JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол подробно описывает усовершенствованный метод синтеза высоких выходов рекомбинантных белков из системы Streptomyces venezuelae безклеточной транскрипции-трансляции (TX-TL).

Аннотация

Streptomyces spp. являются основным источником клинических антибиотиков и промышленных химикатов. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 является быстрорастущим штаммом и естественным производителем хлорамфеникола, жадомицина и пикромицина, что делает его привлекательным кандидатом в качестве шасси синтетической биологии следующего поколения. Поэтому генетические инструменты, которые ускоряют разработку S. venezuelae ATCC 10712, а также других моделей Streptomyces spp., очень желательны для разработки и открытия природных продуктов. С этой целью в этом протоколе предусмотрена специальная бесклетовая система S. venezuelae ATCC 10712, обеспечивающая высокоурожайную гетерологичную экспрессию генов с высоким G + C (%) Этот протокол подходит для мелкомасштабных (10-100 мкл) периодических реакций в формате пластин с 96 или 384 лунками, в то время как реакции потенциально масштабируемы. Бесклеточная система надежна и может достигать высоких выходов (~ 5-10 μ M) для ряда рекомбинантных белков в минимальной установке. Эта работа также включает в себя широкий набор плазмидных инструментов для измерения в режиме реального времени мРНК и синтеза белка, а также флуоресцентного окрашивания помеченных белков в геле. Этот протокол также может быть интегрирован с высокопроизводительными рабочими процессами характеристик экспрессии генов или изучением ферментных путей из генов с высоким G + C (%) присутствующих в геномах актиномицетов.

Введение

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции (TX-TL) обеспечивают идеальную платформу прототипирования для синтетической биологии для реализации быстрых циклов проектирования-сборки-тестирования-обучения, концептуальной инженерной основы для синтетической биологии1. Кроме того, растет интерес к системам TX-TL для производства высокоценного рекомбинантного белка в среде с открытой реакцией2, например, для включения нестандартных аминокислот в конъюгаты антитело-лекарство3. В частности, TX-TL требует клеточного экстракта, плазмиды или линейной ДНК и энергетического раствора для катализа синтеза белка в периодических или полунепрерывных реакциях. В то время как Escherichia coli TX-TL является доминирующей бесклеточной системой, ряд новых немодельных систем TX-TL привлекли внимание для различных применений4,5,6,7,8. Ключевые преимущества TX-TL включают гибкую масштабируемость (нанолитр на литр) 9,10, высокую воспроизводимость и автоматизированные рабочие процессы8,11,12. В частности, автоматизация TX-TL позволяет ускорить характеристику генетических частей и регуляторных элементов8,12,13.

С точки зрения реакционной установки, TX-TL требует как первичных, так и вторичных источников энергии, а также аминокислот, кофакторов, добавок и шаблонной последовательности ДНК. Нуклеотидные трифосфаты (NTP) обеспечивают первичный источник энергии для управления исходной мРНК (ATP, GTP, CTP и UTP) и синтеза белка (только ATP и GTP). Для увеличения выхода TX-TL NTP регенерируются за счет катаболизма вторичного источника энергии, такого как мальтоза14, мальтодекстрин15, глюкоза14, 3-фосфоглицерат (3-PGA)16, фосфоэнолпируват17 и L-глутамат18. Эта присущая метаболическая активность удивительно универсальна, но плохо изучена, особенно в новых системах TX-TL. Каждый источник энергии обладает особыми свойствами и преимуществами с точки зрения выхода АТФ, химической стабильности и стоимости, что является важным фактором для масштабирования реакций TX-TL. До сих пор современные протоколы для E. coli TX-TL достигли до 4,0 мг / мл (~ 157 мкМ) для модели зеленого флуоресцентного белка (GFP), используя смесь 3-PGA (30 мМ), мальтодекстрина (60 мМ) и D-рибозы (30 мМ) в качестве вторичного источника энергии19.

В последнее время наблюдается рост интереса к изучению вторичных биосинтетических путей метаболитов в системах TX-TL20,21,22. В частности, актинобактерии являются основным источником вторичных метаболитов, включая антибиотики и сельскохозяйственные химикаты23,24. Их геномы обогащены так называемыми биосинтетическими кластерами генов (BGC), которые кодируют ферментативные пути для вторичного биосинтеза метаболитов. Для изучения генетических частей актинобактерий и биосинтетических путей недавно был разработан ряд систем TX-TL на основе Streptomyces 5,6,25,26. Эти специализированные системы Streptomyces TX-TL потенциально полезны по следующим причинам: [1] обеспечение нативной белковой складной среды для ферментов из Streptomyces spp.26; [2] доступ к оптимальному пулу тРНК для высокой экспрессии генов G+C (%); [3] активный первичный метаболизм, который потенциально может быть захвачен для поставки биосинтетических прекурсоров; и [4] обеспечение ферментами, прекурсорами или кофакторами из вторичного метаболизма, присутствующего в экстракте нативной клетки. Таким образом, недавно был создан высокопроизводительный инструментарий S.venezuelae TX-TL для использования этих уникальных возможностей5.

Streptomyces venezuelae является новым хозяином для синтетической биологии с богатой историей в промышленной биотехнологии5,27,28,29 и в качестве модельной системы для изучения деления клеток и генетической регуляции у Actinobacteria30,31,32. Штамм основного типа, S. venezuelae ATCC 10712, имеет относительно большой геном 8,22 Мб с содержанием 72,5% G + C (%) (номер присоединения: CP029197), который кодирует 7377 кодирующих последовательностей, 21 рРНК, 67 тРНК и 30 биосинтетических кластеров генов27. В синтетической биологии S. venezuelae ATCC 10712 является привлекательным шасси для гетерологичной экспрессии биосинтетических путей. В отличие от большинства других пятен Streptomyces, он обеспечивает несколько ключевых преимуществ, включая быстрое время удвоения (~ 40 мин), широкий спектр генетических и экспериментальных инструментов5,28, отсутствие слипания мицелия и споруляцию в жидких средах28,33. Несколько исследований также продемонстрировали использование S. venezuelae для гетерологичной продукции разнообразного массива вторичных метаболитов, включая поликетиды, рибосомные и нерибосомальные пептиды34,35,36,37,38. Эти комбинированные особенности делают этот штамм привлекательным микробным хозяином для применения в синтетической биологии и метаболической инженерии. Хотя S. venezuelae не является доминирующей моделью Streptomyces для гетерологичной экспрессии генов, с дальнейшим развитием она подготовлена к более широкому использованию в поисках натуральных продуктов.

В этой рукописи представлен подробный протокол (рисунок 1) для высокопроизводительной системы S. venezuelae TX-TL, который был обновлен по сравнению с оригинальным ранее опубликованным протоколом26. В этой работе энергетический раствор и условия реакции были оптимизированы для увеличения выхода белка до 260 мкг/мл для белка-репортера mScarlet-I в периодической реакции продолжительностью 4 ч 10 мкл с использованием стандартной плазмиды pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Эта плазмида была специально разработана для обеспечения различных методов обнаружения экспрессии белка. Протокол также оптимизирован, в то время как энергетическая система была оптимизирована для снижения сложности и стоимости настройки бесклеточных реакций без ущерба для производительности. Наряду с оптимизированной системой TX-TL, была разработана библиотека генетических частей для тонкой настройки экспрессии генов и в качестве флуоресцентных инструментов для мониторинга TX-TL в режиме реального времени, тем самым создавая универсальную платформу для прототипирования экспрессии генов и биосинтетических путей естественного продукта из Streptomyces spp. и связанных с ним актинобактерий.

В этой работе рекомендуемая стандартная плазмида (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) может быть использована для создания рабочего процесса S. venezuelae TX-TL в новой лаборатории и доступна на AddGene (см. Дополнительную таблицу S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I предоставляет пользователю гибкость для изучения других кадров с открытым считыванием (ORF). mScarlet-I ORF оптимизирован кодон-оптимизирован для экспрессии гена S. venezuelae. Промоутер SP44 является сильным конститутивным промотором, который очень активен как в E. coli, так и в Streptomyces spp.39. Плазмида имеет два уникальных участка фермента рестрикции (NdeI, BamHI), чтобы обеспечить субклонирование новых ORF в рамке с помощью совместной C-концевой FLAG-метки и флуоресцеиновой мышьяковой шпильки (FlAsH) системы меток связующего. Альтернативно, оба тега могут быть удалены с включением стоп-кодона после субклонирования нового гена. С помощью этого базового вектора была продемонстрирована высокая экспрессия ряда белков, а именно белков из пути биосинтеза окситетрациклина и неохарактеризованной нерибосомальной пептидной синтетазы (NRPS) из Streptomyces rimosus (рисунок 2). С точки зрения обнаружения мРНК, стандартная плазмида pTU1-A-SP44-mScarlet-I содержит аптамер dBroccoli (в 3'-нетранслируемой области) для обнаружения с помощью зонда 3,5-дифтор-4-гидроксибензилиден имидазолинон (DFHBI). Для повышения гибкости на AddGene также был доступен набор инструментов для EcoFlex40-совместимых деталей MoClo, включая EcoFlex-совместимый вектор Streptomyces (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) и ряд вариантов плазмид pTU1-A-SP44, экспрессирующих суперпапковый зеленый флуоресцентный белок (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I и β-глюкуронидазу (GUS). В частности, плазмида pSF1C-A получена из pAV-gapdh28 и отверждается из сайтов BsaI/BsmBI для сборки MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP эквивалентен pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP от EcoFlex40, но содержит дополнительные функциональные возможности для сопряжения и хромосомной интеграции в Streptomyces spp. с использованием системы интегразы phiC3128.

Первый этап протокола включает в себя рост S. venezuelae ATCC 10712 или близкородственного штамма, сбор клеток в средней экспоненциальной фазе, этапы промывки клеток и уравновешивание в буферах S30A и S30B. Этот этап занимает три дня, и время для роста клеток может быть использовано для подготовки оставшихся компонентов, как описано ниже. Собранные клетки затем лизируются ультразвуком, осветляются и подвергаются реакции стока. На этом заключительном этапе подготовки клеточные экстракты могут быть подготовлены для длительного хранения при -80 °C, чтобы свести к минимуму потерю активности. Для сборки реакций TX-TL с использованием этого протокола представлен Streptomyces Master Mix (SMM) с опцией формата Minimal Energy Solution (MES), который дает сопоставимые выходы. Кроме того, рекомендуется нанести свежую культуру S. venezuelae ATCC 10712 из запаса глицерина -80 °C на пластину агара GYM и инкубировать при 28 °C в течение не менее 48-72 ч, пока не будут видны отдельные колонии. Только свежие культуры следует использовать для следующих шагов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 и Таблицу 2 рецептов для средней и агаровой пластины GYM и буферов для мытья S30A и S30B.

1. Подготовка решений и общее руководство

  1. Храните все растворы, клетки (после роста) и клеточные экстракты на льду после приготовления, если не указано исключение.
  2. Храните запасы для 1 М Мг-глутамата, 4 М К-глутамата, 40% (мас./об.) ПЭГ 6000, 1 г/мл поливинилсульфоновой кислоты при комнатной температуре и всех остальных запасов при -80 °C. Сведите к минимуму количество циклов замораживания-оттаивания, чтобы избежать химической деградации.
  3. Для подготовки запасов энергетического раствора (см. таблицу 3), таких как 3-PGA (требует корректировки pH), следуйте указаниям, приведенным в протоколе E. coli TX-TL41.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты полностью растворимы в ddH2O и хранятся в виде аликвот в морозильной камере -80 °C.
  4. Разморозка отдельных запасов или энергетических решений (описанных ниже) на льду. Нагревайте запас аминокислот при 42 °C с вихрем в течение ~15-30 мин, чтобы солюбилизировать все аминокислоты.
  5. Поскольку некоторые аминокислоты (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) выпадают в осадок на льду, минимизируя время покоя, оставьте этот раствор при комнатной температуре и используйте вихрь для растворения.
  6. Сложите расчетные объемы (табл. 3) стоковых растворов и воды и хорошо перемешайте с помощью вихря.
  7. Аликвотируют энергетический раствор в виде 20-100 мкл аликвот на пробирку или по желанию на льду и хранят при -80 °С до дальнейшего использования.

2. Подготовка клеток S. venezuelae ATCC 10712

  1. День 1-Подготовка носителей/буферов и ночная предварительная культура
    1. Приготовьте 1 л стерильной жидкой среды GYM в 2 л перегородчатой колбы, как описано в таблице 1. Смотрите Таблицу материалов для источников оборудования/химикатов/реагентов.
    2. Приготовьте 1 х 50 мл стерильной жидкой среды GYM в колбе Эрленмейера объемом 250 мл, как описано в таблице 1.
    3. Приготовьте 100 мл 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 мл 1 M MgCl2 и 500 мл 4 M NH4Cl растворов для получения 1 л S30A и 1 л S30B промывочных буферов. Рецепты см. в таблице 2 .
    4. Подготовьте ночную прекультуру. Предварительно разогрейте стерильные 50 мл жидкой среды GYM в колбе Эрленмейера объемом 250 мл до 28 °C в течение 30 мин.
    5. Инокулируют одну колонию S. venezuelae ATCC 10712 (или родственный штамм) из агаровой пластины GYM в предварительно расплавленную 50 мл жидкой среды GYM и инкубируют при 28 °C, 200 об/мин в течение 16 ч (ночная предварительная культура).
  2. День 2-Подготовка дневной докультуры и основной культуры роста.
    1. Предварительно разогрейте 50 мл стерильной жидкой среды GYM в колбе Эрленмейера объемом 250 мл при 28 °C в течение 30 мин.
    2. Переложить 1 мл ночной предварительной культуры в предварительно нагретую 50 мл жидкой среды GYM и инкубировать при 28 °C, 200 об/мин в течение 8 ч (дневная предварительная культура).
    3. После этого периода роста проверьте OD600 в спектрофотометре, используя разбавление 1:10 стерильной средой GYM в пластиковой кювете объемом 1 мл (длина пути 1 см).
      ПРИМЕЧАНИЕ: OD600 должен был достичь по крайней мере 3-4. Если наблюдается слабый рост, целесообразно повторить шаги 2.2.1-2.2.2.
    4. Субкультура 0,25 мл дневной предварительной культуры в 1 л жидкой среды GYM в 2 л перегородчатых колб.
    5. Встряхните в течение ночи при 28 °C, 200 об/мин в течение 14 ч.
  3. День 3-Урожайные ячейки
    1. После предыдущего инкубационного периода (14 ч) регистрируют OD600 основной культуры. Разбавьте культуру на ночь 1:10 свежей средой GYM для измерения OD600 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: OD600 должен был достичь 3.0-4.0 на данном этапе.
    2. Если OD600<3.0, увеличьте скорость встряхивания до 250-300 об/мин и увеличивайтесь до тех пор, пока не будет достигнут OD600 3.0. Расти не дольше 2 ч (всего 16 ч).
    3. Если OD600>3.0, переложить культуры в емкости для центрифугирования и быстро охладить на влажном льду в течение 30 мин.
    4. Ожидая, пока клеточная культура остынет на льду, приготовьте 4 мл свежих буферов 1 М дитиотрейтола (DTT), S30A и S30B, как описано в таблице 1, и держите их на льду. Смотрите Таблицу материалов для химических /реагентных источников.
    5. Предварительно взвесьте пустую 50-литровую центрифужную трубку и предварительно охладите при -20 °C.
    6. Добавьте 2 мл 1 M DTT к 1 л буфера S30A на льду и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте DTT в буферы промывки S30A и S30B только перед их использованием.
    7. Центрифужные ячейки при 6000 × г, 4 °C, 10 мин, и осторожно выбрасывают супернатант быстрым и однократным движением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранула нарушена, максимизируйте удержание клеток остаточной средой GYM и продолжайте протокол.
    8. Добавьте 500 мл буфера S30A и повторно суспендируйте клетки, энергично встряхивая бутылки центрифугирования до тех пор, пока сгустки клеток не станут однородно диспергированными.
    9. Центрифугируйте клетки при 6000 × г, 4 °C, 6 мин и осторожно выбросьте супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя гранула ячейки будет более твердой в этот момент, некоторые ячейки останутся в суспензии (см. Рисунок 1). Лечить, как описано в 2.3.7, и сохранять как можно больше клеток.
    10. Повторите шаги 2.3.8-2.3.9.
    11. Добавьте 2 мл 1 M DTT к 1 л буфера S30B на льду и хорошо перемешайте. Добавьте 500 мл буфера S30B в ячейки. Повторите шаг 2.3.9.
    12. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 10 мл буфера S30B и перенесите в предварительно взвешенную, предварительно охлажденную 50 мл центрифужную трубку. При необходимости переложите остаточные ячейки с дополнительными 5-10 мл буфера S30B. Заполните до 50 мл S30B.
    13. Центрифужные ячейки при 6000 × г, 4 °C, 10 мин, и осторожно выбрасывают супернатант.
    14. Повторите шаг 2.3.13.
    15. Осторожно аспирируйте оставшийся супернатант S30B пипеткой объемом 100-200 мкл.
    16. Взвесьте влажную ячейку гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная масса гранул влажных клеток для 1 л ночной культуры GYM (OD600 = 3,0) составляет ~ 4,5 г.
    17. На каждый 1 г влажных клеток добавляют 0,9 мл буфера S30B. Повторное суспендирование клеток с помощью пипетки Пастера или вихря.
    18. Центрифуга ненадолго (~10 с) до 500 × г для осаждения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен, а ячейки могут быть заморожены на жидком азоте или сухом льду и храниться при -80 ° C. Для безопасности носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при обращении с жидким азотом, включая лицевые щитки и перчатки.

3. Лизис клеток ультразвуком для получения экстракта сырой клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пользователь может выбрать разрушение клеток ультразвуком либо фракциями 1 мл (вариант 1), либо в виде более крупной клеточной суспензии (5 мл) в пробирке объемом 50 мл (вариант 2). Оба варианта были подробно описаны ниже, чтобы обеспечить воспроизводимость, так как конечный объем клеточной суспензии может изменяться из-за потери клеток во время предыдущих этапов сбора и промывки. Новый пользователь должен сначала попытаться установить протокол в варианте 2.1.

  1. Лизис клеток ультразвуком во фракциях 1 мл
    1. Используя наконечник пипетки объемом 1 мл (отрезанный конец наконечника для увеличения размера отверстия), переложите 1 мл клеточной суспензии в трубки микроцентрифуги объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки заморожены, быстро разморозьте трубку объемом 50 мл, содержащую гранулу, в теплой воде перед лизисом клеток. Переложите трубку на влажный лед, как только гранула начала размораживаться, и охладите в течение 10 минут.
    2. Поместите каждую трубку микроцентрифуги в стакан с ледяной водой, используя пластиковую стойку для трубок, чтобы удерживать трубку для обработки ультразвуком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за чувствительности клеточного экстракта к перегреву очень важно убедиться, что трубки не нагреваются, чтобы предотвратить осаждение белка и снижение ферментативной активности.
    3. Используйте зонд для ультразвука с наконечником диаметром 3 мм и очистите его 70% (v/v) этанолом и двухдистиллированной водой (ddH2O). Опустите наконечник ультразвуковика в клеточную суспензию до тех пор, пока она не окажется примерно на 1 см ниже поверхности жидкости.
    4. Введите следующие настройки в ультразвуковой аппарат: частота 20 кГц, амплитуда 65%, время включения импульса 10 с, время выключения импульсов 10 с, общее время обработки ультразвуком 1 мин.
    5. Запустите протокол обработки ультразвуком. Перемещайте трубку вверх / вниз и вбок в течение первых двух циклов покоя, чтобы обеспечить равномерное использование ультразвуком клеток. Запишите потребляемую энергию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целях безопасности надевайте соответствующую защиту слуха во время обработки ультразвуком. Вязкость будет уменьшаться по мере разрушения клеток, и бледно-кремовая влажная клеточная гранула должна превратиться в однородную коричневую жидкость. Рекомендуемая потребляемая энергия составляет 240 Дж на мл влажных клеток. Если клетки только частично лизированы, суспензия все равно будет выглядеть кремового цвета с вязкими скоплениями клеток, особенно по бокам трубки.
    6. Переверните трубку 2-3 раза и повторите обработку ультразвуком в течение еще одного или двух циклов по 10 с, часто перемешивая до тех пор, пока клетки не будут полностью разрушены.
  2. Клеточный лизис путем обработки ультразвуком клеточной суспензии 5 мл
    1. Если клетки заморожены, быстро разморозьте трубку объемом 50 мл, содержащую гранулу, в теплой воде с встряхиванием перед лизисом клеток. Переложите трубку на влажный лед, как только гранула начала размораживаться, и охладите в течение 10 минут.
    2. Кратковременно раскрутите трубку при 500 х г , чтобы отстоять клетки.
    3. Поместите трубку объемом 50 мл в стакан с ледяной водой для обработки ультразвуком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за чувствительности клеточного экстракта к перегреву очень важно убедиться, что трубки не нагреваются, чтобы предотвратить осаждение белка и снижение ферментативной активности.
    4. Используйте зонд для ультразвука с наконечником диаметром 6 мм и очистите его этанолом 70% (v/v) и ddH2O (см. визуальную схему зонда диаметром 6 мм на рисунке 1). Опустите наконечник ультразвуковика в суспензию ячейки (~5 мл) до тех пор, пока она не окажется примерно на 1 см ниже поверхности жидкости.
    5. Введите следующие настройки в ультразвуковой аппарат: частота 20 кГц, амплитуда 65%, время включения импульса 10 с, время выключения импульсов 10 с, общее время обработки ультразвуком 1 мин на мл влажных ячеек (всего 5 мин).
    6. Запустите протокол обработки ультразвуком. Перемещайте трубку вверх / вниз и вбок в течение первых двух циклов покоя, чтобы обеспечить равномерное использование ультразвуком клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целях безопасности надевайте соответствующую защиту слуха во время обработки ультразвуком. Вязкость будет уменьшаться по мере разрушения клеток, и бледно-кремовая влажная клеточная гранула должна превратиться в однородную коричневую жидкость. Запишите потребляемую энергию. Рекомендуется оптимальная потребляемая энергия 240 Дж на мл влажных клеток (~ 1200 Дж в общей сложности от 5 мин обработки ультразвуком).
    7. Если некоторые ячейки остаются нетронутыми, следуйте указаниям из шага 3.1.5.
    8. Перенесите клеточные экстракты в микроцентрифужные трубки по 2 мл.

4. Осветление клеточного экстракта и реакция стока

  1. Центрифугируйте лизированные клетки при 16 000 × г в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора. Переведите супернатант в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл в виде аликвоты по 1 мл.
  2. Выполните реакцию стока для клеточных экстрактов. Инкубировать пробирки объемом 1,5 мл, содержащие клеточные экстракты при 30 °C, в течение 60 мин на тепловом блоке или инкубаторе без встряхивания.
  3. Центрифугируют клеточные экстракты при 16 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Объедините супернатанты в центрифужную трубку объемом 15 мл. Перемешайте супернатант, перевернув трубку пять раз до однородности, затем держите ее на льду. Осторожно переворачивайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
  4. Разбавьте 10 мкл клеточного экстракта в 100 раз буфером S30B и измерьте общую концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда с тремя техническими повторами (см. Дополнительный материал S2 для руководства по анализу Брэдфорда).
  5. Если концентрация белка составляет 20-25 мг/мл, переведите клеточные экстракты в виде 100 мкл аликвот в новые пробирки по 1,5 мл, заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целях безопасности надевайте соответствующие СИЗ при обращении с жидким азотом, включая лицевые щитки и перчатки.
  6. Если концентрация белка составляет <20 мг/мл, повторите этапы приготовления сырого экстракта, чтобы обеспечить высокое качество клеточного экстракта и выход TX-TL, сопоставимый с ранее опубликованной работой5.

5. Получение шаблона плазмидной ДНК

  1. Очистите плазмиду pTU1-A-SP44-mScarlet-I (происхождение pUC19) от свежетрансформированного штамма плазмиды E. coli (DH10β, JM109), выращенного в 50 мл культуры LB (с 100 мг/ мл карбенициллина), используя соответствующий набор для очистки плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Элюируют плазмиду в 2 х 300 мкл воды без нуклеазы и объединяют фракции.
  3. Добавьте 0,1 объема (66 мкл) 3 М ацетата натрия (рН 5,2).
  4. Добавьте 0,7 объема (462 мкл) изопропанола.
  5. Инкубируют ДНК при -20 °C в течение 30 мин.
  6. Центрифугу при 16 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  7. Добавьте 2 мл 70% (v/v) этанола в гранулу ДНК.
  8. Инвертируйте трубку 3-4 раза, чтобы повторно суспендировать гранулу плазмидной ДНК.
  9. Центрифугу при 16 000 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  10. Повторите шаги 5.7-5.9 и удалите всю видимую жидкость.
  11. Высушите гранулу ДНК на воздухе в течение 10-30 мин или высушите в течение 5 мин с помощью вакуумной центрифуги.
  12. Повторно суспендировать высушенную гранулу 600 мкл не содержащего нуклеазы ddH2O.
  13. Измерьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра.
  14. Приготовить 50-100 мкл аликвоты и хранить при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется высокая концентрация ДНК в диапазоне 500-1000 нг/мкл из-за жестких объемных ограничений бесклеточных реакций. Разбавляют запас плазмидной ДНК до 80 нМ; Плазмида pTU1-A-SP44-mScarlet-I 168 нг/мкл эквивалентна 80 нМ.

6. Приготовление раствора Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Раствор аминокислот
    1. Используйте комплект пробоотборника аминокислот, чтобы избежать ручных ошибок и сократить время приготовления, следуя инструкциям производителя, предоставленным онлайн.
    2. Разбавить 20-кратный раствор аминокислот с использованием ddH2O до конечной концентрации 6 мМ (5 мМ L-лей).
    3. Далее разбавляют до 2,4 мМ (2 мМ L-лей) в 2,4-кратном растворе SMM (см. таблицу 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация в реакции TX-TL составляет 1 мМ 19x аминокислот и 0,83 мМ L-лея.
  2. Энергетическое решение и добавки
    1. Приготовьте другие компоненты в 2,4-кратном SMM-растворе , следуя рецепту, описанному в таблице 3.
    2. В качестве альтернативы можно приготовить 2,4-кратный раствор с минимальной энергопотреблением (MES), следуя рецепту, описанному в таблице 3.

7. Настройка стандартной реакции S. venezuelae TX-TL

  1. Разморозьте клеточный экстракт, раствор SMM (или MES) и плазмидную ДНК на льду. Предварительно охладите плиту из 384 скважин при -20 °C.
  2. Наладить реакции TX-TL, где 25% объема составляет плазмидная ДНК, 33,33% - клеточный экстракт и 41,67% - SMM-раствор ; держите их на льду, чтобы избежать смещения времени начала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Был предоставлен стандартный шаблон TX-TL (таблица 4) для расчета объема необходимых реагентов на основе количества реакций. Стандартный объем для реакции 33 мкл выглядит следующим образом: 11 мкл клеточного экстракта, 13,75 мкл SMM и 8,25 мкл плазмидной ДНК.
  3. Осторожно вращайте смесь в течение ~5 с на низкой скорости, чтобы убедиться, что раствор однородный. Избегайте образования пены / пузырьков.
  4. Перенос 10 мкл аликвот в три скважины из 384-луночной пластины в качестве технического трипликата без введения пузырьков воздуха. Запечатайте пластину прозрачной крышкой и открутите при 400 × г в течение 5 с.
  5. Инкубируют реакцию при 28 °C либо в инкубаторе (для показаний конечной точки), либо в пластинчатом считывателе без встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакции обычно занимают 3-4 часа, чтобы достичь завершения. См. Дополнительный материал S2 для получения инструкций по считывателю пластин и стандартным измерениям mScarlet-I.

Результаты

Этот подробный протокол приведен в качестве примера, чтобы помочь пользователю установить систему Streptomyces TX-TL на основе штамма модели S. venezuelae ATCC 10712 (рисунок 1). Пользователь может стремиться изучить другие штаммы Streptomyces; однако этапы роста/сбора урожая дру?...

Обсуждение

В этой рукописи был описан высокопроизводительный протокол S. venezuelae TX-TL с подробными шагами, которые легко провести как для опытных, так и для новых пользователей систем TX-TL. Несколько функций из существующих протоколов Streptomyces45 и E. coli TX-TL41 были удалены, чтобы у?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить следующую исследовательскую поддержку: EPSRC [EP/K038648/1] для SJM в качестве PDRA с PSF; Wellcome Trust спонсировал стипендию ISSF для SJM с PSF в Имперском колледже Лондона; Исследовательский грант Королевского общества [RGS\R1\191186]; Награда Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] для SJM в Кентском университете; и стипендия Фонда исследований глобальных проблем (GCRF) для KC в Кентском университете.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 L UltraYield FlaskThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well Black/Clear Bottom PlateThermoFisher10692202
Ammonium chloride (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)MelfordG32040
DFHBI (≥98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contact supplier for purity)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)MelfordB2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)Sigma49605
Magnesium chloride (98%)Fluorochem494356
Malt extractSigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly(vinyl sulfate) potassium saltSigma271969
Potassium glutamate (>99%)SigmaG1149
RTS amino acid sampler5 Prime2401530
Sodium chloride (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)Sigma505471
Yeast ExtractMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega

Ссылки

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175in vitroStreptomyces

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены