Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Özet

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Özet

Melanositlerin fonksiyon kaybı, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen vitiligoya yol açar. Halen, vitiligo için etkili bir uzun süreli tedavi yoktur. Bu nedenle, vitiligo için uygun ve etkili bir tedavi geliştirmek zorunludur. Cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için rejeneratif tıp teknolojisi, vitiligo'nun umut verici yeni bir tedavisi gibi görünmektedir. Bu, vitiligolu hastalarda melanosit kaybını iyileştirmeye yardımcı olmak için hastanın cilt hücrelerinin fonksiyonel melanositlere doğrudan yeniden programlanmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemin önce fareler üzerinde test edilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama yaygın olarak kullanılmasına rağmen, melanositlere doğrudan yeniden programlama için net bir protokol yoktur. Dahası, mevcut transkripsiyon faktörlerinin sayısı çok fazladır.

Burada, cilt hücrelerini melanositlere yeniden programlamak için seçilen transkripsiyon faktörlerini üretmek için Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ve Snai2 dahil olmak üzere konsantre bir lentivirüs paketleme sistemi protokolü sunulmaktadır. Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), MEF'lerin in vitro olarak indüklenmiş melanositlere (iMel'ler) doğrudan yeniden programlanması için tüm bu transkripsiyon faktörleri için konsantre lentivirüs ile enfekte olmuştur. Ayrıca, bu transkripsiyon faktörleri tarandı ve sistem melanositlere doğrudan yeniden programlama için optimize edildi. iMel'lerde melaninin karakteristik belirteçlerinin gen veya protein seviyesinde ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanmasının vitiligo için başarılı bir yeni terapötik strateji olabileceğini ve fibroblastların in vivo melanositlere doğrudan yeniden programlanması için temel oluşturacak melanosit gelişim mekanizmasını doğrulayabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Vitiligo, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen bir cilt hastalığıdır. Metabolik anormallikler, oksidatif stres, inflamatuar mediatörlerin oluşumu, hücre dekolmanı ve otoimmün yanıt gibi çeşitli nedenlerden dolayı, fonksiyonel melanositler kaybolur ve melanin salgılanması durdurulur ve vitiligo ^1,2'nin gelişmesine yol açar. Bu durum yaygın olarak görülür ve özellikle yüzünde sorunludur. Ana tedavi kortikosteroidlerin ve immünomodülatörlerin sistemik kullanımıdır. Fototerapi sistemik veya lokal hastalıklarda kullanılabilmekte olup, delikli deri nakli ve otolog melanosit transplantasyonu gibi cerrahi tedaviler vardır ^3,4,5. Bununla birlikte, ilaç tedavisi ve fototerapi kullanan hastalar nüksetmeye eğilimlidir ve bu tedavilerin uzun vadeli terapötik etkileri zayıftır. Cerrahi tedavi travmatiktir ve sadece orta derecede etkilidir ^2,6. Bu nedenle vitiligo için yeni ve etkili bir tedavi stratejisine ihtiyaç vardır.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) yeniden programlanması, bu hücreleri terminal durumlarından pluripotent bir duruma çevirir, bu da transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc⁷ tarafından aracılık edilen bir süreçtir. Bununla birlikte, tümörojenisite olasılığı ve uzun üretim süresi nedeniyle, bu teknoloji klinik ortamlara uygulandığında şüphecilikle karşılanmıştır⁸. Doğrudan yeniden programlama, bir terminal hücresi türünün başka bir terminal hücresi türüne dönüşmesini sağlayan bir teknolojidir⁹. Bu işlem uygun transkripsiyon faktörleri ile elde edilir. Kardiyomiyositler^{10, nöronlar 11} ve koklear saç hücreleri¹² dahil olmak üzere çeşitli hücreler doğrudan başarıyla yeniden programlanmıştır. Bazı araştırmacılar, cilt dokusunu doğrudan in situ olarak yeniden programlamışlardır, bu da yara onarımı için kullanılabilir¹³. Doğrudan yeniden programlamanın avantajları arasında daha az bekleme süresi ve maliyeti, daha düşük kanser riski, daha az etik sorun ve hücre kaderinin belirlenmesinin altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılması^{yer almaktadır 9}.

Doğrudan yeniden programlama yöntemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, özellikle^14,15 olarak kabul edilecek çok sayıda transkripsiyon faktörü nedeniyle^, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için şu anda kesin bir yöntem yoktur. Transkripsiyon faktörleri, Mitf, Sox10 ve Pax3, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için kullanılmıştır¹⁴. Buna karşılık, MITF, PAX3, SOX2 ve SOX9'un kombinasyonu, başka bir çalışmada cilt hücrelerinin insan melanositlerine doğrudan yeniden programlanması için de kullanılmıştır¹⁵. Bu protokolde, farklı bir tarama yönteminin kullanılmasına rağmen, daha önce tarif edildiği gibi cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için Mitf, Sox10 ve Pax3 kombinasyonu ile aynı sonuç elde edilmiştir¹⁴. Diğer cilt hücrelerinden melanosit üretmek için bir sistem geliştirmek, vitiligo hastalarının diğer cilt hücrelerini melanositlere dönüştürmek için bir şema sağlayabilir. Bu nedenle, melanositleri başarılı bir şekilde üretmek için bu doğrudan yeniden programlama için basit ve etkili bir yöntem oluşturmak çok önemlidir.

Protokol

Bu çalışma, Jiangsu Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yönetimi ve Kullanım Komitesi (UJS-IACUC-AP--20190305010) tarafından onaylanmıştır. Deneyler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC International) tarafından belirlenen standartlara sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. İnsanları içeren hiçbir deney yoktu, bu yüzden bu çalışmanın insan araştırma etik komitesinden onay alması gerekmiyordu. Reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Transkripsiyon faktörleri için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin yapımı

1. Konsantre virüsün üretimi (Şekil 1A, B)
   1. Plaka 1.5 × 10⁶ HEK-293T hücrelerini 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve bu hücreleri normal ortamla (bakınız Tablo 1) 37 °C'de %5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde kültüre_alın.
      NOT: Virüsün gruplar halinde paketlenmesi gerekiyorsa, 100 mm'lik bir hücre kültürü kabı kullanılabilir (ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız).
   2. 24 saat sonra, HEK-293T hücrelerinin transdüksiyon gününde% 80-90 birleşime ulaştığından emin olun ve ortamı 3.5 mL DMEM (1^cm2 başına 150 μL DMEM) ile değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2 saat boyunca% 5 CO₂ ile bırakın.
      NOT: Değiştirme ortamı serumsuz olmalıdır, böylece hücreler daha iyi plazmid transfeksiyonu için "açlıktan ölebilir".
   3. Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 veya Snai2'nin hedef plazmidlerinin 3 μg'sini içeren plazmidlerin (karışım A) karışımını hazırlayın; 1 μg ambalaj plazmidi PMD2. G ve PSPAX2 ambalaj plazmidinin 2 μg'ı. Serumsuz DMEM ile A ila 150 μL karışımının hacmini oluşturun. Transfeksiyon reaktifinin 12 μL'sini ekleyerek transfeksiyon reaktifinin karışımını (B karışımı) hazırlayın (hacim, tüm plazmidlerin toplam kütlesinin iki katıdır) ve B karışımının hacmini serumsuz DMEM ile 150 μL'ye kadar yapın.
      NOT: Karışımları hazırlarken, hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça sıvı eklemek önemlidir.
   4. A karışımını birleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika beklettikten sonra B'yi karıştırın. Transfeksiyon kompleksini oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
   5. HEK-293T hücrelerini inkübatörden çıkarın, ortamı DMEM +% 2 FBS ile değiştirin, karışımı adım 1.1.4'ten damla damla ekleyin ve sıvıyı yavaşça karıştırın.
   6. 8 saat sonra, ortamı 3,5 mL normal ortamla değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra, virüs süpernatantını her 24 saat ve 48 saatte bir toplayın.
   7. İki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatantlarını karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj. Süpernatantı 0,45 μm filtrelerden geçirin ve 50 mL steril konik bir tüpte toplayın.
      NOT: 24 saatte toplanan virüs 4 °C'de saklanabilir ve 48 saatte toplanan virüsle karıştırılabilir.
   8. Virüs süpernatantını, gece boyunca 4 ° C'de (~ 16 saat) 6000 × g'de santrifüj yaparak konsantre edin. Santrifüjlemeden sonra virüs peletinin konik tüpün dibinde görülebildiğinden emin olun.
   9. Süpernatantı yavaşça dökün. Virüs peletini, virüs süpernatan hacminin 1 /^100'ü olan normal bir ortam hacminde çözün. Bir P1000 mikropipet kullanarak, homojen bir karışım elde edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Konsantre virüsü gerektiğinde mikrosantrifüj tüplerine bölün. −80 °C'de saklayın.
      NOT: Virüs bu yöntemle 100x konsantre edilir. Konsantre virüs (100x) -80 ° C'de >1 yıl saklanabilir. Virüsün tekrar tekrar dondurulmasından ve çözülmesinden kaçının.
2. Konsantre virüs titresinin tespiti (Şekil 1C)
   1. Plaka 1 × 10⁵ HEK-293T hücrelerini 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Negatif bir kontrolün yanı sıra bir tane eklemeyi unutmayın. Bu hücreleri% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamla_{kültürleyin}.
   2. 24 saat sonra her bir kuyucuğa 0.1 μL veya 0.2 μL floresan konsantre virüs (100x) ekleyin ve her bir kuyucuğa 4 ng / μL katyonik polimerik transfeksiyon reaktifi ekleyin. Enfeksiyondan yaklaşık 8-12 saat sonra, ortamı normal ortamla değiştirin.
      NOT: Floresan algılamanın doğruluğunu ve verimliliğini sağlamak için, enfeksiyon oranı% 10-30 olmalıdır. Floresan konsantre virüsün 0.1 μL veya 0.2 μL eklenmesi, enfeksiyon verimliliğini bu aralıkta koruyabilir. Konsantre virüs titresi en az 1 × 10⁸ dönüştürücü üniteye (TU) / mL'ye ulaşabilir.
   3. Enfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, ölü hücreleri çıkarmak için bulaşığı 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
   4. Bu hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 250 μL% 0.05 tripsin-EDTA kullanarak tripsinize edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın ve ardından süpernatanı çıkarın.
   5. Hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın, süspansiyonu 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin ve akış sitometrisini kullanarak virüs floresansının (yeşil floresan proteini, GFP ⁺) enfeksiyon etkinliğini tespit edin.
   6. Aşağıdaki formülü kullanarak konsantre virüs titresini hesaplayın: 10⁵ (hücre hacmi) × enfeksiyon hızı (GFP ⁺%)/eklenen virüs hacmi (0,1 μL veya 0,2 μL).

2. Fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması (Şekil 2A)

1. 6 delikli bir hücre kültürü plakasının bir kuyuğunu oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca 1 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Kuyunun% 0.1 jelatin çözeltisi ile tamamen kaplandığından emin olun. Kaplamadan sonra% 0.1 jelatin çözeltisini aspire edin.
   NOT: % 0.1 jelatin çözeltisini (100 mL) aşağıdaki gibi hazırlayın: 0.1 g jelatin tozu, otoklavlanmış bir cam şişede 100 mL ultra saf su içinde çözülür ve daha sonra 4 ° C'de 2 aydan fazla olmamak üzere saklanır.
2. Plaka 5 × 10⁴ MEF'i% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna (adım 2.1'de olduğu gibi) yerleştirin ve bu hücreleri, gece boyunca% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamla kültürleyin.
3. 24 saat sonra, MEF'lerin% 40-50 birleşme noktasına ulaştığını onaylayın. Ortamı normal ortamla değiştirin.
4. 0. Günde, konsantre virüsü dondurucudan çıkarın ve virüsü buz üzerinde eritin. Eklenecek virüsün hacmini eq. (1) kullanarak hesaplayın. Altı transkripsiyon faktörü olan Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ve Snai2 için konsantre virüsü hesaplanan hacme göre her bir kuyucuğa ekleyin ve ardından katyonik polimerik transfeksiyon ajanının 4 μg / mL'sini ekleyin.
   Hücre sayısı (5 × 10⁴) × 30 (enfeksiyon çokluğu, MOI)/virüs titresi (1)
5. 1. Günde, enfeksiyondan 8-12 saat sonra, virüsü içeren ortamı çıkarın ve stabil enfekte hücre hatlarını taramak için 0.5 μg / mL puromisin eklerken taze normal ortamla değiştirin.
6. 2. Günde, enfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatant ortamı yavaş yavaş yeniden programlama ortamı ile değiştirin. İlk olarak, toplam orta hacmin 1/^4'ünü değiştirin ve 3 μM CHIR99021 ekleyin.
7. 3. Gün'den 7. Gün'e kadar, hücrelerin durumuna bağlı olarak, daha yüksek oranda yeniden programlama ortamıyla değiştirerek ortamı değiştirin (bkz. Tablo 1) kademeli olarak ve 5 gün içinde tam yeniden programlama ortamına geçin.
   NOT: Bu süre zarfında, puromisin ve CHIR99021 her gün kullanılmalıdır. Yeniden programlama ortamının değiştirilmesinin ilk ve ikinci gününde birçok ölü hücre ortaya çıkacaktır. Hücreler yavaş yavaş dönüşüme adapte olduğu için bu normaldir. Bu nedenle, hücrelerin sağlıklı çoğalmasını sağlamak için ortamın kademeli olarak değiştirilmesi gerekir.
8. Hücreleri geçmek için, hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca sindirmek için 500 μL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücrelerin ~% 60'ı yüzdüğünde, sindirim enziminin hacminin 2 katı normal orta ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL steril konik bir tüpte toplayın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın, hücre peletini yeniden programlama ortamıyla yeniden askıya alın ve hücreleri 60 mm steril bir kapta 3 × 10⁴ /^cm2 yoğunlukta tabaklayın. Bu hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe 37 °_{C'de kültürleyin} .
   NOT: 8. günden 21. güne kadar, bu hücreler her 3-5 günde bir alt kültüre alınır ve genişlemek için 60 mm'lik steril kaplarda kültürlenir. En azından 5. pasaja ulaşmak için kültürlenebilirler.

3. Doğrudan yeniden programlama ve tanımlama için optimizasyon

1. Optimize edilmiş transkripsiyon faktörlerinin taranması
   1. 2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyerek her seferinde altı transkripsiyon faktöründen birini azaltın. MEF'leri beş transkripsiyon faktörünün kombinasyonlarıyla virüsle enfekte edin.
   2. Enfeksiyondan yedi gün sonra, bu hücrelerin RNA'sını¹⁶ çıkarın ve melanositik genlerinin ekspresyon seviyelerini, melanositlere dönüşüm üzerinde en büyük etkiye sahip transkripsiyon faktörlerini tek tek çıkararak taramak için ters transkripsiyon PCR (RT-PCR)¹⁷ kullanarak analiz edin (Şekil 3A).
   3. MEF'leri enfekte etmek için melanositlere dönüşümü etkileyen ilk üç transkripsiyon faktörünü kullanın. 2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyin.
      NOT: Enfeksiyondan yedi gün sonra, melanositik genler bu dönüştürülmüş hücrelerde tespit edilebilmelidir (Şekil 3B). iMels karakterizasyonu için astar bilgileri Tablo 3'te yer almaktadır.
2. İndüklenmiş melanositlerin (iMels) tanımlanması
   1. iMel'lerin TYRP-1 ve DCT dahil melanositik proteinleri eksprese ettiğini doğrulamak için immünofloresan boyama^18'i kullanın (Şekil 4A).
   2. Melanine özgü 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA) boyama (Şekil 4B)
      1. % 4 paraformaldehit (10 mL) hazırlayın: 10 mL PBS'de 0.4 g paraformaldehit tozu çözün. Çözünmeyi önlemek için çözeltiyi 56 ° C'de 2 saat boyunca bir fırına koyun.
         NOT: Çözelti 4 °C'de bir aydan fazla tutulamaz.
      2. iMel'leri 30 mm'lik bir tabakta kültürleyin ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 20 dakika boyunca sabitlemek için 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.
      3. 10 mL PBS içinde 0,01 g L-DOPA tozunu çözerek kullanımdan hemen önce% 0,1 DOPA leke çözeltisi (10 mL) hazırlayın. Çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin; çözülmeyi teşvik etmek için birkaç kez sallayın.
      4. 1 mL taze hazırlanmış% 0.1 DOPA boyama çözeltisi ekleyin. 37 °C'de bir fırında 2-5 saat boyunca inkübe edin. Kahverengi-siyah parçacıklar yoksa, 37 ° C'de 2 saat daha inkübe etmeye devam edin, ancak >5 saat boyunca inkübe etmeye devam etmeyin. Numuneleri her 30 dakikada bir kontrol edin.
      5. Bulaşığı PBS ile her seferinde 1 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Çekirdeği 2 dakika boyunca 1 mL hematoksilin boyama çözeltisi ile sabitleyin.
      6. Uzun süreli depolama için, numuneleri 3 dakika boyunca% 95 etanol ve daha sonra% 100 etanol kullanarak 5 dakika boyunca dehidre edin. Çanağı ksilen ve nötr balzam ile kapatın.
   3. Melanine özgü Masson-Fontana boyama (Şekil 4B)
      1. Plaka iMels 30 mm'lik bir tabakta ve hücreleri 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin; bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.
      2. Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti A (amonyak gümüşü çözeltisi) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), tabağı karanlık bir kutuya yerleştirin ve karanlık kutuyu 15-40 dakika boyunca 56 ° C'de bir fırına yerleştirin.
         NOT: Fırında 15 dakika sonra kahverengi-siyah parçacıklar görünmüyorsa, inkübe devam etmek için numuneleri 56 °C fırına iade edin, ancak >40 dakika boyunca değil. Kurumasını önlemek için karanlık kutuya biraz su eklenebilir.
      3. Çözelti A'yı aspire edin ve bulaşığı 5-6 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1-2 dakika.
      4. Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti B (hipo çözelti) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
      5. B çözeltisini aspire edin ve bulaşığı musluk suyuyla 3 kez, her seferinde 1 dakika yıkayın.
      6. Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti C (nötr kırmızı boya) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
      7. C çözeltisini aspire edin ve bulaşığı 3 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1 dakika.
      8. Hızlı dehidrasyon için 1 mL% 100 etanol ekleyin ve 3 dakika sonra etanolün aspire edilmesini sağlayın.
         NOT: Lekeli numuneler, ksilen ve nötr balsam ile kapatıldıktan sonra uzun süre saklanabilir.

Sonuçlar

Bu makalede, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması için transkripsiyon faktörlerinin lentivirüsünü üretmek için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin protokolleri ve transkripsiyon faktörlerinin taranması ve melanositlerin MEF'lerden doğrudan yeniden programlanması için protokoller bulunmaktadır.

Konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP'nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek (Şekil 1A) veya HEK-293T h?...

Tartışmalar

Virüsün kalitesi, bu protokolde melanositlere doğrudan yeniden programlamanın başarısı için çok önemlidir. Bu protokoldeki virüsleri paketleme ve yoğunlaştırma yöntemi basit ve tekrarlanması kolaydır ve başka herhangi bir yardımcı konsantre reaktife dayanmaz. Bu protokol çoğu laboratuvarda başarıyla takip edilebilir. Konsantre virüsün kalitesini sağlamak için, aşağıdaki noktalara özel dikkat gösterilmesi gerekir. Birincisi, HEK-293T'nin hücre durumudur. HEK-293T hücreleri ölümsüzleş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT