Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты

Резюме

Здесь мы описываем оптимизированную систему прямого перепрограммирования меланоцитов и высокоэффективную, концентрированную систему упаковки вирусов, которая обеспечивает плавное прямое перепрограммирование.

Аннотация

Потеря функции меланоцитов приводит к витилиго, что серьезно сказывается на физическом и психическом здоровье пораженных лиц. В настоящее время не существует эффективного долгосрочного лечения витилиго. Поэтому крайне важно разработать удобное и эффективное лечение витилиго. Технология регенеративной медицины для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, по-видимому, является многообещающим новым методом лечения витилиго. Это включает в себя прямое перепрограммирование клеток кожи пациента в функциональные меланоциты, чтобы помочь улучшить потерю меланоцитов у пациентов с витилиго. Однако этот метод необходимо сначала протестировать на мышах. Хотя прямое перепрограммирование широко используется, нет четкого протокола для прямого перепрограммирования в меланоциты. Более того, количество доступных факторов транскрипции ошеломляет.

Здесь представлен протокол концентрированной системы упаковки лентивируса для получения факторов транскрипции, выбранных для перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, включая Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) были инфицированы концентрированным лентивирусом для всех этих факторов транскрипции для прямого перепрограммирования MEF в индуцированные меланоциты (iMels) in vitro. Кроме того, эти факторы транскрипции были проверены, и система была оптимизирована для прямого перепрограммирования на меланоциты. Экспрессия характерных маркеров меланина в iMels на уровне гена или белка была значительно повышена. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты может стать успешной новой терапевтической стратегией при витилиго и подтвердить механизм развития меланоцитов, что обеспечит основу для дальнейшего прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты in vivo.

Введение

Витилиго – это кожное заболевание, которое серьезно влияет на физическое и психическое здоровье пострадавших лиц. По разным причинам, включая метаболические нарушения, окислительный стресс, генерацию медиаторов воспаления, отслойку клеток и аутоиммунный ответ, функциональные меланоциты теряются, а секреция меланина прекращается, что приводит к развитию витилиго ^1,2. Это состояние встречается широко и особенно проблематично на лице. Основным методом лечения является системное применение кортикостероидов и иммуномодуляторов. Фототерапия может быть использована при системных или местных заболеваниях, и существуют хирургические методы лечения, такие как перфорированная трансплантация кожи и аутологичная трансплантация меланоцитов ^3,4,5. Однако пациенты, которые используют медикаментозную терапию и фототерапию, склонны к рецидивам, и эти методы лечения имеют слабые долгосрочные терапевтические эффекты. Хирургическое лечение травматично и только умеренно эффективно ^2,6. Поэтому при витилиго необходима новая и эффективная терапевтическая стратегия.

Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) возвращает эти клетки из их терминального состояния в плюрипотентное состояние, процесс, опосредованный факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc⁷. Однако из-за возможности опухолегенности и длительного времени производства эта технология была встречена со скептицизмом при применении в клинических условиях⁸. Прямое перепрограммирование - это технология, которая заставляет один тип терминальной ячейки превращаться в другой тип терминальной ячейки⁹. Этот процесс достигается подходящими факторами транскрипции. Различные клетки уже были успешно перепрограммированы, включая кардиомиоциты¹⁰, нейроны¹¹ и кохлеарные волосковые клетки¹². Некоторые исследователи даже перепрограммировали ткань кожи непосредственно на месте, которая может быть использована для заживления ран¹³. Преимущества прямого перепрограммирования включают сокращение времени ожидания и затрат, более низкий риск развития рака, меньше этических проблем и лучшее понимание механизма, лежащего в основе определения судьбы клеток⁹.

Хотя метод прямого перепрограммирования широко используется, в настоящее время нет определенного метода прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, особенно из-за многочисленных факторов транскрипции, которые следует считать^14,15. Факторы транскрипции, Mitf, Sox10 и Pax3, были использованы для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты¹⁴. Напротив, комбинация MITF, PAX3, SOX2 и SOX9 также использовалась для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты человека в другом исследовании¹⁵. В этом протоколе, несмотря на использование другого метода скрининга, тот же результат был получен с комбинацией Mitf, Sox10 и Pax3 для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, как описано ранее¹⁴. Разработка системы для генерации меланоцитов из других клеток кожи может обеспечить схему преобразования других клеток кожи пациентов с витилиго в меланоциты. Следовательно, крайне важно построить простой и эффективный метод для этого прямого перепрограммирования для успешной генерации меланоцитов.

протокол

Эта работа была одобрена Комитетом по управлению и использованию лабораторных животных в Университете Цзянсу (UJS-IACUC-AP--20190305010). Эксперименты проводились в строгом соответствии со стандартами, установленными Международной ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC International). Не было никаких экспериментов с участием людей, поэтому эта работа не нуждалась в одобрении комитета по этике исследований человека. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах.

1. Построение концентрированной лентивирусной упаковочной системы для транскрипционных факторов

1. Производство концентрированного вируса (рисунок 1A, B)
   1. Пластина 1,5 × 10⁶ клеток HEK-293T в 60-миллиметровую чашку и культивируют эти клетки с нормальной средой (см. Таблицу 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вирус необходимо упаковать партиями, можно использовать чашку для культивирования клеток толщиной 100 мм (подробнее см. таблицу 2).
   2. Через 24 ч убедиться, что клетки HEK-293T достигли 80-90% слияния в день трансдукции, и заменить среду 3,5 мл DMEM (150 мкл DMEM на 1^см2). Оставьте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замещающая среда должна быть без сыворотки, чтобы клетки могли быть «голодными» для лучшей трансфекции плазмид.
   3. Готовят смесь плазмид (смесь А), содержащую 3 мкг плазмид-мишеней Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 или Snai2; 1 мкг упаковки плазмиды PMD2. G, и 2 мкг упаковочной плазмиды PSPAX2. Восполнить объем смеси А до 150 мкл с DMEM без сыворотки. Подготовьте смесь трансфекционного реагента (смесь В) путем добавления 12 мкл трансфекционного реагента (объем в два раза превышает общую массу всех плазмид) и восполните объем смеси В до 150 мкл с DMEM без сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смесей важно медленно добавлять жидкость, чтобы избежать пузырьков воздуха.
   4. Смешайте смесь А и перемешайте В, дав им постоять 5 мин при комнатной температуре. Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 20-30 мин с образованием трансфекционного комплекса.
   5. Выньте клетки HEK-293T из инкубатора, замените среду DMEM + 2% FBS, добавьте смесь со стадии 1.1.4 по каплям и аккуратно перемешайте жидкость.
   6. Через 8 ч изменить среду на 3,5 мл нормальной среды. После смены среды собирают вирусный супернатант каждые 24 ч и 48 ч.
   7. Смешайте супернатанты вируса, собранные в двух разных временных точках. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С. Пропустите супернатант через фильтры 0,45 мкм и соберите его в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, собранный через 24 ч, можно хранить при 4 °C и смешивать с вирусом, собранным через 48 ч.
   8. Концентрировать супернатант вируса путем центрифугирования при 6000 × г при 4 °C в течение ночи (~16 ч). Убедитесь, что гранула вируса видна в нижней части конической трубки после центрифугирования.
   9. Выливайте супернатант медленно. Растворить вирусную гранулу в объеме нормальной среды, который составляет 1/^100-ю объема супернатанта вируса. Используя микропипетку P1000, пипетку осторожно вверх и вниз до получения однородной смеси. Разделите концентрированный вирус на микроцентрифужные трубки по мере необходимости. Хранить при температуре −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус концентрируется 100x с помощью этого метода. Концентрированный вирус (100x) может храниться >1 год при −80 °C. Избегайте повторного замораживания и оттаивания вируса.
2. Обнаружение концентрированного титра вируса (рисунок 1С)
   1. Пластина 1 × 10⁵ ячеек HEK-293T в одну скважину из 6-луночной пластины. Не забудьте добавить один из них в качестве отрицательного элемента управления. Культивируйте эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.
   2. Добавляют 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса (100x) в каждую лунку через 24 ч и добавляют 4 нг/мкл катионного полимерного трансфекционного реагента в каждую лунку. Примерно через 8-12 ч после заражения замените среду нормальной средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности и эффективности обнаружения флуоресценции уровень инфицирования должен составлять 10-30%. Добавление 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса может поддерживать эффективность инфекции в этом диапазоне. Концентрированный титр вируса может достигать 1 × 10⁸ преобразовательных единиц (TU)/мл не менее.
   3. Примерно через 48 ч после заражения вымойте посуду 1 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для удаления мертвых клеток.
   4. Трипсинизируют эти клетки, используя 250 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в 6-луночной пластине в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, а затем удаляют надосадочное вещество.
   5. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS, добавляют суспензию в 5 мл полистирольной трубки круглого дна и обнаруживают инфекционную эффективность флуоресценции вируса (зеленый флуоресцентный белок, GFP⁺) с помощью проточной цитометрии.
   6. Рассчитайте титр концентрированного вируса, используя следующую формулу: 10⁵ (клеточный объем) × уровень инфицирования (GFP⁺%)/добавленный объем вируса (0,1 мкл или 0,2 мкл).

2. Прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты (рисунок 2А)

1. Обмазывайте одну лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины 1 мл 0,1% раствора желатина при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Убедитесь, что скважина полностью покрыта 0,1% раствором желатина. Аспирировать 0,1% раствор желатина после нанесения покрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят 0,1% раствор желатина (100 мл) следующим образом: 0,1 г желатинового порошка растворяют в 100 мл сверхчистой воды в автоклавном стеклянном флаконе и затем хранят при 4 °C не более 2 месяцев.
2. Пластина 5 × 10⁴ MEF в одну лунку из 6-луночной пластины, покрытой 0,1% желатина (как на стадии 2.1), и культивировать эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение ночи.
3. Через 24 ч подтвердите, что МЭФ достигли 40-50% слияния. Замените среду обычной средой.
4. На 0-й день достаньте концентрированный вирус из морозильной камеры и растопите вирус на льду. Рассчитайте объем добавляемого вируса с помощью экв. (1). Добавьте концентрированный вирус для шести факторов транскрипции, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 и Snai2 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину в соответствии с расчетным объемом, а затем добавьте 4 мкг/мл катионного полимерного трансфекционного агента.
   Количество клеток (5 × 10⁴) × 30 (множественность инфекции, MOI)/титр вируса (1)
5. На 1-й день, через 8-12 ч после заражения, удалите среду, содержащую вирус, и замените ее свежей нормальной средой, добавив 0,5 мкг / мл пуромицина для скрининга стабильных инфицированных клеточных линий.
6. На 2-й день, через 48 ч после заражения, замените надпочивающую среду постепенно средой перепрограммирования. Во-первых,^{измените} 1/4 от общего объема среды и добавьте 3 мкм CHIR99021.
7. С 3 по 7 день, в зависимости от состояния клеток, изменяют среду путем замены более высокой долей перепрограммирующей среды (см. табл. 1) постепенно, и переходят на полную перепрограммирующую среду в течение 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого периода пуромицин и CHIR99021 должны использоваться каждый день. Многие мертвые клетки появятся на первый и второй день смены среды перепрограммирования. Это нормально, так как клетки постепенно адаптируются к трансформации. Поэтому среду необходимо менять постепенно, чтобы обеспечить здоровую пролиферацию клеток.
8. Для прохождения клеток добавляют 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА для переваривания клеток в течение 3 мин при комнатной температуре. Когда ~ 60% клеток всплывут, остановите пищеварение, добавив нормальную среду в 2 раза больше объема пищеварительного фермента. Собрать клеточную суспензию в 15 мл стерильной конической трубки, центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, удалить надосадочный агент, повторно суспендировать клеточную гранулу с перепрограммирующей средой и наложить ячейки в 60 мм стерильную посуду при плотности 3 × 10⁴/^см2. Культивируйте эти клетки при 37 °C в увлажненном 5%_CO2 инкубаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С 8-го по 21-й день эти клетки субкультурируют каждые 3-5 дней и культивируют в 60-миллиметровых стерильных блюдах для расширения. Их можно культивировать, чтобы достичь по крайней мере прохода 5.

3. Оптимизация для прямого перепрограммирования и идентификации

1. Скрининг оптимизированных факторов транскрипции
   1. Повторите шаги 2.1-2.7, каждый раз уменьшая один из шести факторов транскрипции. Заразить MEF вирусом комбинациями пяти факторов транскрипции.
   2. Через семь дней после заражения извлеките РНК этих клеток¹⁶ и проанализируйте уровни экспрессии их меланоцитарных генов с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)¹⁷ для скрининга факторов транскрипции с наибольшим влиянием на превращение в меланоциты, удаляя их один за другим (рисунок 3A).
   3. Используйте три основных фактора транскрипции, влияющих на превращение в меланоциты, чтобы заразить MEF. Повторите шаги 2.1–2.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через семь дней после заражения меланоцитарные гены должны быть обнаружены в этих трансформированных клетках (рисунок 3B). Информация о грунтовке для характеристики iMels приведена в таблице 3.
2. Идентификация индуцированных меланоцитов (iMels)
   1. Используйте иммунофлуоресцентное окрашивание¹⁸ для проверки того, что iMels экспрессируют меланоцитарные белки, включая TYRP-1 и DCT (фиг.4A).
   2. Меланин-специфическое окрашивание 3,4-дигидроксифенилаланином (DOPA) (рисунок 4B)
      1. Готовят 4% параформальдегид (10 мл) следующим образом: растворяют 0,4 г порошка параформальдегида в 10 мл PBS. Поместите раствор в духовку при температуре 56 °C в течение 2 ч, чтобы способствовать растворению.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C не более одного месяца.
      2. Выращивайте iMels в посуде толщиной 30 мм и дважды мойте ее предварительно подогретым PBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать клетки в течение 20 минут, и вымойте посуду 3 раза PBS.
      3. Приготовьте 0,1% раствор для окрашивания DOPA (10 мл) непосредственно перед использованием, растворив 0,01 г порошка L-DOPA в 10 мл PBS. Поместите раствор на водяную баню при 37 °C в течение 30 мин; встряхните его несколько раз, чтобы способствовать растворению.
      4. Добавить 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора для окрашивания DOPA. Инкубировать в духовке при 37 °С в течение 2-5 ч. Если нет коричнево-черных частиц, продолжайте инкубировать при 37 °C еще 2 ч, но не в течение >5 ч. Проверяйте образцы каждые 30 минут.
      5. Мойте посуду 3 раза PBS в течение 1 мин каждый раз. Окрашивают ядро 1 мл раствора для окрашивания гематоксилина в течение 2 мин.
      6. Для длительного хранения обезвоживайте образцы, используя 95% этанол в течение 3 мин, а затем 100% этанол в течение 5 мин. Запечатайте блюдо ксилолом и нейтральным бальзамом.
   3. Меланин-специфическое окрашивание Массона-Фонтана (рисунок 4B)
      1. Пластину iMels в тарелку 30 мм и зафиксировать ячейки с 4% параформальдегидом в течение 20 мин; вымойте посуду 3 раза PBS.
      2. Добавьте 1 мл раствора А (раствора аммиачного серебра) из набора окрашивания Masson-Fontana (см. Таблицу материалов), поместите блюдо в темную коробку и поместите темную коробку в духовку при 56 °C на 15-40 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если коричнево-черные частицы не видны через 15 мин в духовке, верните образцы в духовку с температурой 56 °C для продолжения инкубации, но не в течение >40 мин. Немного воды можно добавить в темный ящик, чтобы предотвратить высыхание.
      3. Аспирировать раствором А и промыть посуду 5-6 раз дистиллированной водой, по 1-2 мин каждый раз.
      4. Добавить 1 мл раствора В (гипо-раствор) из набора для окрашивания Массон-Фонтана и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
      5. Аспирировать раствором В и промыть посуду водопроводной водой 3 раза по 1 мин каждый раз.
      6. Добавить 1 мл раствора С (нейтральный красный краситель) из набора для окрашивания Masson-Fontana, и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
      7. Аспирировать раствор С и промыть посуду 3 раза дистиллированной водой, по 1 мин каждый раз.
      8. Добавьте 1 мл 100% этанола для быстрого обезвоживания и аспирируйте этанол через 3 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы могут храниться в течение длительного времени после герметизации ксилолом и нейтральным бальзамом.

Результаты

Данная статья включает протоколы концентрированной лентивирусной упаковочной системы для получения лентивируса факторов транскрипции для прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты и протоколы скрининга факторов транскрипции и прямого перепрограммирования меланоцит?...

Обсуждение

Качество вируса имеет решающее значение для успеха прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе. Способ упаковки и концентрирования вирусов в этом протоколе прост и легко повторяется и не опирается на какой-либо другой вспомогательный концентрированный реагент. Этот ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT