Genel olarak, kontraktilite oranları sarkoplazmik retikulum kalsiyum salınımını ve miyozin ağır zincir izoform enzimatik hızını yansıtabilir. Buna karşılık, gevşeme oranları sarko (endo) plazmik retikulum kalsiyum ATPaz enzim hızını ve izoformu yansıtabilir. Bu özellikler yorgunluk, kas hasarı, egzersiz eğitimi ve çok sayıda patolojiden (örneğin, kullanılmama atrofisi) etkilenebilir.

Şekil 4, yaralanmamış uzuvlar için tork-frekans ve tork-eklem açısı ilişkileri için temsili değerleri göstermektedir. Bu veriler çok çeşitli domuz boyutlarını temsil etmektedir.

İn vivo kas analizi sırasında yüzey EMG'sinin temsili, deneysel bir analizi, hız kodlamasının ve toplam kas aktivitesinin deneysel kontrolünü göstermek için yapılmıştır (Şekil 5). Yapışkan EMG elektrotları peroneus tertiusun orta karnına yerleştirildi. Stimülasyon artefaktını en aza indirmek için diz üzerine bir toprak elektrodu yerleştirildi ve stimülasyon elektrodu iğneleri kas lokalizasyonuna proksimal peroneal sinir etrafına yerleştirildi. Eşzamanlı tork ve EMG kayıtları 20, 60 ve 100 Hz stimülasyon frekanslarında yapıldı. Stimülatör darbelerinin sayısı (Şekil 5'teki kırmızı çubuklar), stimülasyon süresinin ve darbeler arasındaki sürenin bölümünü yansıtır. Örneğin, 20 Hz stimülasyon frekansı, her 50 ms'de bir nabız anlamına gelir; bu nedenle, darbeler arasında 50 ms'ye bölünen 400 ms stimülasyon süresi, verilen sekiz darbeye eşittir (Şekil 5A). Stimülatör darbeleri, perkütan iğne elektrodu yerleştirilmesi yoluyla sinir aksonuna iletilir ve benzer sayıda elektriksel kas darbesi üretir (yani, 20 Hz, 8 EMG kaydına eşittir), bu da ilgili kas grubunun aksiyon potansiyeli frekansının deneysel kontrolünü gösterir. Ham EMG kayıtları, toplam kas aktivitesini artan stimülasyon frekansı ile görselleştirmek için kök-ortalama-kare analizi (EMG RMS) ile dönüştürülebilir. Eğri (AUC) analizinin altındaki alan, tüm kas aktivitesindeki değişiklikleri belirlemek için EMG RMS'yi ölçmenin bir yoludur. Her EMG RMS stimülasyon frekansı için temsili AUC'ler verilmiştir (Şekil 5A-C).

Şekil 2: Temsili yüksek ve düşük kaliteli dalga formları. (A) İzometrik dalga formları, dikkate değer bir akışkan platosu ile kare dalga görünümünde bulunur. (B) Düşük kaliteli dalga formları, yetersiz stimülasyon veya yanlış elektrot yerleşiminden kaynaklanabilir. Bu gibi durumlarda, elektrotların yeniden konumlandırılması gerekir. Hem A hem de B için, uyarıcı darbeleri (kırmızı çubuklar) belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Twitch ve tetanik kontraktil özellik analizi. (A) Temsili seğirme (1 Hz) ve (B) tetanik (100 Hz) tork-zaman izlemeleri, kasılma özelliklerini detaylandırmak için değiştirilir. Her grafikteki kırmızı ok %50 maksimum tork gösterir. İzlemelerin altındaki mavi ve siyah çubuklar sırasıyla zirveye ulaşma süresini ve yarı gevşeme süresini gösterir. Tetanik tork zamanı izlemenin yükselen ve alçalan uzuvlarındaki kesikli çubuklar, ortalama büzülme veya gevşeme oranını belirlemek için kullanılabilecek% 30 -% 70 maksimum tork aralığını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tork-bağlantı açısı ve tork-frekans örnek verileri. Sağlanan veriler, 2.9-6.3 ayda bir dizi dişi Yorkshire Cross domuzundan alınmıştır; 39.4-75.4 kg vücut kütlesi; hepsi değerlendirme zamanında sağlıklı kontrol olarak kabul edilir. Tüm testler sırasında, çekirdek vücut ısısı 37 ° C'de tutuldu. (A) Vücut kütlesine normalize edilen tork, 0-50 ° plantarfleksiyonun ayak bileği eklemlerinde değerlendirilir; tepe torkunun 30°'de belirlendiğine dikkat edin. (B) Vücut kütlesine normalize edilen tork, 10-100 Hz arasındaki çeşitli stimülasyon frekanslarında değerlendirilir; Bu değerlendirmelerin ayak bileği eklemi ile 30 ° plantarfleksiyonda yapıldığını unutmayın. (C) Stimülasyon frekanslarının her biri için ayrı ayrı tork izlemeleri değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Eşzamanlı in vivo izometrik tork ve EMG ölçümleri. Bir dişi Yorkshire domuzundan (~ 90 kg vücut kütlesi) toplanan (A) 20, (B) 60 ve (C) 100 Hz'lik temsili stimülasyon frekanslarında eşzamanlı EMG ve tork kayıtları. Stimülatör darbeleri (kırmızı çubuklar) ayarlanan stimülasyon frekansına göre verildi. Ham EMG kayıtları, artan stimülasyon sıklığı ile toplam kas aktivitesini görselleştirmek için kök-ortalama-kareye (EMG RMS) dönüştürüldü. Eğrinin altındaki alan (AUC) için temsili EMG RMS eğrileri analiz edildi ve her stimülasyon frekansı için AUC'ler sağlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Kritik adımlar, değişiklikler ve sorun giderme
Veri değişkenliğini en aza indirmek ve yaklaşımın başarısını en üst düzeye çıkarmak için aşağıdaki kritik adımlar vurgulanmıştır.

Optimal sinir stimülasyonu
Bu deneysel yaklaşım sinir akson depolarizasyonu ile başlar ve doğru elektrot yerleşimine ve optimize edilmiş elektriksel stimülasyona dayanır. Boney işaretleriyle ilgili sinir anatomisinin ölüm sonrası analizi, test sırasında uygun elektrot yerleşimini görselleştirmeye yardımcı olabilir. Maksimum seğirme torku elde etmek, sinir aksonuna iletilen uygun akımı (miliamper cinsinden; mA) belirlemeye yardımcı olur. Testin başlangıcında sinir stimülasyonunu optimize ederken akılda tutulması gereken iki değer vardır: (1) seğirme-tetanik oran ~1: 5'tir, örneğin, ~2 N · m seğirme torku 10 N · m tetanik torka karşılık gelir (Şekil 3); ve (2) vücut kütlesine tipik tork, kg vücut kütlesi başına ~ 0.3 N · m'dir (Şekil 4). Tepe seğirme torkları düşük görünüyorsa, elektrotları çıkarın ve başka bir yerleştirme deneyin. Stimülatör ayarlarını, BNC bağlantılarını ve elektrot bağlantılarını kontrol ettiğinizden emin olun. Yukarıda belirtildiği gibi, uzuvun eklem açıları arasında konumlandırılması sırasında çok fazla hareket varsa, kasılmalar arasında elektrot yeniden yerleştirilmesi gerekebilir (Şekil 2). Deneysel ve girişimsel yaklaşımların bu değerleri etkileyebileceğini lütfen unutmayın.

Uygun biyomekanik hizalama
Kas uzunluğunun başlaması kas kontraktil kuvvetini (uzunluk-gerginlik ilişkisi) etkiler ve kas uzunluğu kalça, diz ve ayak bileği eklem hizalamasına bağlı olarak değişebilir. Eklem açıları uzuvlar arasında ve domuzlar arasında standartlaştırılmalıdır. Kalça ve diz için 90° ayak bileği eklem açısı şiddetle tavsiye edilir. Hafif plantarfleks ayak bileği pozisyonu (nötr 0° ayak bileği eklem açısından ~ 30°) tepe kuvveti için idealdir. Ayakta dururken hem domuzlarda hem de köpeklerde ayak bileği ekleminin doğal anatomik pozisyonunu yansıtır. Tüm bağlantılar, dikey bir tork vektörünün katkısı nedeniyle ölçülebilir tork kaybını önlemek için ayak pedalı ve tork dönüştürücüleri ile paralel olmalıdır. Kalça-diz-ayak bileği eklem açılarının ve ayak-pedal-eklem hizalamasının incelenmesi, ayağın ayak pedalına sabitlenmesinden ve diz ekleminin uzuv sıkma çubuklarıyla sabitlenmesinden sonra şiddetle tavsiye edilir (Şekil 1). Yanlış hizalama varsa, çubukların kilidini açıp çıkarın ve domuzu ameliyat masasında yeniden konumlandırın. Çalışmalar arasında eklem açılarını standartlaştırmak, veri varyansını en aza indirmek için kritik öneme sahip olsa da, aşağıda tartışılan, dikkate değer biyomekanik hizalamada sınırlamalar vardır.

Mevcut veya alternatif yöntemlere göre önemi
Domuz modelleri için kullanılabilecek klinik olarak ilgili ve invaziv olmayan kas fonksiyonu değerlendirmelerinin alternatif örnekleri arasında koşu bandı yürüme mesafesi, EMG ve aktif kas kesme dalgası elektrografisi bulunmaktadır. İnsanlarda 6 dakikalık yürüme testi olarak, bir koşu bandı yürüyüş testi, büyük hayvanlarda hastalığın ilerlemesini ve müdahale başarısını değerlendirebilir^33,34,35. Tipik olarak, bir alışma döneminden sonra, hayvanlar farklı koşu bandı hızlarında ve / veya eğim seviyelerinde uyumun sonuna kadar yürür. Maksimum motivasyona ulaşmak için yiyecek ödülleri genellikle gereklidir. Bununla birlikte, koşu bandı yürüme sonuçları, denek motivasyonu, maksimal olmayan motor ünite alımı ve kardiyovasküler, iskelet ve solunum sistemleri gibi diğer vücut sistemlerine doğal bağımlılık gibi sınırlamalar nedeniyle kas kontraktil fonksiyonunun yalnızca dolaylı yorumlarını sunar.

Öte yandan, EMG elektrotları doğrudan ilgilenilen kas grubuna yerleştirildiği için EMG iskelet kası sisteminin biraz daha iyi bir doğrudan değerlendirmesini sunar^36,37,38. EMG elektrotları daha sonra kolektif kas aktivitesini ölçer (depolarize kas lifleri). Bu kas aktivitesi, motor ünite işe alımına ve oran kodlamasına (işe alınan motor birimlere gönderilen aksiyon potansiyellerinin sıklığı) dayanır. Bununla birlikte, motor ünite işe alımının göreceli katkılarını oran kodlamasına karşı ayırmak, yüzey EMG ile imkansızdır. Ayrıca, EMG, maksimum kasılmalar üretmek için özne istekliliğine dayanır ve bu işbirliği seviyesi büyük hayvan modellerinde olası değildir. Yürüme döngüsü sırasında EMG'deki değişiklikleri değerlendirmek bilgilendirici olsa da, bu veriler ilgilenilen iskelet kası grubunun maksimum fonksiyonel yeteneğini temsil etmemektedir. B-mod ve kesme dalgası elastografisi kullanan ultrason tabanlı görüntüleme, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan bir başka non-invaziv modalitedir. Elastografi ile ölçülen Young modülü ile artan kas yükleri^39,40 arasında iyi bir korelasyon vardır. Kesme dalgası elastografisi doğrulanmıştır ve domuz volümetrik kas kaybı hasarı modeli ²³ de dahil olmak üzere pasif doku sertliğinin kantitatif bir ölçüsü olarak^{41,42,43,44,45} olarak kullanılmıştır. Aktif kas kuvveti üretiminin dolaylı bir ölçümü olarak da kullanılabilir³⁹. Bununla birlikte, konstrüksiyonları gerçekleştirmek için özne istekliliği ve işbirliği için EMG'ye benzer sınırlamalar hala mevcuttur.

Burada açıklanan in vivo protokol, koşu bandı yürüme mesafesi ve EMG'nin aksine, kas fonksiyonunun güvenilir, tekrarlanabilir ve maksimum bir değerlendirmesini sağlar. Bu protokol, kas kasılmalarını motivasyondan bağımsız, kontrollü, ölçülebilir bir şekilde uyandırır. Spesifik olarak, perkütan elektrotlar, merkezi sinir sistemini atlayan sinir aksonlarını uyarmak için kullanılır. Sinir aksonlarının depolarizasyonu, motor ünite alımı ile ilişkili değişkenliği ortadan kaldırarak tüm motor ünitelerini meşgul eder. Ek olarak, araştırmacı hız kodlamasını (stimülasyon frekansı) kontrol eder. Bu yaklaşım için geçerli olan nöromüsküler fizyoloji, Ranvier'in düğümlerinde voltaj kapılı sodyum kanal aktivasyonu ile başlar. Uyarılma-kasılma bağlantısı ve çapraz köprü bisikleti dahil olmak üzere tüm sonraki (veya aşağı akış) fizyoloji devreye girer. İn vivo non-invaziv kas analizinin önemli bir avantajı, kontraktil kas fonksiyonunun, örneğin yaralanma, müdahale veya bir hastalık ilerlemesi sonrası kas gücünü izlemek için haftalık olarak tekrar tekrar ölçülebilmesidir.

Yöntemin sınırlamaları
Bu protokolde açıklanan in vivo ekipman, eklem açısı ve stimülasyon frekansının bir fonksiyonu olarak pasif ve aktif izometrik torka izin verir. Kullanılan test cihazı, dinamik kasılmaların (örneğin, izokinetik eksantrik veya konsantrik kasılmalar) ölçülmesini desteklemez. Aparat tork-mafsal açısı ilişkisini karakterize etmek için 105° hareket aralığına izin verir ve maksimum tork aralığı ~50 N·m olan bir yük hücresi kullanır. Belirli deneysel sorular, bu spesifikasyonların dışındaki performans özelliklerini gerektirebilir. Özellikle, bu tarif edilen aparat üzerindeki yük hücresi, gerekirse daha büyük tork aralıkları ile değiştirilebilir.

İn vivo maksimum nöromüsküler gücü ölçmek için burada açıklanan protokolün dikkate değer sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu yöntem, hayvan tesisi protokollerine ve kaynaklarına göre farklı şekilde yürütülebilen anestezi gerektirir. Anesteziklerin nöromüsküler fonksiyon üzerinde farklı etkileri olduğu bilinmektedir ve fare in vivo dorsifleksör tork üretimini anestezik tip ve doza bağımlı bir şekilde değiştirdiği gösterilmiştir²⁹. Anesteziklerin büyük hayvan in vivo torku üzerindeki diferansiyel etkileri belirsizdir; bu nedenle, kontrol ve deney grupları bu değişkenliği kontrol etmek için aynı anestezi ajanlarına (örneğin, ketamin uygulanan tüm gruplara) sahip olmalıdır. İkincisi, in vivo difüzyon paternlerine güvenmek, kontraktil disfonksiyonun hücresel mekanizmalarının ve akut ilaç toksisitelerinin araştırılmasını sınırlar. Örneğin, kafein, sarkoplazmik retikulum kalsiyum salınımını uyarmak için izole bir kasın in vitro organ banyosu testi sırasında, uyarılma-kasılma kuplajını doğrudan atlayarak kullanılabilir. Bu etkiyi indükleyen kafein miktarı (mM) in vivo bir ortamda öldürücüdür. Tüm vücut üzerindeki ilaç etkileri (örneğin, böbrek / karaciğer stresi) ve dolaşıma salgılanan müteakip faktörler, bu yaklaşımın akut kas kuvveti²³ üzerinde ilaç taraması için kullanılması durumunda dikkate alınması gerekecektir. Üçüncüsü, maksimal elektriksel sinir stimülasyonunun kullanımı, yukarıda tartışıldığı gibi, gönüllü işe alım stratejilerinden sapmaktadır ve bu nedenle nöromüsküler işe alım adaptasyonlarından kaynaklanabilecek güç değişikliklerini yansıtmamaktadır.

İn vivo tork ölçümleri, deneysel gözlemler için belirli bir mekanizma oluşturma konusunda da sınırlı olabilir. Örneğin, ayak bileği eklemi hakkındaki tork sadece kas kuvveti üretimine değil, aynı zamanda tendon ve eklem ve bağ dokusu özelliklerine de bağlıdır. Dahası, kuvvet kas grupları, özellikle plantar fleksörler (gastroknemius, soleus ve plantaris kasları) ve domuzlardaki dorsifleksörler (peroneus tertius, tibialis ve digitorum kasları) tarafından üretilir. Bu nedenle, maksimum in vivo tork verilerinin yorumlanması, potansiyel kas-iskelet ve anatomik değişikliklerin dikkate alınmasını gerektirir ve bireysel kaslarla değil, kas gruplarıyla sınırlıdır. Buna bağlı olarak, kas grupları genellikle plantar fleksörlerin gastroknemius ve soleus kası gibi ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş kas liflerinin bir karışımından oluşur. Kasılma ve gevşeme hızı (veya zirveye ulaşma süresi ve yarı gevşeme süresi) gibi kasılma özellikleri, in vitro veya in situ test protokolleri⁴⁷ gibi izole kas preparatlarına karşı in vivo kullanan lif tipi fizyolojinin güvenilir göstergeleri değildir. İzole kas preparatları, biyomekanik parametrelerin kas fonksiyonu üzerindeki etkisini anlamada da üstündür, çünkü kas uzunluğu gibi özellikler hassas bir şekilde kontrol edilebilir; eklem açısı-tork ilişkisinin kas uzunluğu-kuvvet ilişkisine doğrudan eşdeğer olmadığını vurgulamak önemlidir, çünkü tork üretimine katkıda bulunan tendon (örneğin, gevşeklik), kas (örneğin, pennasyon açısı, sarkomer örtüşmesi) ve eklem (örneğin, moment kolu) özellikleri eklem açısına bağlıdır. Bu amaçla, büyük hayvan in situ fonksiyonel testi 48, in situ testin bir terminal^deneyi olduğunu akılda tutarak, in vivo teste değerli bir katkı olabilir. Deneysel bulguların mekanik anlayışını geliştirmek için gelecekte araştırılabilecek mevcut protokoldeki diğer ilerlemeler arasında kas ve tendon mimari özelliklerini ölçmek için ultrason B modu görüntülemenin kullanılması ve gönüllü ve elektriksel olarak uyarılan kasılmalar sırasında kas kuvvetini ölçmek için bir tendon kuvvet dönüştürücüsünün implantasyonu^{yer almaktadır 49}.

Yöntemin önemi ve potansiyel uygulamaları
Bu protokol, domuz dorsifleksör kas grubunun in vivo tork üretme kapasitesini değerlendirir ve fizyolojik bir ortamda kas fonksiyonunun kazanımını veya kaybını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yöntem gösterir. Metodoloji domuz için terminal olmadığından, bir hastalığın ilerlemesi sırasında veya bir tedavi stratejisinden önce, sırasında ve sonrasında aynı deneklerdeki kas fonksiyonunu uzunlamasına değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, tekrarlanan bir önlem deneysel tasarımı, bağımsız ölçümlere kıyasla daha fazla güç ve daha az hayvanla sağlam istatistiksel karşılaştırmalara izin verebilir. Ek olarak, iskelet kası disfonksiyonu, kronik hastalıkla ilişkili kas israfı (örneğin, kalp yetmezliği, böbrek yetmezliği, AIDS, kanser, vb.), Kas distrofisi, nörodejeneratif hastalıklar (örneğin, SMA veya amiyotrofik lateral skleroz; ALS), yaşlanma (yani sarkopeni) ve ilaç toksisiteleri. İskelet kası fonksiyonel kapasitesi, egzersiz, beslenme, ilaç ve rejeneratif tıp tedavileri gibi girişimler için kritik bir birincil sonuç ölçüsüdür. Bu nedenle, domuz torku üretim kapasitesini in vivo olarak güvenilir bir şekilde değerlendirmek için burada açıklanan protokol, çok sayıda çalışma uygulamasında kullanılabilir. Gelişmekte olan tedavilerin çevirisi için kapsamlı hayvan verilerinin elde edilmesinde etkili olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite	Aurora Scientific Inc.	615A	Compatible Win Vista/7/10
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus	Aurora Scientific Inc.	892A	Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners
Calibration Weights	Ohaus or similar	80850116
Computer	Aurora Scientific or any vendor	601A	Computer must include data acquisition card and interface for software
Gauze pad	Various vendors		4 by 4 squares or similar
Monopolar Needle Electrodes	Chalgren, Electrode Store,  or similar vendor	242-550-24TP, or DTM-2.00SAF
Non-adhesive Flexiable Tape	3M, Coflex, or similar		4 inch by 5 yard role
Stimulator	Aurora Scientific or comparable	701C	Must include constant current stimulation mode