תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

Summary

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

Abstract

אובדן התפקוד של מלנוציטים מוביל vitiligo, אשר משפיע ברצינות על הבריאות הפיזית והנפשית של האנשים המושפעים. כיום, אין טיפול יעיל לטווח ארוך עבור vitiligo. לכן, זה הכרחי לפתח טיפול נוח ויעיל עבור vitiligo. טכנולוגיית רפואה רגנרטיבית לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים נראית כטיפול חדשני ומבטיח בויטיליגו. זה כרוך בתכנות מחדש ישיר של תאי העור של המטופל למלנוציטים תפקודיים כדי לעזור למתן את אובדן המלנוציטים בחולים עם ויטיליגו. עם זאת, שיטה זו צריכה להיבדק תחילה על עכברים. למרות שתכנות מחדש ישיר נמצא בשימוש נרחב, אין פרוטוקול ברור לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. יתר על כן, מספר גורמי השעתוק הזמינים הוא מכריע.

כאן, פרוטוקול מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus מוצג כדי לייצר גורמי שעתוק שנבחרו לתכנות מחדש של תאי עור למלנוציטים, כולל Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ו- Snai2. פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) נדבקו בנגיף הלנטי המרוכז עבור כל גורמי השעתוק הללו לתכנות מחדש ישיר של ה-MEFs למלנוציטים מושרים (iMels) במבחנה. יתר על כן, גורמי שעתוק אלה נבדקו, והמערכת הותאמה לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. הביטוי של הסמנים האופייניים של מלנין ב- iMels ברמת הגן או החלבון היה מוגבר באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה ומוצלחת עבור ויטיליגו ולאשר את המנגנון של התפתחות מלנוציטים, אשר יספק את הבסיס לתכנות מחדש ישיר נוסף של פיברובלסטים למלנוציטים in vivo.

Introduction

ויטיליגו היא מחלת עור המשפיעה קשות על בריאותם הגופנית והנפשית של האנשים המושפעים. מסיבות שונות, כולל הפרעות מטבוליות, עקה חמצונית, יצירת מתווכים דלקתיים, ניתוק תאים ותגובה אוטואימונית, המלנוציטים התפקודיים הולכים לאיבוד, והפרשת המלנין נעצרת, מה שמוביל להתפתחות של ויטיליגו ^1,2. מצב זה מתרחש באופן נרחב והוא בעייתי במיוחד על הפנים. הטיפול העיקרי הוא שימוש סיסטמי בקורטיקוסטרואידים ובאימונומודולטורים. פוטותרפיה יכולה לשמש למחלות סיסטמיות או מקומיות, וישנם טיפולים כירורגיים, כגון השתלת עור מחורר והשתלת מלנוציטים אוטולוגית ^3,4,5. עם זאת, חולים המשתמשים בטיפול תרופתי ובפוטותרפיה נוטים להישנות, ולטיפולים אלה יש השפעות טיפוליות ארוכות טווח גרועות. הטיפול הכירורגי הוא טראומטי ויעיל למדי רק ^2,6. לכן, יש צורך באסטרטגיה טיפולית חדשה ויעילה עבור ויטיליגו.

התכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הופך את התאים האלה ממצבם הסופי למצב פלוריפוטנטי, תהליך המתווך על ידי גורמי השעתוק, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc⁷. עם זאת, בשל האפשרות של גידולים סרטניים וזמן הייצור הארוך, טכנולוגיה זו נתקלה בספקנות כאשר יושמה על הגדרות קליניות⁸. תכנות מחדש ישיר הוא טכנולוגיה שגורמת לסוג אחד של תא סופני להפוך לסוג אחר של תא סופני⁹. תהליך זה מושג על ידי גורמי שעתוק מתאימים. תאים שונים כבר תוכננו מחדש ישירות בהצלחה, כולל קרדיומיוציטים¹⁰, נוירונים¹¹ ותאי שיער שבלול¹². חלק מהחוקרים אף תיכנתו מחדש את רקמת העור ישירות באתרה, שיכולה לשמש לתיקון^{פצעים 13}. היתרונות של תכנות מחדש ישיר כוללים זמני המתנה ועלויות מופחתים, סיכון נמוך יותר לסרטן, פחות בעיות אתיות והבנה טובה יותר של המנגנון העומד בבסיס קביעת גורל התא⁹.

למרות ששיטת התכנות מחדש הישירה נמצאת בשימוש נרחב, אין כיום שיטה מוגדרת לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים, במיוחד בגלל גורמי השעתוק הרבים להיחשב^14,15. גורמי השעתוק, Mitf, Sox10 ו-Pax3, שימשו לתכנות מחדש ישיר של תאי העור למלנוציטים¹⁴. לעומת זאת, השילוב של MITF, PAX3, SOX2 ו-SOX9 שימש גם לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים אנושיים במחקר אחר¹⁵. בפרוטוקול זה, למרות השימוש בשיטת סינון שונה, אותה תוצאה הושגה עם השילוב של Mitf, Sox10 ו- Pax3 לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים כפי שתואר קודם לכן¹⁴. פיתוח מערכת ליצירת מלנוציטים מתאי עור אחרים יכול לספק תוכנית להפיכת תאי עור אחרים של חולי ויטיליגו למלנוציטים. לפיכך, חיוני לבנות שיטה פשוטה ויעילה לתכנות מחדש ישיר זה כדי ליצור מלנוציטים בהצלחה.

Protocol

עבודה זו אושרה על ידי הוועדה לניהול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגסו (UJS-IACUC-AP--20190305010). הניסויים בוצעו תוך הקפדה על התקנים שנקבעו על ידי האגודה להערכה והסמכה של ארגון המחקר הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC International). לא היו ניסויים שבהם היו מעורבים בני אדם, ולכן עבודה זו לא הייתה זקוקה לאישור ועדת האתיקה של המחקר האנושי. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים.

1. בניית מערכת אריזה מרוכזת של נגיף הלנטי לגורמי שעתוק

1. ייצור הנגיף המרוכז (איור 1A, B)
   1. צלחת 1.5 × 10⁶ תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מ"מ ותרבית תאים אלה עם תווך רגיל (ראה טבלה 1) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂.
      הערה: אם יש צורך לארוז את הנגיף בקבוצות, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאים של 100 מ"מ (לפרטים, ראו טבלה 2).
   2. לאחר 24 שעות, ודא שתאי HEK-293T הגיעו למפגש של 80-90% ביום ההעתקה, והחלף את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM (150 μL של DMEM לכל 1 ס"מ²). השאירו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך שעתיים.
      הערה: המדיום החלופי חייב להיות נטול סרום, כך שניתן יהיה "להרעיב" את התאים כדי לשפר את טרנספקציה של פלסמיד.
   3. הכן את התערובת של פלסמידים (תערובת A) המכילה 3 מיקרוגרם של פלסמידי המטרה של Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 או Snai2; 1 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PMD2. G, ו-2 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PSPAX2. הוסיפו את הנפח של תערובת A עד 150 μL עם DMEM ללא סרום. מכינים את התערובת של ריאגנט הטרנספקציה (תערובת B) על ידי הוספת 12 μL של מגיב הטרנספקציה (הנפח כפול מהמסה הכוללת של כל הפלסמידים), ומרכיבים את נפח התערובת B עד 150 μL עם DMEM ללא סרום.
      הערה: בעת הכנת התערובות, חשוב להוסיף נוזל לאט כדי למנוע בועות אוויר.
   4. ערבבו את תערובת A וערבבו את B לאחר שאפשרו להם לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות כדי ליצור את קומפלקס הטרנספקציה.
   5. הוציאו את תאי HEK-293T מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM + 2% FBS, הוסיפו את התערובת משלב 1.1.4 בצורה טיפתית וערבבו את הנוזל בעדינות.
   6. לאחר 8 שעות, לשנות את המדיום עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאחר שינוי המדיום, לאסוף את supernatant הנגיף כל 24 שעות ו 48 שעות.
   7. ערבבו את חומרי העל של הנגיף שנאספו בשתי נקודות זמן שונות. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנט דרך מסנני 0.45 מיקרומטר ואוספים אותו בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן את הנגיף שנאסף בשעה 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולערבב אותו עם הנגיף שנאסף בשעה 48 שעות.
   8. רכז את הווירוס סופרנאטנט על ידי צנטריפוגה ב 6000 × גרם ב 4 °C בלילה (~ 16 שעות). ודא שכדור הווירוס נראה בתחתית הצינור החרוטי לאחר הצנטריפוגה.
   9. שופכים את ה-supernatant לאט. ממיסים את כדור הנגיף בנפח של מדיום תקין שהוא 1/100^th מנפח ה-supernatant של הנגיף. באמצעות מיקרופיפט P1000, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות מיקרוצנטריפוגה לפי הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של −80 °C (80 °F).
      הערה: הנגיף מרוכז פי 100 בשיטה זו. ניתן לאחסן את הנגיף המרוכז (100x) במשך שנה >1 בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של הנגיף.
2. זיהוי של טיטר וירוסים מרוכז (איור 1C)
   1. צלחת 1 × 10⁵ תאי HEK-293T לבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות. זכור להוסיף אחד טוב כמו שליטה שלילית. תרבית תאים אלה עם תווך נורמלי ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO₂.
   2. הוסף 0.1 μL או 0.2 μL של נגיף מרוכז פלואורסצנטי (100x) לכל באר לאחר 24 שעות, והוסף 4 ng/μL של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר. כ 8-12 שעות לאחר ההדבקה, להחליף את המדיום עם בינוני נורמלי.
      הערה: כדי להבטיח את הדיוק והיעילות של זיהוי הפלואורסצנציה, שיעור ההדבקה חייב להיות 10-30%. הוספת 0.1 μL או 0.2 μL של הנגיף המרוכז פלואורסצנטי יכולה לשמור על יעילות הזיהום בטווח זה. טיטר הנגיף המרוכז יכול להגיע ל-1 × 10⁸ יחידות התמרה (TU)/mL לפחות.
   3. כ-48 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבנית ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים.
   4. נסה את התאים האלה באמצעות 250 μL של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר בצלחת של 6 בארות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C ולאחר מכן להסיר את supernatant.
   5. בצעו החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של PBS, הוסיפו את ההשעיה לצינור בעל תחתית עגולה של פוליסטירן 5 מ"ל, וזהו את יעילות הזיהום של הפלואורסצנציה של הנגיף (חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP⁺) באמצעות ציטומטריה של זרימה.
   6. חשב את טיטר הנגיף המרוכז באמצעות הנוסחה הבאה: 10⁵ (נפח תא) × שיעור ההדבקה (GFP⁺%)/נפח הנגיף המוסף (0.1 μL או 0.2 μL).

2. תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים (איור 2A)

1. מצפים באר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. ודא כי הבאר מכוסה לחלוטין עם תמיסת ג'לטין 0.1%. שאפו לתמיסת הג'לטין 0.1% לאחר הציפוי.
   הערה: הכינו תמיסת ג'לטין 0.1% (100 מ"ל) באופן הבא: 0.1 גרם אבקת ג'לטין מומסת ב-100 מ"ל של מים אולטרה-אפורים בבקבוק זכוכית אוטו-קליפה ולאחר מכן מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודשיים.
2. צלחת 5 × 10⁴ MEFs לבאר אחת של צלחת 6 בארות המצופה בג'לטין 0.1% (כמו בשלב 2.1), ותרבית תאים אלה עם תווך נורמלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך הלילה.
3. לאחר 24 שעות, לאשר כי MEFs הגיעו 40-50% מפגש. החלף את המדיום במדיום רגיל.
4. ביום 0, מוציאים את הנגיף המרוכז מהמקפיא וממיסים את הנגיף על קרח. חשב את נפח הווירוס שיש להוסיף באמצעות eq. (1). הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ו- Snai2 (ראה טבלת חומרים) לכל באר בהתאם לנפח המחושב, ולאחר מכן הוסף 4 מיקרוגרם /מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרי הקטיוני.
   מספר תא (5 × 10⁴) × 30 (ריבוי זיהום, MOI)/וירוס טיטר (1)
5. ביום הראשון, 8-12 שעות לאחר ההדבקה, הסירו את המדיום המכיל את הנגיף והחליפו אותו במדיום תקין טרי תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין לסינון קווי תאים נגועים יציבים.
6. ביום 2, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את התווך הסופר-נטנטי בהדרגה במדיום התכנות מחדש. ראשית, שנה 1/4^מהנפח הבינוני הכולל, והוסף 3 μM CHIR99021.
7. מיום 3 עד יום 7, בהתאם למצב התאים, שנה את המדיום על ידי החלפה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש (ראה טבלה 1) בהדרגה, ועבור לבינוני תכנות מחדש מלא תוך 5 ימים.
   הערה: במהלך תקופה זו, יש להשתמש בפורומיצין וב- CHIR99021 מדי יום. תאים מתים רבים יופיעו ביום הראשון והשני של שינוי מדיום התכנות מחדש. זה נורמלי מכיוון שהתאים מסתגלים בהדרגה לטרנספורמציה. לכן, המדיום צריך להיות שונה בהדרגה כדי להבטיח את התפשטות בריאה של התאים.
8. כדי להעביר את התאים, הוסיפו 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לעכל את התאים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כ-60% מהתאים צפים למעלה, הפסיקו את העיכול על ידי הוספת מדיום תקין פי 2 מנפח אנזים העיכול. לאסוף את תרחיף התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, להסיר את הסופרנאטנט, להחזיר את גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש, ולצלוח את התאים בצלחת סטרילית של 60 מ"מ בצפיפות של 3 × 10⁴/ס"מ². תרבית תאים אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO₂ של 5% לחות.
   הערה: מהיום ה-8 ועד היום ה-21, תאים אלה עוברים תת-תרבית כל 3-5 ימים ומתרבית במנות סטריליות בקוטר 60 מ"מ כדי להתרחב. הם יכולים להיות מתורבתים כדי להגיע לפחות מעבר 5.

3. אופטימיזציה לתכנות מחדש וזיהוי ישירים

1. סינון לגורמי השעתוק הממוטבים
   1. חזור על שלבים 2.1-2.7, תוך הפחתת אחד מששת גורמי השעתוק בכל פעם. הדביקו את ה-MEFs בנגיף בשילובים של חמישה גורמי שעתוק.
   2. שבעה ימים לאחר ההדבקה, הוציאו את הרנ"א של התאים האלה¹⁶, וניתחו את רמות הביטוי של הגנים המלנוציטיים שלהם באמצעות PCR של שעתוק הפוך (RT-PCR)¹⁷ כדי לסנן את גורמי השעתוק בעלי ההשפעה הגדולה ביותר על ההמרה למלנוציטים על ידי הסרתם בזה אחר זה (איור 3A).
   3. השתמש בשלושת גורמי השעתוק המובילים המשפיעים על ההמרה למלנוציטים כדי להדביק את ה- MEFs. חזור על שלבים 2.1-2.7.
      הערה: שבעה ימים לאחר ההדבקה, הגנים המלנוציטיים צריכים להיות ניתנים לזיהוי בתאים שעברו טרנספורמציה (איור 3B). מידע ראשוני לאפיון iMels כלול בטבלה 3.
2. זיהוי מלנוציטים מושרים (iMels)
   1. השתמשו בכתם אימונופלואורסצנטי¹⁸ כדי לוודא שה-iMels מבטאים חלבונים מלנוציטיים, כולל TYRP-1 ו-DCT (איור 4A).
   2. כתם ספציפי למלנין 3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין (DOPA) ספציפי למלנין (איור 4B)
      1. הכן 4% paraformaldehyde (10 מ"ל) כדלקמן: להמיס 0.4 גרם של אבקת paraformaldehyde ב 10 מ"ל PBS. מניחים את התמיסה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לקדם את הפירוק.
         הערה: הפתרון יכול להישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודש.
      2. מרבים את ה-iMels במנה של 30 מ"מ ושוטפים את המנה פעמיים עם PBS שחומם מראש. מוסיפים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים למשך 20 דקות, ושטפו את המנה 3 פעמים עם PBS.
      3. הכינו תמיסת כתמי DOPA 0.1% (10 מ"ל) ממש לפני השימוש על ידי המסת 0.01 גרם אבקת L-DOPA ב-10 מ"ל של PBS. הניחו את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; לנער אותו מספר פעמים כדי לקדם פירוק.
      4. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת צביעת DOPA 0.1% שהוכנה זה עתה. דגירה בתנור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 שעות. אם אין חלקיקים חומים-שחורים, יש להמשיך לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות, אך לא למשך >5 שעות. בדוק את הדגימות כל 30 דקות.
      5. יש לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS למשך דקה אחת בכל פעם. הכתימו את הגרעין ב-1 מ"ל של תמיסת צביעת המטוקסילין למשך 2 דקות.
      6. לאחסון לטווח ארוך, לייבש את הדגימות באמצעות 95% אתנול במשך 3 דקות ולאחר מכן 100% אתנול למשך 5 דקות. אוטמים את המנה בקסילן ובבלזם נייטרלי.
   3. צביעת מאסון-פונטנה ספציפית למלנין (איור 4B)
      1. צלחת iMels בצלחת 30 מ"מ ולתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות; לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS.
      2. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה A (תמיסת כסף אמוניה) מתוך ערכת הכתמים של מאסון-פונטנה (ראו טבלת חומרים), הניחו את המנה בקופסה כהה והניחו את הקופסה הכהה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15-40 דקות.
         הערה: אם חלקיקים חומים-שחורים אינם נראים לאחר 15 דקות בתנור, החזירו את הדגימות לתנור של 56 מעלות צלזיוס כדי להמשיך לדגר אך לא למשך >40 דקות. ניתן להוסיף מעט מים לקופסה הכהה כדי למנוע התייבשות.
      3. שאפו לפתרון A ושטפו את התבשיל 5-6 פעמים במים מזוקקים, 1-2 דקות בכל פעם.
      4. הוסיפו תמיסה B של 1 מ"ל (היפו תמיסה) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
      5. שאפו לתמיסה B ושטפו את הכלים במי ברז 3 פעמים, דקה בכל פעם.
      6. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה C (צבע אדום נייטרלי) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
      7. שאפו לתמיסה C ושטפו את התבשיל 3 פעמים במים מזוקקים, דקה אחת בכל פעם.
      8. מוסיפים 1 מ"ל של 100% אתנול להתייבשות מהירה, ושואפים את האתנול לאחר 3 דקות.
         הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות במשך זמן רב לאחר איטום עם קסילן ובלסם נייטרלי.

תוצאות

מאמר זה כולל את הפרוטוקולים של מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus לייצור lentivirus של גורמי שעתוק לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים ופרוטוקולים לסינון גורמי שעתוק ותכנות מחדש ישיר של מלנוציטים מ- MEFs.

ההצלחה של ייצור לנטי-וירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנט...

Discussion

איכות הנגיף חיונית להצלחת התכנות מחדש הישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה. השיטה של אריזה וריכוז וירוסים בפרוטוקול זה היא פשוטה וקלה לחזרה ואינה מסתמכת על כל מגיב מרוכז עזר אחר. פרוטוקול זה ניתן לעקוב בהצלחה ברוב המעבדות. כדי להבטיח את איכות הנגיף המרוכז, הנקודות הבאות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT