Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Zusammenfassung

Der Funktionsverlust der Melanozyten führt zu Vitiligo, was die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Derzeit gibt es keine wirksame Langzeitbehandlung für Vitiligo. Daher ist es unerlässlich, eine bequeme und wirksame Behandlung für Vitiligo zu entwickeln. Die Technologie der regenerativen Medizin zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten scheint eine vielversprechende neuartige Behandlung der Vitiligo zu sein. Dies beinhaltet die direkte Umprogrammierung der Hautzellen des Patienten in funktionelle Melanozyten, um den Verlust von Melanozyten bei Patienten mit Vitiligo zu lindern. Diese Methode muss jedoch zuerst an Mäusen getestet werden. Obwohl die direkte Reprogrammierung weit verbreitet ist, gibt es kein klares Protokoll für die direkte Reprogrammierung in Melanozyten. Darüber hinaus ist die Anzahl der verfügbaren Transkriptionsfaktoren überwältigend.

Hier wird ein konzentriertes Lentivirus-Verpackungssystemprotokoll vorgestellt, um Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die für die Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten ausgewählt wurden, einschließlich Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2. Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden mit dem konzentrierten Lentivirus für all diese Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung der MEFs in induzierte Melanozyten (iMels) in vitro infiziert. Darüber hinaus wurden diese Transkriptionsfaktoren gescreent und das System für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten optimiert. Die Expression der charakteristischen Melaninmarker in iMels auf Gen- oder Proteinebene war signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten eine erfolgreiche neue therapeutische Strategie für Vitiligo sein könnte und den Mechanismus der Melanozytenentwicklung bestätigt, der die Grundlage für eine weitere direkte Reprogrammierung von Fibroblasten in Melanozyten in vivo bilden wird.

Einleitung

Vitiligo ist eine Hautkrankheit, die die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Aus verschiedenen Gründen, einschließlich metabolischer Anomalien, oxidativem Stress, Bildung von Entzündungsmediatoren, Zellablösung und Autoimmunreaktion, gehen die funktionellen Melanozyten verloren und die Sekretion von Melanin wird gestoppt, was zur Entwicklung von Vitiligo ^1,2 führt. Dieser Zustand tritt häufig auf und ist besonders problematisch im Gesicht. Die Hauptbehandlung ist die systemische Verwendung von Kortikosteroiden und Immunmodulatoren. Phototherapie kann für systemische oder lokale Krankheiten verwendet werden, und es gibt chirurgische Behandlungen, wie perforierte Hauttransplantation und autologe Melanozytentransplantation ^3,4,5. Patienten, die medikamentöse Therapie und Phototherapie anwenden, sind jedoch anfällig für Rückfälle, und diese Behandlungen haben schlechte langfristige therapeutische Wirkungen. Die chirurgische Behandlung ist traumatisch und nur mäßig wirksam ^2,6. Daher ist eine neue und wirksame therapeutische Strategie für Vitiligo erforderlich.

Die Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) kehrt diese Zellen von ihrem terminalen Zustand in einen pluripotenten Zustand um, ein Prozess, der durch die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc⁷ vermittelt wird. Aufgrund der Möglichkeit der Tumorigenität und der langen Produktionszeit ist diese Technologie jedoch auf Skepsis gestoßen, wenn sie auf klinische Umgebungen angewendet wird⁸. Die direkte Reprogrammierung ist eine Technologie, die einen Typ einer Terminalzelle in einen anderen Typ einer Terminalzelle^{verwandelt 9}. Dieser Prozess wird durch geeignete Transkriptionsfaktoren erreicht. Verschiedene Zellen wurden bereits erfolgreich direkt umprogrammiert, darunter Kardiomyozyten¹⁰, Neuronen 11 und Cochlea-Haarzellen¹². Einige Forscher haben sogar Hautgewebe direkt in situ umprogrammiert, das zur Wundheilung genutzt werden kann¹³. Zu den Vorteilen einer direkten Reprogrammierung gehören reduzierte Wartezeiten und Kosten, ein geringeres Krebsrisiko, weniger ethische Probleme und ein besseres Verständnis des Mechanismus, der der Bestimmung des Zellschicksals zugrunde liegt⁹.

Obwohl die direkte Reprogrammierungsmethode weit verbreitet ist, gibt es derzeit keine definitive Methode zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten, insbesondere wegen der zahlreichen Transkriptionsfaktoren, die^{als 14,15} zu betrachten sind. Die Transkriptionsfaktoren Mitf, Sox10 und Pax3 wurden zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten¹⁴ verwendet. Im Gegensatz dazu wurde die Kombination von MITF, PAX3, SOX2 und SOX9 in einer anderen Studie¹⁵ auch für die direkte Reprogrammierung von Hautzellen in menschliche Melanozyten verwendet. In diesem Protokoll wurde trotz der Verwendung einer anderen Screening-Methode das gleiche Ergebnis mit der Kombination von Mitf, Sox10 und Pax3 zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten erzielt, wie zuvor^{beschrieben 14}. Die Entwicklung eines Systems zur Erzeugung von Melanozyten aus anderen Hautzellen kann ein Schema für die Umwandlung anderer Hautzellen von Vitiligo-Patienten in Melanozyten liefern. Daher ist es entscheidend, eine einfache und effiziente Methode für diese direkte Reprogrammierung zu konstruieren, um Melanozyten erfolgreich zu erzeugen.

Protokoll

Diese Arbeit wurde vom Laboratory Animal Management and Use Committee an der Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010) genehmigt. Die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Standards durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) festgelegt wurden. Es gab keine Experimente mit Menschen, so dass diese Arbeit keine Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung benötigte. Weitere Informationen zu Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .

1. Aufbau eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems für Transkriptionsfaktoren

1. Produktion des konzentrierten Virus (Abbildung 1A, B)
   1. Platte 1,5 × 10⁶ HEK-293T-Zellen in eine 60 mm Schale und Kultur dieser Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂.
      HINWEIS: Wenn das Virus in Chargen verpackt werden muss, kann eine 100-mm-Zellkulturschale verwendet werden (Details siehe Tabelle 2).
   2. Stellen Sie nach 24 h sicher, dass die HEK-293T-Zellen am Tag der Transduktion einen Konfluenz von 80-90% erreicht haben, und ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM pro 1 cm²). Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für₂ h.
      HINWEIS: Das Ersatzmedium muss serumfrei sein, damit die Zellen für eine bessere Plasmidtransfektion "ausgehungert" werden können.
   3. Herstellen der Mischung von Plasmiden (Mischung A), die 3 μg der Zielplasmide von Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 oder Snai2 enthält; 1 μg des Verpackungsplasmids PMD2. G und 2 μg des Verpackungsplasmids PSPAX2. Machen Sie das Volumen von Mix A bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus. Bereiten Sie die Mischung des Transfektionsreagenzes (Mischung B) durch Zugabe von 12 μL des Transfektionsreagenzes vor (das Volumen ist doppelt so groß wie die Gesamtmasse aller Plasmide) und machen Sie das Volumen von Mischung B bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus.
      HINWEIS: Bei der Zubereitung der Mischungen ist es wichtig, Flüssigkeit langsam hinzuzufügen, um Luftblasen zu vermeiden.
   4. Kombinieren Sie Mix A und Mix B, nachdem Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen haben. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 Minuten, um den Transfektionskomplex zu bilden.
   5. Nehmen Sie die HEK-293T-Zellen aus dem Inkubator, ersetzen Sie das Medium durch DMEM + 2% FBS, fügen Sie die Mischung aus Schritt 1.1.4 tropfenweise hinzu und mischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig.
   6. Nach 8 h wechseln Sie das Medium mit 3,5 ml normalem Medium. Nach dem Wechseln des Mediums sammeln Sie den Virusüberstand alle 24 h und 48 h.
   7. Mischen Sie die Virusüberstände, die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Führen Sie den Überstand durch 0,45-μm-Filter und sammeln Sie ihn in einem sterilen 50-ml-Konusrohr.
      HINWEIS: Das bei 24 h gesammelte Virus kann bei 4 °C gelagert und mit dem um 48 h gesammelten Virus gemischt werden.
   8. Konzentrieren Sie den Virusüberstand durch Zentrifugieren bei 6000 × g bei 4 °C über Nacht (~16 h). Stellen Sie sicher, dass das Viruspellet nach dem Zentrifugieren am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist.
   9. Gießen Sie den Überstand langsam aus. Lösen Sie das Viruspellet in einem Volumen des normalen Mediums auf, das 1/100 des Volumens^des Virusüberstands beträgt. Mit einer P1000-Mikropipette vorsichtig auf und ab pipettieren, bis eine homogene Mischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus nach Bedarf in Mikrozentrifugenröhrchen auf. Bei −80 °C lagern.
      HINWEIS: Das Virus wird mit dieser Methode 100x konzentriert. Das konzentrierte Virus (100x) kann >1 Jahr bei −80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus.
2. Nachweis des konzentrierten Virustiters (Abbildung 1C)
   1. Platte 1 × 10 5 HEK-293T-Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte^. Denken Sie daran, eine gut als Negativkontrolle hinzuzufügen. Kultivieren Sie diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂.
   2. 0,1 μL oder 0,2 μL fluoreszierendes konzentriertes Virus (100x) zu jeder Vertiefung nach 24 h hinzufügen und 4 ng/μL des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung hinzufügen. Etwa 8-12 h nach der Infektion das Medium durch normales Medium ersetzen.
      HINWEIS: Um die Genauigkeit und Effizienz der Fluoreszenzerkennung zu gewährleisten, muss die Infektionsrate 10-30% betragen. Die Zugabe von 0,1 μL oder 0,2 μL des fluoreszierenden konzentrierten Virus kann die Infektionseffizienz in diesem Bereich aufrechterhalten. Der konzentrierte Virustiter kann mindestens 1 × 10⁸ Transduziereinheiten (TU)/ml erreichen.
   3. Waschen Sie das Geschirr etwa 48 Stunden nach der Infektion mit 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um abgestorbene Zellen zu entfernen.
   4. Trypsinisieren Sie diese Zellen mit 250 μL 0,05% Trypsin-EDTA pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte für 1 min bei Raumtemperatur. Bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand entfernen.
   5. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml PBS, fügt die Suspension zu einem 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen hinzu und erkennt die Infektionseffizienz der Virusfluoreszenz (grün fluoreszierendes Protein, GFP ⁺⁾ mittels Durchflusszytometrie.
   6. Berechnen Sie den konzentrierten Virustiter nach folgender Formel: 10⁵ (Zellvolumen) × Infektionsrate (GFP⁺%)/hinzugefügtes Virusvolumen (0,1 μL oder 0,2 μL).

2. Direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten (Abbildung 2A)

1. Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml 0,1% iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur für 15-30 min. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig mit der 0,1% igen Gelatinelösung bedeckt ist. Saugen Sie die 0,1% ige Gelatinelösung nach dem Überziehen ab.
   HINWEIS: Bereiten Sie 0,1% ige Gelatinelösung (100 ml) wie folgt vor: 0,1 g Gelatinepulver werden in 100 ml Reinstwasser in einer Autoklavglasflasche gelöst und dann bei 4 °C für nicht mehr als 2 Monate gelagert.
2. Platte 5 × 10⁴ MEFs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit_0,1% Gelatine beschichtet ist (wie in Schritt 2.1), und diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 über Nacht kultivieren.
3. Bestätigen Sie nach 24 h, dass die MEFs einen Zusammenfluss von 40-50% erreicht haben. Ersetzen Sie das Medium durch ein normales Medium.
4. Nehmen Sie am Tag 0 das konzentrierte Virus aus dem Gefrierschrank und schmelzen Sie das Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus anhand von Gl. (1). Fügen Sie das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 und Snai2 (siehe Materialtabelle) entsprechend dem berechneten Volumen zu jeder Vertiefung hinzu und fügen Sie dann 4 μg / ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels hinzu.
   Zellzahl (5 × 10⁴) × 30 (Multiplizität der Infektion, MOI)/Virustiter (1)
5. Entfernen Sie am Tag 1, 8-12 h nach der Infektion, das Medium, das das Virus enthält, und ersetzen Sie es durch frisches normales Medium, während Sie 0,5 μg / ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.
6. Ersetzen Sie am Tag 2, 48 h nach der Infektion, das überstehende Medium schrittweise durch das Umprogrammierungsmedium. Ändern Sie zunächst 1/4^des gesamten mittleren Volumens und addieren Sie 3 μM CHIR99021.
7. Wechseln Sie von Tag 3 bis Tag 7 je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie das Reprogrammiermedium schrittweise durch einen höheren Anteil des Reprogrammiermediums (siehe Tabelle 1) ersetzen, und wechseln Sie innerhalb von 5 Tagen zum vollständigen Reprogrammiermedium.
   HINWEIS: Während dieser Zeit müssen Puromycin und CHIR99021 täglich angewendet werden. Viele tote Zellen erscheinen am ersten und zweiten Tag des Wechsels des Reprogrammiermediums. Dies ist normal, da sich die Zellen allmählich an die Transformation anpassen. Daher muss das Medium schrittweise gewechselt werden, um die gesunde Proliferation der Zellen zu gewährleisten.
8. Um die Zellen zu passieren, fügen Sie 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen für 3 Minuten bei Raumtemperatur zu verdauen. Wenn ~ 60% der Zellen aufgewachsen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie normales Medium hinzufügen, das 2x das Volumen des Verdauungsenzyms beträgt. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen, zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium und plattieren Sie die Zellen in einer 60 mm sterilen Schale mit einer Dichte von 3 × 10⁴/cm². Kultivieren Sie diese Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen_{CO2-Inkubator.}
   HINWEIS: Von Tag 8 bis Tag 21 werden diese Zellen alle 3-5 Tage subkultiviert und in 60 mm sterilen Schalen kultiviert, um sich auszudehnen. Sie können kultiviert werden, um mindestens Passage 5 zu erreichen.

3. Optimierung zur direkten Reprogrammierung und Identifikation

1. Screening auf die optimierten Transkriptionsfaktoren
   1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, und reduzieren Sie jedes Mal einen der sechs Transkriptionsfaktoren. Infizieren Sie die MEFs mit dem Virus mit Kombinationen von fünf Transkriptionsfaktoren.
   2. Sieben Tage nach der Infektion extrahieren Sie die RNA dieser Zellen¹⁶ und analysieren Sie die Expressionsniveaus ihrer melanozytären Gene mit Reverse-Transkription PCR (RT-PCR⁾¹⁷ , um nach den Transkriptionsfaktoren mit dem größten Einfluss auf die Umwandlung in Melanozyten zu suchen, indem Sie sie nacheinander entfernen (Abbildung 3A).
   3. Verwenden Sie die drei wichtigsten Transkriptionsfaktoren, die die Umwandlung in Melanozyten beeinflussen, um die MEFs zu infizieren. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7.
      HINWEIS: Sieben Tage nach der Infektion sollten die melanozytären Gene in diesen transformierten Zellen nachweisbar sein (Abbildung 3B). Primer-Informationen für die iMels-Charakterisierung sind in Tabelle 3 enthalten.
2. Identifizierung induzierter Melanozyten (iMels)
   1. Verwenden Sie die Immunfluoreszenzfärbung¹⁸ , um zu überprüfen, ob die iMels melanozytäre Proteine, einschließlich TYRP-1 und DCT, exprimieren (Abbildung 4A).
   2. Melanin-spezifische 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA)-Färbung (Abbildung 4B)
      1. 4% Paraformaldehyd (10 ml) wie folgt herstellen: 0,4 g Paraformaldehydpulver in 10 mL PBS auflösen. Stellen Sie die Lösung 2 h lang in einen Ofen bei 56 °C, um die Auflösung zu fördern.
         HINWEIS: Die Lösung kann nicht länger als einen Monat bei 4 °C gehalten werden.
      2. Die iMels in einer 30 mm Schüssel anfassen und zweimal mit vorgewärmtem PBS abwaschen. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen für 20 min zu fixieren, und waschen Sie die Schüssel 3 Mal mit PBS.
      3. Bereiten Sie 0,1% DOPA-Färbungslösung (10 ml) kurz vor Gebrauch vor, indem Sie 0,01 g L-DOPA-Pulver in 10 ml PBS auflösen. Legen Sie die Lösung für 30 min in ein Wasserbad bei 37 ° C; Schütteln Sie es mehrmals, um die Auflösung zu fördern.
      4. Fügen Sie 1 ml frisch zubereitete 0,1% DOPA-Färbelösung hinzu. In einem Ofen bei 37 °C für 2-5 h inkubieren. Wenn keine braun-schwarzen Partikel vorhanden sind, inkubieren Sie bei 37 °C für weitere 2 h, jedoch nicht für >5 h. Überprüfen Sie die Proben alle 30 Minuten.
      5. Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS für jeweils 1 Minute. Färben Sie den Kern mit 1 ml Hämatoxylin-Färbelösung für 2 min.
      6. Für die Langzeitlagerung dehydrieren Sie die Proben mit 95% Ethanol für 3 min und dann 100% Ethanol für 5 min. Verschließen Sie die Schale mit Xylol und neutralem Balsam.
   3. Melanin-spezifische Masson-Fontana-Färbung (Abbildung 4B)
      1. Platte iMels in einer 30 mm Schale und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 20 min; Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS.
      2. Fügen Sie 1 ml Lösung A (Ammoniaksilberlösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu (siehe Materialtabelle), legen Sie die Schale in eine dunkle Schachtel und stellen Sie die dunkle Box für 15-40 min in einen Ofen bei 56 ° C.
         HINWEIS: Wenn braun-schwarze Partikel nach 15 min im Ofen nicht sichtbar sind, geben Sie die Proben in den 56 ° C-Ofen zurück, um die Inkubation fortzusetzen, jedoch nicht für >40 Minuten. Etwas Wasser kann in die dunkle Box gegeben werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
      3. Aspirationslösung A und das Gericht 5-6 mal mit destilliertem Wasser waschen, jeweils 1-2 min.
      4. Fügen Sie 1 ml Lösung B (Hypolösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.
      5. Sauglösung B an und spülen Sie das Geschirr 3 Mal, jeweils 1 min mit Leitungswasser ab.
      6. Fügen Sie 1 ml Lösung C (neutraler roter Farbstoff) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.
      7. Aspirationslösung C und waschen Sie das Gericht 3 Mal mit destilliertem Wasser, jeweils 1 min.
      8. Fügen Sie 1 ml 100% Ethanol für eine schnelle Dehydratisierung hinzu und saugen Sie das Ethanol nach 3 Minuten ab.
         HINWEIS: Gebeizte Proben können nach dem Verschließen mit Xylol und neutralem Balsam lange gelagert werden.

Ergebnisse

Dieser Artikel enthält die Protokolle eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems zur Herstellung von Lentiviren von Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten und Protokolle für das Screening auf Transkriptionsfaktoren und die direkte Reprogrammierung von Melanozyten aus MEFs.

Der Erfolg der konzentrierten Lentivirusproduktion wurde durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP (Abbildung 1A) oder durch Durchflusszytometrie (Abbild...

Diskussion

Die Qualität des Virus ist entscheidend für den Erfolg der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten in diesem Protokoll. Die Methode zum Verpacken und Konzentrieren von Viren in diesem Protokoll ist einfach und leicht zu wiederholen und stützt sich nicht auf ein anderes konzentriertes Hilfsreagenz. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors erfolgreich befolgt werden. Um die Qualität des konzentrierten Virus zu gewährleisten, bedürfen die folgenden Punkte besonderer Aufmerksamkeit. Einer ist der Zellstatus von HE...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT