Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

Riepilogo

Qui descriviamo un sistema di riprogrammazione diretta ottimizzato per i melanociti e un sistema di confezionamento dei virus concentrato ad alta efficienza che garantisce una riprogrammazione diretta senza intoppi.

Abstract

La perdita di funzione dei melanociti porta alla vitiligine, che influisce seriamente sulla salute fisica e mentale degli individui colpiti. Attualmente, non esiste un trattamento efficace a lungo termine per la vitiligine. Pertanto, è imperativo sviluppare un trattamento conveniente ed efficace per la vitiligine. La tecnologia di medicina rigenerativa per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti sembra essere un nuovo promettente trattamento della vitiligine. Ciò comporta la riprogrammazione diretta delle cellule cutanee del paziente in melanociti funzionali per aiutare a migliorare la perdita di melanociti nei pazienti con vitiligine. Tuttavia, questo metodo deve essere prima testato sui topi. Sebbene la riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzata, non esiste un protocollo chiaro per la riprogrammazione diretta in melanociti. Inoltre, il numero di fattori di trascrizione disponibili è schiacciante.

Qui, viene presentato un protocollo di sistema di confezionamento di lentivirus concentrato per produrre fattori di trascrizione selezionati per riprogrammare le cellule della pelle in melanociti, tra cui Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati infettati dal lentivirus concentrato per tutti questi fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta dei MEF in melanociti indotti (iMels) in vitro. Inoltre, questi fattori di trascrizione sono stati sottoposti a screening e il sistema è stato ottimizzato per la riprogrammazione diretta ai melanociti. L'espressione dei marcatori caratteristici della melanina in iMels a livello genico o proteico è stata significativamente aumentata. Questi risultati suggeriscono che la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti potrebbe essere una nuova strategia terapeutica di successo per la vitiligine e confermare il meccanismo di sviluppo dei melanociti, che fornirà la base per un'ulteriore riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti in vivo.

Introduzione

La vitiligine è una malattia della pelle che colpisce seriamente la salute fisica e mentale degli individui colpiti. Per vari motivi, tra cui anomalie metaboliche, stress ossidativo, generazione di mediatori infiammatori, distacco cellulare e risposta autoimmune, i melanociti funzionali vengono persi e la secrezione di melanina viene interrotta, portando allo sviluppo della vitiligine ^1,2. Questa condizione si verifica ampiamente ed è particolarmente problematica sul viso. Il trattamento principale è l'uso sistemico di corticosteroidi e immunomodulatori. La fototerapia può essere utilizzata per malattie sistemiche o locali e ci sono trattamenti chirurgici, come il trapianto di pelle perforata e il trapianto di melanociti autologhi ^3,4,5. Tuttavia, i pazienti che usano la terapia farmacologica e la fototerapia sono inclini a ricadute e questi trattamenti hanno scarsi effetti terapeutici a lungo termine. Il trattamento chirurgico è traumatico e solo moderatamente efficace ^2,6. Pertanto, è necessaria una nuova ed efficace strategia terapeutica per la vitiligine.

La riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) inverte queste cellule dal loro stato terminale a uno stato pluripotente, un processo mediato dai fattori di trascrizione, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc⁷. Tuttavia, a causa della possibilità di tumorigenicità e del lungo tempo di produzione, questa tecnologia è stata accolta con scetticismo quando applicata a contesti clinici⁸. La riprogrammazione diretta è una tecnologia che fa sì che un tipo di cella terminale si trasformi in un altro tipo di cella terminale⁹. Questo processo è ottenuto da fattori di trascrizione adeguati. Varie cellule sono già state riprogrammate direttamente con successo, tra cui cardiomiociti¹⁰, neuroni¹¹ e cellule ciliate cocleari¹². Alcuni ricercatori hanno persino riprogrammato il tessuto cutaneo direttamente in situ, che può essere utilizzato per la riparazione delle ferite¹³. I vantaggi della riprogrammazione diretta includono tempi e costi di attesa ridotti, minor rischio di cancro, meno problemi etici e una migliore comprensione del meccanismo alla base della determinazione del destino cellulare⁹.

Sebbene il metodo della riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzato, attualmente non esiste un metodo definito per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti, soprattutto a causa dei numerosi fattori di trascrizione da considerare^14,15. I fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e Pax3, sono stati utilizzati per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti¹⁴. Al contrario, la combinazione di MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 è stata utilizzata anche per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti umani in un altro studio¹⁵. In questo protocollo, nonostante l'uso di un diverso metodo di screening, lo stesso risultato è stato ottenuto con la combinazione di Mitf, Sox10 e Pax3 per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti come descritto in precedenza¹⁴. Lo sviluppo di un sistema per generare melanociti da altre cellule della pelle può fornire uno schema per trasformare altre cellule della pelle dei pazienti con vitiligine in melanociti. Quindi, è fondamentale costruire un metodo semplice ed efficiente per questa riprogrammazione diretta per generare melanociti con successo.

Protocollo

Questo lavoro è stato approvato dal Comitato per la gestione e l'uso degli animali da laboratorio presso l'Università di Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Gli esperimenti sono stati eseguiti in stretta conformità con gli standard stabiliti dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Non c'erano esperimenti che coinvolgevano esseri umani, quindi questo lavoro non aveva bisogno dell'approvazione del comitato etico della ricerca umana. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti.

1. Costruzione di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per fattori di trascrizione

1. Produzione del virus concentrato (Figura 1A, B)
   1. Piastra 1,5 × 10⁶ celle HEK-293T in un piatto da 60 mm e colturare queste cellule con mezzo normale (vedi Tabella 1) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
      NOTA: se il virus deve essere confezionato in lotti, è possibile utilizzare una parabola di coltura cellulare da 100 mm (per i dettagli, vedere la Tabella 2).
   2. Dopo 24 ore, assicurarsi che le cellule HEK-293T abbiano raggiunto l'80-90% di confluenza il giorno della trasduzione e sostituire il mezzo con 3,5 mL di DMEM (150 μL di DMEM per 1 cm²). Lasciare le celle a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 2 ore.
      NOTA: Il mezzo sostitutivo deve essere privo di siero, in modo che le cellule possano essere "affamate" per una migliore trasfezione del plasmide.
   3. Preparare la miscela di plasmidi (miscela A) contenente 3 μg dei plasmidi bersaglio di Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 μg del plasmide di imballaggio PMD2. G, e 2 μg del plasmide di imballaggio PSPAX2. Aumentare il volume della miscela A a 150 μL con DMEM senza siero. Preparare la miscela del reagente di trasfezione (miscela B) aggiungendo 12 μL del reagente di trasfezione (il volume è il doppio della massa totale di tutti i plasmidi) e portare il volume della miscela B a 150 μL con DMEM privo di siero.
      NOTA: Quando si preparano le miscele, è importante aggiungere il liquido lentamente per evitare bolle d'aria.
   4. Unire mescolare A e mescolare B dopo averli lasciati riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 minuti per formare il complesso di trasfezione.
   5. Estrarre le celle HEK-293T dall'incubatore, sostituire il mezzo con DMEM + 2% FBS, aggiungere la miscela dal passaggio 1.1.4 a goccia e mescolare delicatamente il liquido.
   6. Dopo 8 ore, cambiare il mezzo con 3,5 ml di mezzo normale. Dopo aver cambiato il mezzo, raccogliere il surnatante del virus ogni 24 ore e 48 ore.
   7. Mescolare i supernatanti virali raccolti in due diversi punti temporali. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Passare il surnatante attraverso filtri da 0,45 μm e raccoglierlo in un tubo conico sterile da 50 ml.
      NOTA: Il virus raccolto a 24 ore può essere conservato a 4 °C e miscelato con il virus raccolto a 48 ore.
   8. Concentrare il surnatante virale centrifugando a 6000 × g a 4 °C durante la notte (~16 h). Assicurarsi che il pellet di virus sia visibile nella parte inferiore del tubo conico dopo la centrifugazione.
   9. Versare lentamente il surnatante. Sciogliere il pellet virale in un volume di mezzo normale che è 1/¹⁰⁰ ° del volume del surnatante del virus. Utilizzando una micropipetta P1000, pipettare su e giù delicatamente fino ad ottenere una miscela omogenea. Dividere il virus concentrato in tubi di microcentrifuga, se necessario. Conservare a -80 °C.
      NOTA: il virus è concentrato 100 volte con questo metodo. Il virus concentrato (100x) può essere conservato per >1 anno a -80 °C. Evitare il congelamento ripetuto e lo scongelamento del virus.
2. Rilevamento del titolo virale concentrato (Figura 1C)
   1. La piastra 1 × 10⁵ celle HEK-293T in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Ricorda di aggiungerne uno bene come controllo negativo. Coltivare queste cellule con mezzo normale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
   2. Aggiungere 0,1 μL o 0,2 μL di virus fluorescente concentrato (100x) a ciascun pozzetto dopo 24 ore e aggiungere 4 ng/μL del reagente cationico polimerico trasfezione a ciascun pozzetto. Circa 8-12 ore dopo l'infezione, sostituire il mezzo con un mezzo normale.
      NOTA: per garantire l'accuratezza e l'efficienza del rilevamento della fluorescenza, il tasso di infezione deve essere del 10-30%. L'aggiunta di 0,1 μL o 0,2 μL del virus fluorescente concentrato può mantenere l'efficienza dell'infezione entro questo intervallo. Il titolo del virus concentrato può raggiungere almeno 1 × 10⁸ unità trasduttori (TU)/mL.
   3. Circa 48 ore dopo l'infezione, lavare il piatto con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le cellule morte.
   4. Tripsinizzare queste cellule utilizzando 250 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C e poi rimuovere il surnatante.
   5. Risospesso il pellet cellulare in 1 mL di PBS, aggiungere la sospensione a un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL e rilevare l'efficienza di infezione della fluorescenza del virus (proteina fluorescente verde, GFP⁺) utilizzando la citometria a flusso.
   6. Calcolare il titolo del virus concentrato utilizzando la seguente formula: 10⁵ (volume cellulare) × tasso di infezione (GFP ⁺%) / volume di virus aggiunto (0,1 μL o 0,2 μL).

2. Riprogrammazione diretta dei fibroblasti ai melanociti (Figura 2A)

1. Rivestire un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione di gelatina allo 0,1% a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Assicurarsi che il pozzo sia completamente coperto con la soluzione di gelatina allo 0,1%. Aspirare la soluzione di gelatina allo 0,1% dopo il rivestimento.
   NOTA: Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% (100 ml) come segue: 0,1 g di gelatina in polvere vengono sciolti in 100 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro autoclavata e quindi conservati a 4 °C per non più di 2 mesi.
2. La piastra 5 × 10⁴ MEF in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% (come nel passaggio 2.1) e coltiva queste cellule con mezzo normale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ durante la notte.
3. Dopo 24 ore, confermare che i MEF hanno raggiunto il 40-50% di confluenza. Sostituire il mezzo con il mezzo normale.
4. Il giorno 0, estrarre il virus concentrato dal congelatore e sciogliere il virus sul ghiaccio. Calcolare il volume del virus da aggiungere utilizzando eq. (1). Aggiungere il virus concentrato per i sei fattori di trascrizione, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto in base al volume calcolato, quindi aggiungere 4 μg/mL dell'agente di trasfezione polimerica cationica.
   Numero di cellule (5 × 10⁴) × 30 (molteplicità di infezione, MOI)/titolo virale (1)
5. Il giorno 1, 8-12 ore dopo l'infezione, rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con un mezzo normale fresco aggiungendo 0,5 μg / mL di puromicina per lo screening di linee cellulari infette stabili.
6. Il giorno 2, 48 ore dopo l'infezione, sostituire gradualmente il mezzo surnatante con il mezzo di riprogrammazione. Innanzitutto, modificare 1^{/4 del} volume medio totale e aggiungere 3 μM CHIR99021.
7. Dal giorno 3 al giorno 7, a seconda delle condizioni delle cellule, cambiare gradualmente il mezzo sostituendolo con una percentuale maggiore di mezzo di riprogrammazione (vedi Tabella 1) e passare gradualmente al mezzo di riprogrammazione completo entro 5 giorni.
   NOTA: Durante questo periodo, puromicina e CHIR99021 devono essere utilizzati tutti i giorni. Molte cellule morte appariranno il primo e il secondo giorno di cambio del mezzo di riprogrammazione. Questo è normale in quanto le cellule si adattano gradualmente alla trasformazione. Pertanto, il mezzo deve essere cambiato gradualmente per garantire la sana proliferazione delle cellule.
8. Per far passare le cellule, aggiungere 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per digerire le cellule per 3 minuti a temperatura ambiente. Quando ~ 60% delle cellule hanno galleggiato, interrompere la digestione aggiungendo mezzo normale 2 volte il volume dell'enzima digestivo. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 mL, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, risospese il pellet cellulare con il mezzo di riprogrammazione e placcare le cellule in una parabola sterile da 60 mm ad una densità di 3 × 10⁴/cm². Coltiva queste cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
   NOTA: Dal giorno 8 al giorno 21, queste cellule vengono sottocolturate ogni 3-5 giorni e coltivate in piatti sterili da 60 mm per espandersi. Possono essere coltivati per raggiungere almeno il passaggio 5.

3. Ottimizzazione per la riprogrammazione diretta e l'identificazione

1. Screening per i fattori di trascrizione ottimizzati
   1. Ripetere i passaggi 2.1-2.7, riducendo ogni volta uno dei sei fattori di trascrizione. Infettare i MEF con il virus con combinazioni di cinque fattori di trascrizione.
   2. Sette giorni dopo l'infezione, estrarre l'RNA di queste cellule¹⁶ e analizzare i livelli di espressione dei loro geni melanocitici utilizzando la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR)¹⁷ per lo screening dei fattori di trascrizione con il maggiore impatto sulla conversione in melanociti rimuovendoli uno per uno (Figura 3A).
   3. Utilizzare i primi tre fattori di trascrizione che influenzano la conversione in melanociti per infettare i MEF. Ripetere i passaggi 2.1-2.7.
      NOTA: Sette giorni dopo l'infezione, i geni melanocitici devono essere rilevabili in queste cellule trasformate (Figura 3B). Le informazioni di base per la caratterizzazione di iMels sono incluse nella Tabella 3.
2. Identificazione dei melanociti indotti (iMels)
   1. Utilizzare la colorazione a immunofluorescenza¹⁸ per verificare che gli iMels esprimano proteine melanocitiche, tra cui TYRP-1 e DCT (Figura 4A).
   2. Colorazione della 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) specifica della melanina (Figura 4B)
      1. Preparare il 4% di paraformaldeide (10 ml) come segue: sciogliere 0,4 g di polvere di paraformaldeide in 10 ml di PBS. Mettere la soluzione in forno a 56 °C per 2 ore per favorire la dissoluzione.
         NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per non più di un mese.
      2. Coltivare gli iMels in un piatto da 30 mm e lavare il piatto due volte con PBS preriscaldato. Aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% per fissare le cellule per 20 minuti e lavare il piatto 3 volte con PBS.
      3. Preparare la soluzione colorante allo 0,1% di DOPA (10 ml) appena prima dell'uso sciogliendo 0,01 g di polvere di L-DOPA in 10 ml di PBS. Porre la soluzione a bagnomaria a 37 °C per 30 min; scuoterlo più volte per favorire la dissoluzione.
      4. Aggiungere 1 mL di soluzione colorante allo 0,1% DOPA preparata al momento. Incubare in forno a 37 °C per 2-5 ore. Se non ci sono particelle bruno-nere, continuare a incubare a 37 °C per altre 2 ore ma non per >5 ore. Controllare i campioni ogni 30 minuti.
      5. Lavare il piatto 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. Macchiare il nucleo con 1 mL di soluzione colorante ematossilina per 2 min.
      6. Per la conservazione a lungo termine, disidratare i campioni utilizzando etanolo al 95% per 3 minuti e quindi etanolo al 100% per 5 minuti. Sigillare il piatto con xilene e balsamo neutro.
   3. Colorazione Masson-Fontana specifica per la melanina (Figura 4B)
      1. Piastra iMels in un piatto da 30 mm e fissare le celle con il 4% di paraformaldeide per 20 min; lavare il piatto 3 volte con PBS.
      2. Aggiungere 1 mL di soluzione A (soluzione di argento ammoniacale) dal kit di colorazione Masson-Fontana (vedi Tabella dei materiali), posizionare il piatto in una scatola scura e posizionare la scatola scura in forno a 56 °C per 15-40 minuti.
         NOTA: Se le particelle marrone-nere non sono visibili dopo 15 minuti nel forno, riportare i campioni al forno a 56 °C per continuare l'incubazione, ma non per >40 min. Un po 'd'acqua può essere aggiunta alla scatola scura per evitare che si secchi.
      3. Aspirare la soluzione A e lavare il piatto 5-6 volte con acqua distillata, 1-2 minuti ogni volta.
      4. Aggiungere 1 mL di soluzione B (soluzione ipo) dal kit di colorazione Masson-Fontana e lasciare il piatto a temperatura ambiente per 3-5 minuti.
      5. Aspirare la soluzione B e lavare il piatto con acqua di rubinetto 3 volte, 1 min ogni volta.
      6. Aggiungere 1 mL di soluzione C (colorante rosso neutro) dal kit di colorazione Masson-Fontana e lasciare il piatto a temperatura ambiente per 3-5 minuti.
      7. Aspirare la soluzione C e lavare il piatto 3 volte con acqua distillata, 1 min ogni volta.
      8. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% per una rapida disidratazione e aspirare l'etanolo dopo 3 minuti.
         NOTA: I campioni macchiati possono essere conservati a lungo dopo la sigillatura con xilene e balsamo neutro.

Risultati

Questo articolo include i protocolli di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per produrre lentivirus di fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta di fibroblasti a melanociti e protocolli per lo screening per i fattori di trascrizione e la riprogrammazione diretta dei melanociti dai MEF.

Il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l'intensità di fluorescenza della GFP (Figura 1A) o mediante c...

Discussione

La qualità del virus è cruciale per il successo della riprogrammazione diretta ai melanociti in questo protocollo. Il metodo di confezionamento e concentrazione dei virus in questo protocollo è semplice e facile da ripetere e non si basa su nessun altro reagente concentrato ausiliario. Questo protocollo può essere seguito con successo nella maggior parte dei laboratori. Per garantire la qualità del virus concentrato, i seguenti punti richiedono un'attenzione speciale. Uno è lo stato della cella di HEK-293T. Sebbene...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT