将小鼠成纤维细胞直接重编程为黑素细胞

摘要

在这里，我们描述了一种针对黑素细胞的优化直接重编程系统和一种高效、浓缩的病毒包装系统，可确保顺利的直接重编程。

摘要

黑素细胞功能的丧失导致白癜风，严重影响受影响个体的身心健康。目前，白癜风没有有效的长期治疗。因此，必须开发一种方便有效的白癜风治疗方法。将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞的再生医学技术似乎是一种有前途的白癜风新疗法。这涉及将患者的皮肤细胞直接重编程为功能性黑素细胞，以帮助改善白癜风患者黑素细胞的丢失。然而，这种方法需要首先在小鼠身上进行测试。虽然直接重编程被广泛使用，但没有明确的方案可以直接重编程为黑素细胞。此外，可用转录因子的数量是压倒性的。

在这里，提出了一种浓缩的慢病毒包装系统方案，以产生用于将皮肤细胞重编程为黑素细胞的转录因子，包括Sox10，Mitf，Pax3，Sox2，Sox9和Snai2。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）感染了所有这些转录因子的浓缩慢病毒，用于 在体外将MEF直接重编程为诱导黑素细胞（iMels）。此外，筛选了这些转录因子，并优化了系统以直接重编程为黑素细胞。iMels中黑色素特征标记物在基因或蛋白质水平上的表达显著增加。这些结果表明，将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞可能是白癜风的成功新治疗策略，并证实了黑素细胞发育的机制，这将为成纤维细胞在 体内进一步直接重编程为黑素细胞提供基础。

引言

白癜风是一种皮肤病，严重影响受影响个体的身心健康。由于代谢异常，氧化应激，炎症介质的产生，细胞脱离和自身免疫反应等各种原因，功能性黑素细胞丢失，黑色素分泌停止，导致白癜风^1，2的发展。这种情况发生得很广泛，在脸上尤其成问题。主要治疗方法是全身使用皮质类固醇和免疫调节剂。光疗可用于全身性或局部性疾病，并且有手术治疗，如穿孔皮肤移植和自体黑素细胞移植^3，4，5。然而，使用药物治疗和光疗的患者容易复发，这些治疗的长期治疗效果较差。手术治疗是创伤性的，只有中等效果^2，6。因此，白癜风需要一种新的有效治疗策略。

诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程将这些细胞从其终末状态逆转为多能状态，这是由转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc⁷介导的过程。然而，由于致瘤的可能性和较长的生产时间，该技术在应用于^{临床环境8}时遭到了怀疑。直接重编程是一种技术，它使一种类型的终端单元转换为另一种类型的终端单元⁹。该过程是通过合适的转录因子实现的。各种细胞已经直接成功重编程，包括心肌细胞¹⁰，神经元¹¹和耳蜗毛细胞¹²。一些研究人员甚至直接 原位重新编程皮肤组织，可用于伤口修复¹³。直接重编程的优点包括减少等待时间和成本，降低癌症风险，减少伦理问题，以及更好地了解细胞命运决定的潜在机制⁹。

虽然直接重编程法被广泛使用，但目前还没有确定的方法可以将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞，特别是因为需要考虑许多转录因子^14，15。转录因子Mitf，Sox10和Pax3已被用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞¹⁴。相比之下，在另一项研究¹⁵中，MITF，PAX3，SOX2和SOX9的组合也被用于将皮肤细胞直接重编程为人类黑素细胞。在该协议中，尽管使用了不同的筛选方法，但使用Mitf，Sox10和Pax3的组合获得了相同的结果，用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞，如前所述¹⁴。开发一种从其他皮肤细胞产生黑素细胞的系统可以提供将白癜风患者的其他皮肤细胞转化为黑素细胞的方案。因此，构建一种简单有效的方法对于这种直接重编程以成功产生黑素细胞至关重要。

研究方案

这项工作得到了江苏大学实验动物管理和使用委员会（UJS-IACUC-AP--20190305010）的批准。实验严格按照国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC International）制定的标准进行。没有涉及人类的实验，因此这项工作不需要人类研究伦理委员会的批准。有关试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 构建转录因子浓缩慢病毒包装系统

1. 浓缩病毒的产生（图1A，B）
   1. 将1.5×10⁶个HEK-293T细胞放入60mm培养皿中，并在37°C下用5%CO₂加湿培养箱中用正常培养基（参见表1）培养这些细胞。
      注意:如果病毒需要分批包装，可以使用100mm细胞培养皿（有关详细信息，请参阅 表2）。
   2. 24小时后，确保HEK-293T细胞在转导当天达到80-90%汇合，并用3.5mL DMEM（每1 cm 2150μLDMEM）替换培养基。将细胞在37°C下置于加湿的培养箱中，用5%CO₂培养2小时。
      注意:替代培养基必须不含血清，以便细胞可以"饥饿"以获得更好的质粒转染。
   3. 制备含有3μgMitf，Sox10，Pax3，Sox2，Sox9或Snai2的目标质粒的质粒（混合物A）的混合物;1μg包装质粒PMD2。G，和2μg的包装质粒PSPAX2。用无血清DMEM组成混合物A至150μL的体积。通过加入12μL转染试剂（体积是所有质粒总质量的两倍）来制备转染试剂的混合物（混合物B），并用无血清DMEM将混合物B的体积组成为150μL。
      注意:在准备混合物时，重要的是要缓慢添加液体以避免气泡。
   4. 混合混合物A并在室温下静置5分钟后混合B。将混合物在室温下孵育20-30分钟以形成转染复合物。
   5. 将HEK-293T细胞从培养箱中取出，用DMEM + 2%FBS替换培养基，滴加步骤1.1.4中的混合物，轻轻混合液体。
   6. 8小时后，用3.5mL正常培养基更换培养基。更换培养基后，每24小时和48小时收集一次病毒上清液。
   7. 混合在两个不同时间点收集的病毒上清液。在4°C下以200× g 离心5分钟。 将上清液通过0.45μm过滤器，并将其收集在50mL无菌锥形管中。
      注意:在24小时收集的病毒可以储存在4°C下，并与在48小时收集的病毒混合。
   8. 通过在4°C下以6000× g 离心过夜（〜16小时）浓缩病毒上清液。确保离心后锥形管底部的病毒沉淀可见。
   9. 慢慢倒出上清液。将病毒沉淀溶解在正常培养基的体积中，该体积是病毒上清液体积的1/¹⁰⁰ 。使用P1000微量移液管，轻轻地上下移液，直到获得均匀的混合物。根据需要将浓缩的病毒分成微量离心管。储存在−80°C。
      注意:使用此方法，病毒的浓度为 100 倍。浓缩病毒（100x）可以在-80°C下储存>1年。 避免病毒反复冷冻和解冻。
2. 检测浓缩病毒滴度（图1C）
   1. 平板1×10⁵ 个HEK-293T细胞放入6孔板的一个孔中。记得添加一个井作为阴性对照。在37°C下用正常培养基在加湿的培养箱中用5%CO₂培养这些细胞。
   2. 24小时后向每个孔中加入0.1μL或0.2μL荧光浓缩病毒（100x），并向每个孔中加入4ng / μL阳离子聚合物转染试剂。感染后约8-12小时，用普通培养基替换培养基。
      注:为保证荧光检测的准确性和效率，感染率必须为10-30%。加入0.1 μL或0.2 μL荧光浓缩病毒可将感染效率维持在此范围内。浓缩病毒滴度至少可以达到 1 × 10⁸ 转导单位 （TU）/mL。
   3. 感染后约48小时，用1mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养皿以除去死细胞。
   4. 在室温下，使用每孔250μL0.05%胰蛋白酶-EDTA在6孔板中胰蛋白酶消化这些细胞1分钟。在4°C下以200× g 离心5分钟，然后除去上清液。
   5. 将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，将悬浮液加入5 mL聚苯乙烯圆底管中，并使用流式细胞术检测病毒荧光（绿色荧光蛋白，GFP ⁺）的感染效率。
   6. 使用以下公式计算浓缩病毒滴度:10⁵ （细胞体积）×感染率（GFP ⁺%）/添加病毒体积（0.1μL或0.2μL）。

2.将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞（图2A）

1. 在室温下用1mL 0.1%明胶溶液涂覆一孔6孔细胞培养板15-30分钟。确保孔完全覆盖0.1%明胶溶液。包衣后吸出0.1%明胶溶液。
   注意:准备0.1%明胶溶液（100 mL），如下所示:将0.1g明胶粉溶解在高压灭菌玻璃瓶中的100mL超纯水中，然后在4°C下储存不超过2个月。
2. 板5×10⁴ 个MEF放入涂有0.1%明胶的6孔板的一个孔中（如步骤2.1所示），并在37°C下用正常培养基培养这些细胞在加湿的培养箱中用5%CO₂ 过夜。
3. 24小时后，确认MEF已达到40-50%汇合。将培养基更换为普通培养基。
4. 在第0天，从冰箱中取出浓缩的病毒，并在冰上融化病毒。使用等式 （1） 计算要添加的病毒的体积。根据计算的体积，将六种转录因子Mitf，Pax3，Sox10，Sox9，Sox2和Snai2（见 材料表）的浓缩病毒加入每个孔中，然后加入4μg/ mL的阳离子聚合物转染剂。
   细胞数（5×10⁴）×30（感染的多重性，MOI）/病毒滴度（1）
5. 在感染后的第1天，8-12小时，除去含有病毒的培养基并用新鲜的正常培养基替换，同时加入0.5μg/ mL嘌呤霉素以筛选稳定的感染细胞系。
6. 在感染后第2天，48小时，用重编程培养基逐渐替换上清液培养基。首先，改变总培养基^体积的1 /4，并加入3μM CHIR99021。
7. 从第3天到第7天，根据细胞的状况，通过逐渐更换更高比例的重编程培养基（见 表1）来更换培养基，并在5天内切换到完全重编程培养基。
   注意:在此期间，必须每天使用嘌呤霉素和CHIR99021。许多死细胞将在改变重编程培养基的第一天和第二天出现。这是正常的，因为细胞逐渐适应转化。因此，需要逐渐改变培养基，以确保细胞的健康增殖。
8. 为了传代细胞，加入500μL0.05%胰蛋白酶- EDTA以在室温下消化细胞3分钟。当~60%的细胞漂浮起来时，通过添加2倍于消化酶体积的正常培养基来停止消化。将细胞悬浮液收集在15mL无菌锥形管中，在4°C下以200× g 离心5分钟，除去上清液，用重编程培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以3×10⁴ / cm²的密度置入60mm无菌培养皿中。在37°C下在加湿的5%CO₂ 培养箱中培养这些细胞。
   注意:从第8天到第21天，这些细胞每3-5天进行一次亚培养，并在60毫米无菌培养皿中培养以扩增。它们可以被培养到至少达到第5段。

3. 优化直接重编程和识别

1. 筛选优化的转录因子
   1. 重复步骤2.1-2.7，每次减少六种转录因子中的一种。用五种转录因子组合的病毒感染MEF。
   2. 感染后7天，提取这些细胞¹⁶的RNA，并使用逆转录PCR（RT-PCR）¹⁷ 分析其黑素细胞基因的表达水平，通过逐个去除它们来筛选对转化为黑素细胞影响最大的转录因子（图3A）。
   3. 使用影响向黑素细胞转化以感染MEF的前三个转录因子。重复步骤 2.1-2.7。
      注意:感染后七天，黑素细胞基因应该在这些转化的细胞中可检测到（图3B）。用于iMels表征的引物信息包含在 表3中。
2. 鉴定诱导黑素细胞（iMels）
   1. 使用免疫荧光染色¹⁸ 验证iMels表达黑素细胞蛋白，包括TYRP-1和DCT（图4A）。
   2. 黑色素特异性3，4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）染色（图4B）
      1. 制备4%多聚甲醛（10mL），如下所示:将0.4g多聚甲醛粉末溶解在10mL PBS中。将溶液置于56°C的烘箱中2小时以促进溶解。
         注意:溶液可以在4°C下保存不超过一个月。
      2. 在30毫米的培养皿中培养iMels，并用预热的PBS清洗两次。加入1mL4%多聚甲醛固定细胞20分钟，并用PBS洗涤培养皿3次。
      3. 使用前将0.01克L-DOPA粉末溶解在10毫升PBS中，制备0.1%DOPA染色溶液（10毫升）。将溶液置于37°C的水浴中30分钟;摇晃几次以促进溶解。
      4. 加入1mL新鲜制备的0.1%DOPA染色溶液。在37°C的烘箱中孵育2-5小时。如果没有棕黑色颗粒，继续在37°C下孵育2小时，但不进行>5小时。每30分钟检查一次样品。
      5. 用PBS清洗盘子3次，每次1分钟。用1mL苏木精染色溶液染色细胞核2分钟。
      6. 对于长期储存，使用95%乙醇使样品脱水3分钟，然后使用100%乙醇脱水5分钟。用二甲苯和中性香脂密封盘子。
   3. 黑色素特异性马森-丰塔纳染色（图4B）
      1. 将iMels放入30mm培养皿中，并用4%多聚甲醛固定细胞20分钟;用PBS将盘子洗3次。
      2. 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液A（氨银溶液）（参见 材料表），将培养皿置于暗箱中，并将暗箱置于56°C的烤箱中15-40分钟。
         注意:如果在烘箱中15分钟后不可见棕黑色颗粒，请将样品放回56°C烘箱中继续孵育，但不要孵育>40分钟。可以在暗箱中加入一些水以防止干燥。
      3. 吸取溶液A并用蒸馏水洗涤培养皿5-6次，每次1-2分钟。
      4. 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液B（低溶液），并将培养皿在室温下放置3-5分钟。
      5. 吸出溶液B，用自来水洗碗3次，每次1分钟。
      6. 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液C（中性红色染料），并将培养皿在室温下放置3-5分钟。
      7. 吸取溶液C并用蒸馏水洗涤培养皿3次，每次1分钟。
      8. 加入1mL100%乙醇进行快速脱水，3分钟后吸出乙醇。
         注意:用二甲苯和中性香脂密封后，染色的样品可以储存很长时间。

结果

本文包括浓缩慢病毒包装系统的方案，用于生产转录因子慢病毒，用于将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞，以及用于筛选转录因子和直接从MEF重编程黑素细胞的方案。

通过观察GFP的荧光强度（图1A）或流式细胞术（图1B）在用未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染HEK-293T细胞48小时后，评估浓缩慢病毒生产的成功。浓缩病毒...

讨论

病毒的质量对于该方案中直接重编程为黑素细胞的成功至关重要。该方案中病毒的包装和浓缩方法简单易重复，不依赖任何其他辅助浓缩试剂。在大多数实验室中可以成功遵循该方案。为保证浓缩病毒的质量，以下几点需要特别注意。一个是HEK-293T的电池状态。虽然HEK-293T细胞是永生化细胞，但用于制造浓缩病毒的细胞必须是10次传代内的健康细胞（滴度随着传代次数的增加而降低）。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT