合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

要約

このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。

要約

ストレプトマイセス spp.は、臨床抗生物質および工業薬品の主要な供給源である。 ベネズエラのレンサトミース ATCC 10712は、成長が急速に進む菌株であり、クロラムフェニコール、ヒドマイシン、ピクロマイシンの天然生産者であり、次世代の合成生物学シャーシとして魅力的な候補です。したがって、 S.ベネズエラ ATCC 10712の開発を加速する遺伝的ツールは、他の ストレプトマイセス spp.モデルと同様に、天然物工学および発見のために非常に望ましい。この上、専用 のS.ベネズエラ ATCC 10712無細胞システムは、高G+C(%)遺伝子の高収率異種発現を可能にするために、このプロトコルに提供されています。このプロトコルは、96ウェルまたは384ウェルプレート形式の小規模(10-100 μL)バッチ反応に適していますが、反応はスケーラブルである可能性があります。無細胞システムは堅牢で、最小限のセットアップで組み換えタンパク質の範囲のための高収率(〜5-10 μ M)を達成することができます。また、mRNAやタンパク質合成のリアルタイム測定、タグ付きタンパク質のインゲル蛍光染色用の広範なプラスミドツールセットも組み込まれています。このプロトコルは、高スループットの遺伝子発現特性解析ワークフローや、アクチノマイセテスゲノムに存在する高G+C(%)遺伝子からの酵素経路の研究と統合することもできる。

概要

無細胞転写翻訳(TX-TL)システムは、合成生物学の概念的なエンジニアリングフレームワーク^である迅速な設計構築テスト学習サイクルを実装するための、合成生物学のための理想的なプロトタイピングプラットフォームを提供します。また、開放反応環境における高価値組換えタンパク質生産に対するTX-TLシステムへの関心が高まっている²は、例えば、抗体薬物コンジュゲート³に非標準アミノ酸を組み込む。具体的には、TX-TLは、細胞抽出物、プラスミドまたは線形DNA、およびバッチまたは半連続反応でタンパク質合成を触媒するエネルギー溶液を必要とする。エシェリヒア・コリTX-TLは、支配的な無細胞システムである一方で、多くの非モデルTX-TLシステムは、さまざまなアプリケーションのために注目を集めています ^4,5,6,7,8.TX-TLの主な利点は、柔軟な拡張性(ナノリットルからリットルスケール)

プロトコル

注:GYM培地と寒天プレート、S30AおよびS30B洗浄バッファのレシピについては、 表1 と 表2 を参照してください。

1. ソリューションの作成と一般的なガイダンス

1. 例外が記載されていない限り、すべての溶液、細胞(成長後)、および細胞抽出物を調製後に氷上に保管してください。
2. 1 M Mg-グルタミン酸、4 M K-グルタミン酸、40%(w/v)PEG 6000、室温で1 g/mLポリビニルスルホン酸、および-80°Cで他のすべての株式を保管します。 化学分解を避けるために、フリーズ融解サイクルの数を最小限に抑えます。
3. 3-PGA(pH調整が必要)などのエネルギー溶液ストック( 表3参照)の調製については、 大腸菌 TX-TLプロトコル⁴¹に記載のガイダンスに従ってください。
   注:すべての成分は_ddH2Oに完全に溶解し、-80°Cの冷凍庫にアリコートとして保存されます。
4. 氷上の個々の在庫またはエネルギーソリューション(後述)を解凍します。42°Cでアミノ酸ストックを熱し、渦を〜15〜30分間加熱し、すべてのアミノ酸を可溶化します。
5. 一部のアミノ酸(L-Cys、L-Tyr、L-Leu....

結果

この詳細なプロトコルは、S. ベネズエラ ATCC 10712 モデル株に基づいてストレプトマイセス TX-TL システムを確立するユーザーを支援する例として提供されています(図 1)。ユーザーは、他のストレプトマイス株を研究しようとするかもしれません;ただし、より長い倍率の時間または明確な成長の好みを持つ他の株の成長/収穫段階は、ピーク結果を達成.......

ディスカッション

この原稿では、高収率のS.ベネズエラTX-TLプロトコルは、TX-TLシステムの経験豊富なユーザーと新しいユーザーの両方のために行う簡単な詳細な手順で説明されています。既存のストレプトマイセス⁴⁵および大腸菌TX-TL41プロトコルからいくつかの機能が削除され、S.ベネズエラTX-TL5,26の最小かつ高収率プロトコルが

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 L UltraYield Flask	Thomson	931136-B
3-PGA (>93%)	Sigma	P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate	ThermoFisher	10692202
Ammonium chloride (98%)	Fluorochem	44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)	ThermoFisher	R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)	Melford	C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)	Melford	G32040
DFHBI (≥98% - HPLC)	Sigma	SML1627
DTT (contact supplier for purity)	Melford	MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)	Santa Cruz Biotech	sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)	Sigma	G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)	Melford	B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)	Sigma	49605
Magnesium chloride (98%)	Fluorochem	494356
Malt extract	Sigma	70167-500G
PEG-6000	Sigma	807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO	ThermoFisher	88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt	Sigma	271969
Potassium glutamate (>99%)	Sigma	G1149
RTS amino acid sampler	5 Prime	2401530
Sodium chloride (99%)	Fluorochem	94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)	Sigma	505471
Yeast Extract	Melford	Y1333
Equipment
Platereader	BMG	Omega