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摘要

该协议详细介绍了从 委内瑞拉链霉菌 无细胞转录翻译（TX-TL）系统合成高产量重组蛋白的增强方法。

摘要

链霉菌 属是临床抗生素和工业化学品的主要来源。 委内瑞拉链霉菌 ATCC 10712是一种快速生长的菌株，是氯霉素，jadomycin和pikromycin的天然生产者，这使其成为下一代合成生物学底盘的有吸引力的候选者。因此，加速 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712以及其他 链霉菌 属模型开发的遗传工具对于天然产物工程和发现是非常理想的。为此，该方案提供了专用 的委内瑞拉链球菌 ATCC 10712无细胞系统，以实现高G + C（%）基因的高产异源表达。该方案适用于96孔或384孔板形式的小规模（10-100μL）间歇反应，而反应可能可扩展。无细胞系统坚固耐用，可以在最小的设置中实现一系列重组蛋白的高产量（约5-10 μ M）。这项工作还结合了广泛的质粒工具集，用于实时测量mRNA和蛋白质合成，以及标记蛋白质的凝胶内荧光染色。该方案还可以与高通量基因表达表征工作流程或研究放线菌基因组中存在的高G + C（%）基因的酶途径相结合。

引言

无细胞转录-翻译 （TX-TL） 系统为合成生物学提供了一个理想的原型设计平台，以实现快速的设计-构建-测试-学习周期，这是合成生物学的概念工程框架1。此外，人们对在开放反应环境中用于高价值重组蛋白生产的 TX-TL 系统的兴趣日益浓厚，例如，在抗体-药物偶联物中掺入非标准氨基酸3。具体而言，TX-TL需要细胞提取物，质粒或线性DNA以及能量溶液来催化批量或半连续反应中的蛋白质合成。虽然 大肠 杆菌 TX-TL 是主要的无细胞系统，但许多新兴的非型号 TX-TL 系统已引起不同应用的关注4，5，6，7，8。TX-TL 的主要优势包括灵活的可扩展性（纳升至升级）9，10、强大的再现性和自动化工作流程8、11、12。特别是，TX-TL的自动化允许加速遗传部分和调节元件的表征8，12，13。

在反应设置方面，TX-TL需要一次和二次能量源，以及氨基酸，辅因子，添加剂和模板DNA序列。核苷酸三磷酸盐（NTPs）为驱动初始mRNA（ATP，GTP，CTP和UTP）和蛋白质合成（仅ATP和GTP）提供了主要能量来源。为了提高TX-TL产量，NTP通过二次能源的分解代谢再生，例如麦芽糖14，麦芽糖糊精15，葡萄糖14，3-磷酸甘油酯（3-PGA）16，磷酸烯醇丙酮酸盐17和L-谷氨酸18。这种固有的代谢活动令人惊讶地具有多功能性，但研究很少，特别是在新兴的TX-TL系统中。每种能源在ATP产率、化学稳定性和成本方面都有不同的性质和优势，这是扩大TX-TL反应的重要考虑因素。到目前为止，目前 大肠杆菌 TX-TL的方案对于模型绿色荧光蛋白（GFP）已达到4.0mg / mL（~157μM），使用3-PGA（30mM），麦芽糖糊精（60mM）和D-核糖（30 mM）的混合物作为二次能量源19。

最近，人们对研究TX-TL系统中的二次代谢物生物合成途径的兴趣日益浓厚20，21，22。具体而言，放线菌是继发代谢物的主要来源，包括抗生素和农药23，24。他们的基因组富含所谓的生物合成基因簇（BGC），其编码二次代谢物生物合成的酶途径。为了研究放线菌遗传部分和生物合成途径，最近开发了一系列基于链霉菌的TX-TL系统5，6，25，26。这些专门的链霉菌TX-TL系统具有潜在的益处，原因如下:[1]为链霉菌spp.26的酶提供天然蛋白质折叠环境;[2] 获得高G+C（%）基因表达的最佳tRNA库;[3]活跃的初级代谢，可能被劫持以提供生物合成前体;和[4]提供天然细胞提取物中存在的二次代谢的酶，前体或辅因子。因此，最近建立了一个高收益的 S.venezuelae TX-TL 工具包来利用这些独特的功能5。

委内瑞拉链霉菌 是合成生物学的新兴宿主，在工业生物技术领域具有丰富的历史5，27，28，29 ，并作为研究放线菌细胞分裂和遗传调控的模型系统30，31，32。主要类型菌株 S. venezuelae ATCC 10712具有相对较大的基因组，为8.22 Mb，G + C含量为72.5%（加入号:CP029197），编码7377个编码序列，21个rRNA，67个tRNA和30个生物合成基因簇27。在合成生物学中， S. venezuelae ATCC 10712是生物合成途径异源表达的有吸引力的底盘。与大多数其他 链霉菌 染色剂不同，它提供了几个关键优势，包括快速的倍增时间（约40分钟），广泛的遗传和实验工具5，28，缺乏菌丝结块以及在液体培养基中孢子28，33。一些研究还证明了 委内瑞拉链球菌 用于多种次级代谢物的异源生产，包括聚酮类，核糖体和非核糖体肽34，35，36，37，38。这些组合特征使该菌株成为合成生物学和代谢工程应用的有吸引力的微生物宿主。虽然 委内瑞拉链球菌 不是异源基因表达的主要 链霉菌 模型，但随着进一步的发展，它已准备好在天然产物发现中得到更广泛的应用。

本手稿介绍了高产委内瑞拉链球菌 TX-TL 系统的详细实验方案（图 1），该系统已从先前发表的原始协议进行了更新26。在这项工作中，能量溶液和反应条件已经过优化，使用标准质粒pTU1-A-SP44-mScarlet-I，在4小时，10μL间歇反应中将mScarlet-I报告蛋白的蛋白质产量提高到260μg/mL。该质粒经过专门设计，可实现检测蛋白质表达的各种方法。该协议也得到了简化，而能源系统已经过优化，以降低建立无细胞反应的复杂性和成本，而不会影响产量。除了优化的TX-TL系统外，还开发了一个遗传部分库，用于微调基因表达，并作为实时监测TX-TL的荧光工具，从而为链霉菌属和相关放线菌的基因表达和天然产物生物合成途径原型化创建了一个多功能平台。

在这项工作中，推荐的标准质粒（pTU1-A-SP44-mScarlet-I）可用于在新实验室中建立委内瑞拉链球菌TX-TL工作流程，并且可以在AddGene上使用（参见补充表S1）。pTU1-A-SP44-mScarlet-I为用户提供了研究其他开放式阅读框架（ORF）的灵活性。mScarlet-I ORF是针对委内瑞拉链球菌基因表达而优化的密码子。SP44启动子是一种强的构成性启动子，在大肠杆菌和链霉菌spp.39中均具有高活性。质粒具有两个独特的限制性内切酶位点（NdeI，BamHI），允许使用联合C端FLAG标签和荧光素砷发夹（FlAsH）粘合剂标签系统在框架内对新的ORF进行亚克隆。或者，在亚克隆新基因后，可以通过包含终止密码子来去除这两个标签。使用该碱基载体，已经证明了一系列蛋白质的高产表达，即来自土霉素生物合成途径的蛋白质和来自Streptomyces rimosus的未表征的非核糖体肽合成酶（NRPS）（图2）。在mRNA检测方面，pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒含有dBroccoli适配体（在3'-未翻译区域），用于使用3，5-二氟-4-羟基苄叉亚氮烷（DFHBI）探针进行检测。为了提高灵活性，AddGene上还提供了EcoFlex40兼容MoClo部件的工具集，包括EcoFlex兼容的链霉菌穿梭载体（pSF1C-A-RFP/ pSF2C-A-RFP）和一系列pTU1-A-SP44变体质粒，表达超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），mScarlet-I，mVenus-I和β葡萄糖醛酸酶（GUS）。特别是，pSF1C-A质粒来自pAV-gapdh28，并固化为MoClo组装的BsaI / BsmBI位点。pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP 相当于 EcoFlex40 的 pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP，但包含链霉菌属中偶联和染色体整合的附加功能。使用phiC31整合酶系统28。

该协议的第一阶段涉及 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712或密切相关菌株的生长，中等指数阶段的细胞收获，细胞洗涤步骤以及S30A和S30B缓冲液中的平衡。该阶段需要三天，细胞生长的时间可用于制备剩余的组分，如下所述。然后通过超声处理裂解收获的细胞，澄清并进行径流反应。在制备的最后阶段，可以制备细胞提取物以在-80°C下长期储存，以最大限度地减少活性损失。对于使用此方案组装TX-TL反应，提出了 链霉菌 预混液（SMM），并可选择最小能量溶液格式（MES），可提供相当的产量。此外，建议将 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712的新鲜培养物从-80°C的甘油储备到GYM琼脂平板上，并在28°C下孵育至少48-72小时，直到单个菌落可见。以下步骤应仅使用新鲜培养物。

研究方案

注:有关GYM培养基和琼脂平板以及S30A和S30B洗涤缓冲液的配方，请参见表1和表2。

1. 准备解决方案和一般指导

  1. 制备后将所有溶液，细胞（生长后）和细胞提取物保存在冰上，除非有例外。
  2. 在室温下储存1M Mg-谷氨酸盐，4M K-谷氨酸盐，40%（w / v）PEG 6000，1 g / mL聚乙烯磺酸的库存，以及在-80°C下储存所有其他库存。 尽量减少冻融循环的次数，以避免化学降解。
  3. 对于能量溶液储备（见 表3）如3-PGA（需要pH调节）的制备，请遵循 大肠杆菌 TX-TL协议41中提供的指导。
    注:所有组分均完全溶于ddH 2 O中，并作为等分试样储存在-80°C冰箱中。
  4. 在冰上解冻单个股票或能量溶液（稍后描述）。将氨基酸储备在42°C下加热，涡旋约15-30分钟以溶解所有氨基酸。
  5. 当一些氨基酸（L-Cys，L-Tyr，L-Leu）沉淀在冰上时，同时尽量减少休息时间，将该溶液留在室温下并使用涡旋溶解。
  6. 加入库存溶液和水的计算体积（表3），并使用涡旋充分混合。
  7. 将能量溶液以每管20-100μL等分试样等分，或根据需要在冰上等分，并储存在-80°C直至进一步使用。

2. 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712细胞的制备

  1. 第1天培养基/缓冲液制备和过夜预培养
    1. 在2 L挡板烧瓶中制备1L无菌GYM液体培养基，如 表1所述。请参阅设备/化学/试剂来源 的材料表 。
    2. 在250 mL锥形瓶中制备1 x 50 mL无菌GYM液体培养基，如 表1所述。
    3. 准备100毫升1 M HEPES-KOH pH 7.5，100 mL 1 M MgCl2和500 mL 4 M NH4Cl溶液，以制作1 L S30A和1 L S30B洗涤缓冲液。有关食谱，请参见 表 2 。
    4. 准备过夜的预培养。将无菌的50 mL GYM液体培养基在250 mL锥形瓶中预热至28°C30分钟。
    5. 将来自GYM琼脂平板的单个 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712（或相关菌株）接种到预热的50 mL GYM液体培养基中，并在28°C，200rpm下孵育16小时（过夜预培养）。
  2. 第2天 - 准备白天的预培养和主要成长培养。
    1. 将50 mL无菌健身房液体培养基在250 mL锥形瓶中预热28°C30分钟。
    2. 将1 mL过夜预培养物转移到预热的50 mL GYM液体培养基中，并在28°C，200rpm下孵育8小时（白天预培养）。
    3. 在此生长期之后，在1 mL（1 cm路径长度）塑料比色皿中使用无菌GYM培养基进行1:10稀释，在分光光度计中检查OD600 。
      注意:OD600 应至少达到 3-4。如果生长不良，建议重复步骤2.2.1-2.2.2。
    4. 将0.25 mL日间预培养物分培养到2 L挡板烧瓶中的1 L液体GYM培养基中。
    5. 在28°C，200rpm下摇动过夜14小时。
  3. 第3天 - 收获细胞
    1. 在上一个孵育期（14小时）之后，记录主培养物的OD600 。用新鲜的GYM培养基以1:10稀释过夜培养物，用于OD 600 测量。
      注意:OD600 在此阶段应已达到 3.0-4.0。
    2. 如果OD 600<3.0，则将振荡速度增加到250-300 rpm并生长，直到达到OD 600 3.0。再生长不超过2小时（总共16小时）。
    3. 如果OD 600>3.0，将培养物转移到离心容器中，并在湿冰上快速冷却30分钟。
    4. 在等待细胞培养物在冰上冷却的同时，准备4mL新鲜的1M二硫磷脂醇（DTT），S30A和S30B缓冲液，如 表1所述，并将它们保存在冰上。参见化学/试剂来源 的材料表 。
    5. 预先称量空的50 mL离心管，并在-20°C下预冷。
    6. 在冰上加入2 mL 1 M DTT到1 L S30A缓冲液中并混合均匀。
      注意:仅在使用前将DTT添加到S30A和S30B洗涤缓冲液中。
    7. 在6，000× g，4°C，10分钟下离心细胞，并以快速和单一的运动小心地丢弃上清液。
      注意:如果沉淀受到干扰，请用剩余的GYM培养基最大化细胞保留并继续实验方案。
    8. 加入500mL S30A缓冲液，并通过剧烈摇动离心瓶直到细胞团块均匀分散来重悬细胞。
    9. 将细胞在6，000× g，4°C，6分钟下离心，并小心地丢弃上清液。
      注意:尽管此时细胞沉淀会更坚固，但一些细胞将保持悬浮状态（见 图1）。按照2.3.7中所述进行处理，并保留尽可能多的细胞。
    10. 重复步骤 2.3.8-2.3.9。
    11. 在冰上加入2 mL 1 M DTT到1 L S30B缓冲液中并混合均匀。向细胞中加入500mL S30B缓冲液。重复步骤 2.3.9。
    12. 将细胞沉淀重悬于10mL S30B缓冲液中，并转移到预称量，预冷的50mL离心管中。如果需要，用额外的5-10mL S30B缓冲液转移残留细胞。用 S30B 填充至 50 mL。
    13. 在6，000× g，4°C，10分钟下离心细胞，并小心地丢弃上清液。
    14. 重复步骤 2.3.13。
    15. 用100-200μL移液器小心地吸出剩余的S30B上清液。
    16. 称量湿细胞沉淀。
      注意:1 L过夜健身房培养物（OD 600 = 3.0 ）的典型湿细胞沉淀重量约为4.5g。
    17. 对于每1g湿细胞，加入0.9mL S30B缓冲液。使用巴斯德移液器或涡旋重悬细胞。
    18. 短暂（〜10秒）离心至500× 克 以沉淀细胞。
      注意:此时可以暂停实验方案，细胞可以在液氮或干冰上冷冻并储存在-80°C下。 为了安全起见，在处理液氮时，请穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括面罩和手套。

3.通过超声处理进行细胞裂解，得到粗细胞提取物

注意:在此阶段，用户可以选择通过超声处理以1 mL级分（选项1）或作为更大的细胞悬浮液（5 mL）在50 mL管（选项2）中破坏细胞。下面详细介绍了这两种选择，以确保可重复性，因为细胞悬浮液的最终体积可能由于先前收获和洗涤步骤中细胞的损失而发生变化。新用户应首先尝试选项 2.1 以建立协议。

  1. 通过超声处理 1 mL 级分进行细胞裂解
    1. 使用1 mL移液器吸头（切断吸头末端以增加孔径），将1 mL细胞悬浮液转移到2 mL微量离心管中。
      注意:如果细胞被冷冻，在细胞裂解之前，在温水中快速解冻含有沉淀的50 mL管。一旦颗粒开始解冻，立即将管子转移到湿冰上，并冷却10分钟。
    2. 将每个微量离心管放入冰水烧杯中，使用塑料管架固定管以进行超声处理。
      注意:由于细胞提取物对过热的敏感性，确保管子不升温以防止蛋白质沉淀和酶活性降低至关重要。
    3. 使用尖端直径为3 mm的超声探头，并用70%（v / v）乙醇和双蒸馏水（ddH 2O）清洁。将超声器尖端降低到细胞悬浮液中，直到其低于液体表面约1厘米。
    4. 将以下设置输入声波器:20 kHz频率，65%振幅，10 s脉冲导通时间，10 s脉冲关断时间，1分钟总超声处理时间。
    5. 运行超声处理协议。在前两个静息周期中，将管向上/向下和向侧面移动，以确保细胞均匀超声处理。记录能量输入。
      注意: 为了安全起见，在超声处理过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞被破坏，粘度将降低，苍白的奶油湿细胞沉淀应变成均匀的棕色液体。推荐的能量输入为每mL湿电池240 J。如果细胞仅部分裂解，悬浮液仍将呈现奶油色，具有粘稠的细胞团块，特别是在管的侧面。
    6. 将管倒置2-3次，并重复超声处理一个或两个10秒的循环，频繁混合直到细胞完全被破坏。
  2. 通过超声处理5 mL细胞悬浮液进行细胞裂解
    1. 如果细胞被冷冻，在细胞裂解前在温水中快速解冻含有沉淀的50mL管并摇动。一旦颗粒开始解冻，立即将管子转移到湿冰上，并冷却10分钟。
    2. 以500 x g 短暂旋转管以沉淀细胞。
    3. 将50 mL管放入冰水烧杯中进行超声处理。
      注意:由于细胞提取物对过热的敏感性，确保管子不升温以防止蛋白质沉淀和酶活性降低至关重要。
    4. 使用具有6 mm直径尖端的超声探头，并用70%（v / v）乙醇和ddH2 O清洁（参见 图1中6 mm探头的可视化示意图）。将超声器尖端降低到细胞悬浮液（〜5mL）中，直到它在液体表面以下〜1厘米。
    5. 将以下设置输入声波器:20 kHz 频率、65% 振幅、10 s 脉冲导通时间、10 s 脉冲关断时间、每 mL 湿电池 1 分钟总超声处理时间（总共 5 分钟）。
    6. 运行超声处理协议。在前两个静息周期中，将管向上/向下和向侧面移动，以确保细胞均匀超声处理。
      注意: 为了安全起见，在超声处理过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞的破坏，粘度会降低，苍白的奶油湿细胞沉淀应该变成均匀的棕色液体。记录能量输入。建议最佳能量输入为每mL湿细胞240 J（5分钟超声处理总共约1200 J）。
    7. 如果某些单元格保持不变，请遵循步骤 3.1.5 中的指导。
    8. 将细胞提取物转移到2 mL微量离心管中。

4. 细胞提取物澄清和径流反应

  1. 在4°C下以16，000× g 离心裂解细胞10分钟以除去细胞碎片。将上清液作为1 mL等分试样转移到1.5mL微量离心管中。
  2. 对细胞提取物进行径流反应。将含有细胞提取物的1.5mL管在30°C下在加热块或培养箱上孵育60分钟，无需摇晃。
  3. 将细胞提取物在4°C下以16，000× g 离心10分钟。 将上清液池入15 mL离心管中。通过倒置管五次直到均匀来混合上清液，然后将其保持在冰上。轻轻反转以避免形成气泡。
  4. 用S30B缓冲液将10μL细胞提取物稀释100倍，并使用Bradford测定法测量总蛋白浓度，并进行三次技术重复（参见 补充材料S2 以获得Bradford测定指导）。
  5. 如果蛋白质浓度为20-25mg / mL，则将细胞提取物作为100μL等分试样转移到新的1.5mL管中，在液氮中闪冻，并储存在-80°C。
    注意: 为安全起见，在处理液氮时应穿戴适当的个人防护用品，包括面罩和手套。
  6. 如果蛋白质浓度为<20 mg/mL，重复粗提液制备步骤，以确保高质量的细胞提取物和 TX-TL 产量与先前发表的工作相当5。

5. 质粒DNA模板的制备

  1. 根据制造商的说明，使用适当的质粒DNA纯化试剂盒，从在50 mL LB培养物（含100 mg / mL卡苄青霉素）中生长的新鲜转化的大肠杆菌质粒菌株（DH10β，JM109）中纯化pTU1-A-SP44-mScarlet-I质粒（pUC19来源）。
  2. 将质粒洗脱在2×300μL无核酸酶水中并结合组分。
  3. 加入0.1体积（66μL）的3M乙酸钠（pH 5.2）。
  4. 加入0.7体积（462μL）异丙醇。
  5. 将DNA在-20°C孵育30分钟。
  6. 在4°C下以16，000× g 离心30分钟并弃去上清液。
  7. 向DNA沉淀中加入2mL 70%（v / v）乙醇。
  8. 将试管倒置3-4次以重悬质粒DNA沉淀。
  9. 在4°C下以16，000× g 离心5分钟并弃去上清液。
  10. 重复步骤5.7-5.9并除去所有可见液体。
  11. 用真空离心机风干DNA沉淀10-30分钟或干燥5分钟。
  12. 用600μL无核酸酶的ddH 2 O重悬干燥的沉淀。
  13. 使用分光光度计测量DNA浓度和纯度。
  14. 准备50-100μL等分试样并储存在-20°C。
    注意:由于无细胞反应的体积限制，建议使用500-1000 ng /μL范围内的高DNA浓度。将质粒DNA储备稀释至80 nM;168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I 质粒相当于 80 nM。

6. 链霉菌 预混液（SMM）溶液的制备

  1. 氨基酸溶液
    1. 使用氨基酸采样器套件，按照制造商在线提供的说明，避免手动错误并缩短制备时间。
    2. 使用ddH 2 O将20x氨基酸储备溶液稀释至6mM（5mM L-Leu）的终浓度。
    3. 在2.4x SMM溶液中进一步稀释至 2.4mM（2mM L-Leu）（见 表3）。
      注意:TX-TL反应中的最终浓度为1 mM 19x氨基酸和0.83 mM L-Leu。
  2. 能源解决方案和添加剂
    1. 按照表3中描述的配方制备2.4x SMM溶液中的其他组分。
    2. 或者，按照表3中描述的配方准备2.4倍最小能量溶液（MES）。

7. 建立标准 委内瑞拉链球菌 TX-TL反应

  1. 在冰上解冻细胞提取物， SMM （或 MES）溶液和质粒DNA。将384孔板预冷至-20°C。
  2. 建立TX-TL反应，其中25%的体积是质粒DNA，33.33%是细胞提取物，41.67%是 SMM 溶液;将它们放在冰上以避免开始时间偏差。
    注:提供了标准的TX-TL模板（表4），用于根据反应次数计算所需试剂的体积。33 μL反应的标准体积如下:11μL细胞提取物，13.75μLSMM和8.25μL质粒DNA。
  3. 在低速设置下轻轻涡旋混合物约5秒，以确保溶液均匀。避免起泡/气泡形成。
  4. 将10μL等分试样作为技术一式三份转移到384孔板的三个孔中，而不会引入气泡。用透明盖子密封板，以400× g 旋转5秒。
  5. 在28°C下孵育反应，在培养箱（用于终点读数）或读板器中，无需摇晃。
    注意:反应通常需要3-4小时才能完成。请参阅 补充材料 S2 ，了解读板器和 mScarlet-I 标准测量的指导。

结果

提供该详细实验方案作为示例，以帮助用户建立基于委内瑞拉链球菌ATCC 10712模型菌株的链霉菌TX-TL系统（图1）。用户可以寻求研究其他链霉菌菌株;然而，具有较长倍增时间或不同生长偏好的其他菌株的生长/收获阶段将需要定制优化才能达到峰值结果。对于代表性结果，对来自pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒的mScarlet-I荧光蛋白（图2

讨论

在这份手稿中，描述了一种高收益的委内瑞拉链球菌TX-TL协议，并提供了详细的步骤，这些步骤对于有经验的用户和新用户来说都是直接的。现有链霉菌45和大肠杆菌TX-TL41方案的几个特征已被移除，以建立委内瑞拉链球菌TX-TL5，26的最小但高产量的方案。这里推荐的工作流程是确保委内瑞...

披露声明

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

作者希望感谢以下研究支持:EPSRC [EP/K038648/1] 为SJM提供PSF作为PDRA;惠康信托基金会在伦敦帝国理工学院为澳博与PSF赞助了ISSF奖学金;英国皇家学会研究资助[RGS\R1\191186];肯特大学SJM的惠康信托SEED奖[217528/Z/19/Z];和肯特大学KC的全球挑战研究基金（GCRF）博士奖学金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 L UltraYield FlaskThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well Black/Clear Bottom PlateThermoFisher10692202
Ammonium chloride (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)MelfordG32040
DFHBI (≥98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contact supplier for purity)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)MelfordB2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)Sigma49605
Magnesium chloride (98%)Fluorochem494356
Malt extractSigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly(vinyl sulfate) potassium saltSigma271969
Potassium glutamate (>99%)SigmaG1149
RTS amino acid sampler5 Prime2401530
Sodium chloride (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)Sigma505471
Yeast ExtractMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega

参考文献

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