A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .
סטרפטומיצ'ים spp. הם מקור עיקרי של אנטיביוטיקה קלינית וכימיקלים תעשייתיים. סטרפטומיצ'ס ונצואלה ATCC 10712 הוא זן הגדל במהירות ויצרן טבעי של כלורמפניקול, ג'דומיניצין ופיקרומיצין, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי כשלדה ביולוגית סינתטית מהדור הבא. לכן, כלים גנטיים המאיצים את הפיתוח של S. ונצואלה ATCC 10712, כמו גם מודלים אחרים של סטרפטומיצ'ס spp. , רצויים מאוד להנדסת מוצר טבעי וגילוי. לשם כך, מערכת ייעודית S. venezuelae ATCC 10712 ללא תאים מסופקת בפרוטוקול זה כדי לאפשר ביטוי הטרולוגי בעל תפוקה גבוהה של גנים G+C גבוהים (%) פרוטוקול זה מתאים לתגובות אצווה בקנה מידה קטן (10-100 μL) בתבנית צלחת 96-well או 384-well, בעוד התגובות עשויות להיות מדרגיות. המערכת נטולת התאים חזקה ויכולה להשיג תשואות גבוהות (~5-10 μ M) עבור מגוון חלבונים רקומביננטיים במערך מינימלי. עבודה זו משלבת גם ערכת כלים פלסמידית רחבה למדידה בזמן אמת של mRNA וסינתזת חלבונים, כמו גם כתמי פלואורסצנטיות בג'ל של חלבונים מתויגים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב גם עם זרימות עבודה אפיון ביטוי גנים תפוקה גבוהה או המחקר של מסלולי אנזים מ G + C גבוה (%) גנים נוכחים בגנום Actinomycetes.
מערכות תרגום תמלול ללא תאים (TX-TL) מספקות פלטפורמת אב-טיפוס אידיאלית לביולוגיה סינתטית ליישום מחזורי תכנון-בנייה-למידה מהירים, מסגרת ההנדסה המושגית לביולוגיה סינתטית1. בנוסף, יש עניין גובר במערכות TX-TL לייצור חלבון רקומביננטי בעל ערך גבוה בסביבה של תגובה פתוחה2, למשל, לשלב חומצות אמינו לא סטנדרטיות בהצמדות נוגדנים-תרופתיות3. באופן ספציפי, TX-TL דורש תמצית תאים, פלסמיד או DNA ליניארי, ופתרון אנרגיה כדי לזרז את סינתזת החלבון בתגובות אצווה או חצי יבשתיות. בעוד Escherichia coli TX-TL היא המערכת הדומיננטית ללא תאים, מספר מערכות TX-TL שאינן מודל המתעוררות משכו תשומת לב עבור יישומים שונים4,5,6,7,8. היתרונות העיקריים של TX-TL כוללים מדרגיות גמישה (ננו-ליטר בקנה מידה ליטר)9,10, רבייה חזקה וזרימות עבודה אוטומטיות8,11,12. בפרט, אוטומציה של TX-TL מאפשרת אפיון מואץ של חלקים גנטיים ואלמנטים רגולטוריים8,12,13.
במונחים של הגדרת תגובה, TX-TL דורש מקורות אנרגיה ראשוניים ומשניים, כמו גם חומצות אמינו, קופקטורים, תוספים, ורצף DNA תבנית. נוקלאוטיד טריפוספטים (NTPs) מספקים את מקור האנרגיה העיקרי להנעת mRNA ראשוני (ATP, GTP, CTP ו- UTP) וסינתזת חלבונים (רק ATP ו- GTP). כדי להגדיל את תשואות TX-TL, NTPs מתחדשים באמצעות קטבוליזם של מקור אנרגיה משני, כגון מלטוז14, מלטודקסטרין15, גלוקוז14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, ו L-גלוטמט18. פעילות מטבולית טבועה זו היא מגוונת באופן מפתיע, אך נחקרה בצורה גרועה, במיוחד במערכות TX-TL המתעוררות. לכל מקור אנרגיה יש מאפיינים ויתרונות ברורים במונחים של תשואת ATP, יציבות כימית ועלות, המהווה שיקול חשוב לתגובות TX-TL מוגדלות. עד כה, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור E. coli TX-TL הגיעו עד 4.0 מ"ג / מ"ל (~ 157 מיקרומטר) עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק מודל (GFP), באמצעות תערובת של 3-PGA (30 מ"מM), מלטודקסטרין (60 מ"מ) ו D-ריבוז (30 מ"מ) כמקור האנרגיה המשני19.
לאחרונה, יש כבר עניין גובר בחקר מסלולים biosynthetic מטבוליט משני במערכות TX-TL20,21,22. באופן ספציפי, Actinobacteria הם מקור עיקרי של מטבוליטים משניים, כולל אנטיביוטיקה וכימיקלים חקלאיים23,24. הגנום שלהם מועשר במה שמכונה אשכולות גנים ביוסינתטיים (BGCs), המקודדים מסלולים אנזימטיים לביוסינתזה מטבולית משנית. לחקר חלקים גנטיים Actinobacteria ומסלולים biosynthetic, מגוון של מערכות TX-TL מבוססי סטרפטומיצ'ס פותחו לאחרונה5,6,25,26. מערכות TX-TL מיוחדות אלה של סטרפטומיצ'ס עשויות להועיל מהסיבות הבאות: [1] אספקת סביבת קיפול חלבונים מקומית לאנזימים מסטרפטומיצ'ס spp.26; [2] גישה למאגר tRNA אופטימלי לביטוי גנים G+C (%) גבוה; [3] חילוף חומרים ראשוני פעיל, אשר עלול להיחטף לאספקת מבשרים biosynthetic; ו[4] אספקת אנזימים, מבשרי או קופקטורים מחילוף החומרים המשני הקיימים בתמצית התאים המקומיים. לפיכך, ערכת כלים TX-TL TX-TL של S.venezuelae בעלת תפוקה גבוהה הוקמה לאחרונה כדי לרתום את היכולות הייחודיות הללו5.
סטרפטומיצ'ס ונצואלה היא מארחת מתפתחת לביולוגיה סינתטית עם היסטוריה עשירה בביוטכנולוגיה תעשייתית5,27,28,29 וכמערכת מודל לחקר חלוקת תאים ורגולציה גנטית באקטינובקטריה30,31,32. זן הסוג העיקרי, S. venezuelae ATCC 10712, יש גנום גדול יחסית של 8.22 Mb עם 72.5% תוכן G +C (%) (מספר גישה: CP029197), המקודד 7377 רצפי קידוד, 21 rRNAs, 67 tRNAs, ו 30 אשכולות גנים biosynthetic27. בביולוגיה סינתטית, S. venezuelae ATCC 10712 הוא שלדה אטרקטיבית לביטוי ההטרולוגי של מסלולים biosynthetic. שלא כמו רוב כתמי סטרפטומיצ'ס האחרים, הוא מספק מספר יתרונות מרכזיים, כולל זמן הכפלה מהיר (~ 40 דקות), מגוון רחב של כלים גנטיים וניסיוניים5,28, חוסר גושי תפטיר, וספורציה במדיה נוזלית28,33. מספר מחקרים הדגימו גם את השימוש ב- S. ונצואלה לייצור הטרולוגי של מגוון רחב של מטבוליטים משניים, כולל פוליקטידים, פפטידים ריבוזומליים ולא ריבוסומיים34,35,35,36,37,38. תכונות משולבות אלה הופכות את הזן הזה למארח מיקרוביאלי אטרקטיבי לביולוגיה סינתטית ויישומי הנדסה מטבולית. בעוד S. ונצואלה אינה מודל סטרפטומיצ'ס הדומיננטי לביטוי גנים הטרולוגיים, עם התפתחויות נוספות, היא מוכנה לשימוש רחב יותר בתוך גילוי מוצרים טבעיים.
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט (איור 1) עבור מערכת TX-TL של S. ונצואלה בעלת תפוקה גבוהה, שעודכנה מהפרוטוקול המקורי שפורסם בעבר26. בעבודה זו, פתרון האנרגיה ותנאי התגובה עברו אופטימיזציה כדי להגדיל את תפוקת החלבון עד 260 מיקרוגרם / מ"ל עבור חלבון כתב mScarlet-I בתגובת אצווה של 4 שעות, 10 μL, באמצעות פלסמיד סטנדרטי, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. פלסמיד זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר שיטות שונות של זיהוי ביטוי חלבון. הפרוטוקול גם יעיל, בעוד שמערכת האנרגיה עברה אופטימיזציה כדי להפחית את המורכבות והעלות של הגדרת תגובות ללא תאים מבלי להתפשר על התשואה. יחד עם מערכת TX-TL הממוטבת, פותחה ספרייה של חלקים גנטיים לביטוי גנים לכוונון עדין וכלים פלואורסצנטיים לניטור TX-TL בזמן אמת, ובכך נוצרה פלטפורמה רב-תכליתית לביטוי גנים אב-טיפוס ולמסלולים ביוסינתזיים של מוצרים טבעיים מסטרפטומיצ'ס spp. ו- Actinobacteria הקשורים.
בעבודה זו, הפלסמיד הסטנדרטי המומלץ (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) יכול לשמש להקמת זרימת העבודה של S. venezuelae TX-TL במעבדה חדשה והוא זמין ב- AddGene (ראה טבלה משלימה S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I מספק למשתמש את הגמישות ללמוד מסגרות קריאה פתוחות אחרות (ORFs). mScarlet-I ORF ממוטב קודון לביטוי הגנים של S. venezuelae. מקדם SP44 הוא מקדם מכונן חזק כי הוא פעיל מאוד הן E. coli ו Streptomyces spp.39. הפלסמיד כולל שני אתרי אנזימי הגבלה ייחודיים (NdeI, BamHI) כדי לאפשר שיבוט משנה של ORFs חדשים במסגרת עם תג דגל מסוף C משותף ומערכת תג סיכות ראש ארסנית פלואורסצ'ין (FlAsH). לחלופין, ניתן להסיר את שני התגים עם הכללת קודון עצירה לאחר שיבוט משנה של גן חדש. עם וקטור הבסיס הזה, הוכח הביטוי בעל התפוקה הגבוהה של מגוון חלבונים, כלומר חלבונים ממסלול הביוסינתזה האוקסיטקסטילציקלין וסינתטאז פפטיד לא אופייני (NRPS) מסטרפטומיצ'ס רימוזוסוס (איור 2). במונחים של זיהוי mRNA, pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי מכיל aptamer dBroccoli (באזור 3'-untranslated) לגילוי עם 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinonee (DFHBI) בדיקה. לקבלת גמישות מוגברת, ערכת כלים של חלקי MoClo תואמי EcoFlex40 הפכה לזמינה גם ב- AddGene, כולל וקטור שאטל סטרפטומיצ'ס תואם EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ומגוון פלסמידים וריאנט pTU1-A-SP44 המבטאים חלבון פלואורסצנטיות ירוק סופר-תיקייתי (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ו- β-glucuronidase (GUS). בפרט, pSF1C-A plasmid נגזר pAV-gapdh28 והוא נרפא של אתרי BsaI / BsmBI להרכבה MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP שווה ערך ל-pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP מ-EcoFlex40, אך מכיל פונקציונליות נוספת להטיה ואינטגרציה כרומוזומלית בסטרפטומיצ'ים spp. באמצעות מערכת integrase phiC3128.
השלב הראשון של הפרוטוקול כרוך בצמיחה של S. ונצואלה ATCC 10712 או זן קרוב, קציר תאים בשלב אמצע מעריכי, שלבי שטיפת תאים, ושיווי משקל במאגרי S30A ו- S30B. שלב זה דורש שלושה ימים, ואת הזמן לצמיחת התא יכול לשמש כדי להכין את הרכיבים הנותרים כמתואר להלן. התאים שנקטפו הם אז lysed על ידי sonication, הובהר, ולעבור תגובה בורחת. בשלב זה של הכנה, תמציות התא יכול להיות מוכן לאחסון לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) כדי למזער את אובדן הפעילות. עבור הרכבה של תגובות TX-TL באמצעות פרוטוקול זה, Streptomyces מאסטר Mix (SMM) מוצג, עם אפשרות של תבנית פתרון אנרגיה מינימלית (MES) המעניקה תשואות דומות. כמו כן, מומלץ פס תרבות טרייה של S. ונצואלה ATCC 10712 ממלאי גליצרול -80 °C (80 °F) על צלחת אגר חדר כושר ודגור ב 28 °C (68 °F) לפחות 48-72 שעות עד מושבות בודדות גלויים. יש להשתמש רק בתרבויות טריות עבור השלבים הבאים.
הערה: ראה טבלה 1 ושולחן 2 למתכונים עבור צלחת מדיום ואגר GYM ומאגרי S30A ו- S30B.
1. הכנת פתרונות והדרכה כללית
2. הכנת תאי ATCC 10712 של S. ונצואלה
3. תמוגה תא על ידי sonication כדי להשיג את תמצית התא הגס
הערה: בשלב זה, המשתמש יכול לבחור לשבש את התאים על ידי sonication או שברי מ"ל 1 (אפשרות 1) או כמו השעיה תא גדול יותר (5 מ"ל) בצינור 50 מ"ל (אפשרות 2). שתי האפשרויות פורטו להלן כדי להבטיח רבייה, כמו הנפח הסופי של ההשעיה התא יכול להשתנות עקב אובדן תאים במהלך שלבי קציר ושטיפה קודמים. משתמש חדש צריך לנסות תחילה את האפשרות 2.1 כדי ליצור את הפרוטוקול.
4. הבהרת תמצית תאים ותגובת בריחה
5. הכנת תבנית דנ"א פלסמיד
6. הכנת פתרון תמהיל מאסטר סטרפטומיצ'ס (SMM)
7. הגדרת תגובת TX-TL סטנדרטית של S. ונצואלה
פרוטוקול מפורט זה מסופק כדוגמה כדי לסייע למשתמש להקים מערכת Streptomyces TX-TL המבוססת על זן הדגם ATCC 10712 של S. ונצואלה (איור 1). המשתמש עשוי לבקש לחקור זנים אחרים סטרפטומיצ'ס; עם זאת, שלבי הצמיחה/קציר של זנים אחרים עם זמני הכפלה ארוכים יותר או העדפות צמיחה ברורות יצטרכו ל...
בכתב יד זה תואר פרוטוקול TX-TL של S. ונצואלה בעל תפוקה גבוהה עם צעדים מפורטים שהם פשוטים לניהול עבור משתמשים מנוסים וחדשים של מערכות TX-TL. מספר תכונות מפרוטוקולי Streptomyces45 ו- E. coli TX-TL41 הקיימים הוסרו כדי ליצור פרוטוקול מינימלי אך בעל תפוקה גבוהה עבור S. venezuelae TX-TL5,26.
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
המחברים רוצים להכיר בתמיכה המחקרית הבאה: EPSRC [EP/K038648/1] עבור SJM כ- PDRA עם PSF; Wellcome Trust מימנה את מלגת ISSF עבור SJM עם PSF באימפריאל קולג' בלונדון; מענק המחקר של החברה המלכותית [RGS\R1\191186]; פרס Wellcome Trust SEED [217528/Z/Z/19/Z] עבור SJM באוניברסיטת קנט; ומלגת דוקטורט ל-Ph.D. של קרן מחקר האתגרים הגלובליים (GCRF) עבור KC באוניברסיטת קנט.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved