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Résumé

Ce protocole détaille une méthode améliorée pour synthétiser des rendements élevés de protéines recombinantes à partir d’un système de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Résumé

Streptomyces spp. sont une source majeure d’antibiotiques cliniques et de produits chimiques industriels. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 est une souche à croissance rapide et un producteur naturel de chloramphénicol, de jadomycine et de pikromycine, ce qui en fait un candidat attrayant en tant que châssis de biologie synthétique de nouvelle génération. Par conséquent, les outils génétiques qui accélèrent le développement de S. venezuelae ATCC 10712, ainsi que d’autres modèles Streptomyces spp., sont hautement souhaitables pour l’ingénierie et la découverte de produits naturels. À cette fin, un système dédié sans cellules S. venezuelae ATCC 10712 est fourni dans ce protocole pour permettre l’expression hétérologue à haut rendement des gènes G + C élevés (%) Ce protocole convient aux réactions par lots à petite échelle (10-100 μL) dans un format de plaque de 96 puits ou de 384 puits, tandis que les réactions sont potentiellement évolutives. Le système sans cellules est robuste et peut atteindre des rendements élevés (~ 5-10 μ M) pour une gamme de protéines recombinantes dans une configuration minimale. Ce travail intègre également un large ensemble d’outils plasmidiques pour la mesure en temps réel de la synthèse de l’ARNm et des protéines, ainsi que la coloration par fluorescence dans le gel des protéines marquées. Ce protocole peut également être intégré à des flux de travail de caractérisation de l’expression génique à haut débit ou à l’étude des voies enzymatiques des gènes G +C (%) élevés présents dans les génomes des Actinomycètes.

Introduction

Les systèmes de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) fournissent une plate-forme de prototypage idéale pour la biologie synthétique afin de mettre en œuvre des cycles rapides de conception-construction-test-apprentissage, le cadre d’ingénierie conceptuelle pour la biologie synthétique1. En outre, les systèmes TX-TL suscitent un intérêt croissant pour la production de protéines recombinantes de grande valeur dans un environnement à réaction ouverte2, par exemple pour incorporer des acides aminés non standard dans des conjugués anticorps-médicament3. Plus précisément, TX-TL nécessite un extrait cellulaire, un plasmide ou un ADN linéaire et une solution énergétique pour catalyser la synthèse des protéines dans des réactions discontinues ou semi-continues. Alors qu’Escherichia coli TX-TL est le système dominant sans cellules, un certain nombre de systèmes TX-TL émergents non modèles ont attiré l’attention pour différentes applications4,5,6,7,8. Les principaux avantages du TX-TL incluent une évolutivité flexible (échelle nanolitre à litre)9,10, une forte reproductibilité et des flux de travail automatisés8,11,12. En particulier, l’automatisation du TX-TL permet la caractérisation accélérée des parties génétiques et des éléments régulateurs8,12,13.

En termes de configuration de la réaction, TX-TL nécessite des sources d’énergie primaires et secondaires, ainsi que des acides aminés, des cofacteurs, des additifs et une séquence d’ADN modèle. Les triphosphates nucléotidiques (NTP) fournissent la source d’énergie primaire pour piloter l’ARNm initial (ATP, GTP, CTP et UTP) et la synthèse des protéines (uniquement ATP et GTP). Pour augmenter les rendements TX-TL, les NTP sont régénérés par le catabolisme d’une source d’énergie secondaire, telle que le maltose14, la maltodextrine15, le glucose14, le 3-phosphoglycérate (3-PGA)16, le phosphoénolpyruvate17 et le L-glutamate18. Cette activité métabolique inhérente est étonnamment polyvalente, mais peu étudiée, en particulier dans les systèmes TX-TL émergents. Chaque source d’énergie a des propriétés et des avantages distincts en termes de rendement en ATP, de stabilité chimique et de coût, ce qui est une considération importante pour les réactions TX-TL à grande échelle. Jusqu’à présent, les protocoles actuels pour E. coli TX-TL ont atteint jusqu’à 4,0 mg/mL (~157 μM) pour la protéine fluorescente verte modèle (GFP), en utilisant un mélange de 3-PGA (30 mM), de maltodextrine (60 mM) et de D-ribose (30 mM) comme source d’énergie secondaire19.

Récemment, il y a eu un intérêt croissant pour l’étude des voies biosynthétiques des métabolites secondaires dans les systèmes TX-TL20,21,22. Plus précisément, les actinobactéries sont une source majeure de métabolites secondaires, y compris les antibiotiques et les produits chimiques agricoles23,24. Leurs génomes sont enrichis de groupes de gènes biosynthétiques (BGC), qui codent des voies enzymatiques pour la biosynthèse des métabolites secondaires. Pour l’étude des parties génétiques des actinobactéries et des voies biosynthétiques, une gamme de systèmes TX-TL à base de streptomyces a récemment été développée5,6,25,26. Ces systèmes spécialisés Streptomyces TX-TL sont potentiellement bénéfiques pour les raisons suivantes : [1] fourniture d’un environnement de repliement protéique natif pour les enzymes de Streptomyces spp.26 ; [2] accès à un pool d’ARNt optimal pour une expression génique G+C (%) élevée ; [3] métabolisme primaire actif, qui peut potentiellement être détourné pour la fourniture de précurseurs biosynthétiques; et [4] fourniture d’enzymes, de précurseurs ou de cofacteurs issus du métabolisme secondaire présents dans l’extrait de cellule native. Par conséquent, une boîte à outils S.venezuelae TX-TL à haut rendement a récemment été mise en place pour exploiter ces capacités uniques5.

Streptomyces venezuelae est un hôte émergent pour la biologie synthétique avec une riche histoire en biotechnologie industrielle5,27,28,29 et en tant que système modèle pour l’étude de la division cellulaire et de la régulation génétique chez les Actinobactéries30,31,32. La souche de type principal, S. venezuelae ATCC 10712, a un génome relativement grand de 8,22 Mb avec une teneur en G+C de 72,5% (%) (numéro d’acquisition: CP029197), qui code 7377 séquences codantes, 21 ARNr, 67 ARNt et 30 groupes de gènes biosynthétiques27. En biologie synthétique, S. venezuelae ATCC 10712 est un châssis attrayant pour l’expression hétérologue des voies biosynthétiques. Contrairement à la plupart des autres taches streptomyces, il offre plusieurs avantages clés, notamment un temps de doublement rapide (~ 40 min), une vaste gamme d’outils génétiques et expérimentaux5,28, l’absence d’agglutination mycélienne et la sporulation dans les milieux liquides28,33. Plusieurs études ont également démontré l’utilisation de S. venezuelae pour la production hétérologue d’un large éventail de métabolites secondaires, y compris les polycétides, les peptides ribosomiques et non ribosomaux34,35,36,37,38. Ces caractéristiques combinées font de cette souche un hôte microbien attrayant pour les applications de biologie synthétique et d’ingénierie métabolique. Bien que S. venezuelae ne soit pas le modèle dominant de Streptomyces pour l’expression des gènes hétérologues, avec d’autres développements, il est prêt pour une utilisation plus large dans la découverte de produits naturels.

Ce manuscrit présente un protocole détaillé (Figure 1) pour un système S. venezuelae TX-TL à haut rendement, qui a été mis à jour par rapport au protocole original précédemment publié26. Dans ce travail, la solution énergétique et les conditions de réaction ont été optimisées pour augmenter le rendement en protéines jusqu’à 260 μg/mL pour la protéine rapporteure mScarlet-I dans une réaction par lots de 4 h, 10 μL, en utilisant un plasmide standard, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Ce plasmide a été spécialement conçu pour permettre diverses méthodes de détection de l’expression des protéines. Le protocole est également rationalisé, tandis que le système énergétique a été optimisé pour réduire la complexité et le coût de la mise en place de réactions sans cellules sans compromettre le rendement. Parallèlement au système TX-TL optimisé, une bibliothèque de parties génétiques a été développée pour affiner l’expression des gènes et en tant qu’outils fluorescents pour surveiller TX-TL en temps réel, créant ainsi une plate-forme polyvalente pour le prototypage de l’expression génique et des voies biosynthétiques de produits naturels de Streptomyces spp. et d’Actinobactéries apparentées.

Dans ce travail, le plasmide standard recommandé (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) peut être utilisé pour établir le flux de travail S. venezuelae TX-TL dans un nouveau laboratoire et est disponible sur AddGene (voir le tableau supplémentaire S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I offre à l’utilisateur la flexibilité d’étudier d’autres cadres de lecture ouverts (ORF). L’ORF mScarlet-I est optimisé pour le codon pour l’expression du gène S. venezuelae. Le promoteur SP44 est un puissant promoteur constitutif qui est très actif chez E. coli et Streptomyces spp.39. Le plasmide possède deux sites enzymatiques de restriction uniques (NdeI, BamHI) pour permettre le sous-clonage de nouveaux ORF dans le cadre avec un marqueur FLAG C-terminal commun et un système d’étiquette de liant en épingle à cheveux arsenical de la fluorescéine (FlAsH). Alternativement, les deux étiquettes peuvent être retirées avec l’inclusion d’un codon stop après le sous-clonage d’un nouveau gène. Avec ce vecteur de base, l’expression à haut rendement d’une gamme de protéines a été démontrée, à savoir des protéines de la voie de biosynthèse de l’oxytétracycline et une peptide synthétase non ribosomale non caractérisée (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figure 2). En termes de détection de l’ARNm, le plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I contient un aptamère dBroccoli (dans la région 3'-non traduite) pour la détection avec la sonde 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolinone (DFHBI). Pour une flexibilité accrue, un ensemble d’outils de pièces MoClo compatibles EcoFlex40 a également été mis à disposition sur AddGene, y compris un vecteur navette Streptomyces compatible EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) et une gamme de plasmides variants pTU1-A-SP44 exprimant la protéine de fluorescence verte superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I et β-glucuronidase (GUS). En particulier, le plasmide pSF1C-A est dérivé de pAV-gapdh28 et est guéri des sites BsaI/BsmBI pour l’assemblage MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP est équivalent à pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP d’EcoFlex40 mais contient des fonctionnalités supplémentaires pour la conjugaison et l’intégration chromosomique dans Streptomyces spp. en utilisant le système d’intégration phiC3128.

La première étape du protocole implique la croissance de la S. venezuelae ATCC 10712 ou d’une souche étroitement apparentée, la récolte de cellules à mi-exponentielle, les étapes de lavage des cellules et l’équilibrage dans les tampons S30A et S30B. Cette étape nécessite trois jours et le temps nécessaire à la croissance cellulaire peut être utilisé pour préparer les composants restants comme décrit ci-dessous. Les cellules récoltées sont ensuite lysées par sonication, clarifiées et subissent une réaction de ruissellement. À cette étape finale de la préparation, les extraits cellulaires peuvent être préparés pour un stockage à long terme à -80 ° C afin de minimiser la perte d’activité. Pour l’assemblage des réactions TX-TL à l’aide de ce protocole, un Streptomyces Master Mix (SMM) est présenté, avec l’option d’un format MES (Minimal Energy Solution) qui donne des rendements comparables. En outre, il est recommandé de strier une culture fraîche de S. venezuelae ATCC 10712 à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de gélose GYM et d’incuber à 28 °C pendant au moins 48 à 72 h jusqu’à ce que des colonies uniques soient visibles. Seules les cultures fraîches doivent être utilisées pour les étapes suivantes.

Protocole

REMARQUE: Voir le tableau 1 et le tableau 2 pour les recettes de gym medium et de plaque de gélose et de tampons de lavage S30A et S30B.

1. Préparation des solutions et orientations générales

  1. Conservez toutes les solutions, cellules (post-croissance) et extraits de cellules sur la glace après la préparation, sauf exception.
  2. Stocker les stocks de 1 M Mg-glutamate, 4 M K-glutamate, 40% (p / v) PEG 6000, 1 g / mL d’acide polyvinylsulfonique à température ambiante et tous les autres stocks à -80 ° C. Minimiser le nombre de cycles de gel-dégel pour éviter la dégradation chimique.
  3. Pour la préparation de stocks de solutions énergétiques (voir tableau 3) tels que le 3-PGA (nécessite un ajustement du pH), suivez les directives fournies dans le protocole E. coli TX-TL41.
    REMARQUE: Tous les composants sont entièrement solubles dans le ddH2O et stockés sous forme d’aliquotes dans le congélateur à -80 ° C.
  4. Dégivrer des stocks individuels ou des solutions énergétiques (décrites plus loin) sur de la glace. Chauffer le stock d’acides aminés à 42 °C avec un vortex pendant ~15-30 min pour solubiliser tous les acides aminés.
  5. Comme certains acides aminés (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) précipitent sur la glace, tout en minimisant le temps de repos, laissez cette solution à température ambiante et utilisez un vortex pour se dissoudre.
  6. Ajouter les volumes calculés (tableau 3) de solutions mères et d’eau et bien mélanger à l’aide d’un vortex.
  7. Aliquoter la solution énergétique sous forme d’aliquotes de 20 à 100 μL par tube ou, selon vos besoins, sur de la glace et conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Préparation des cellules S. venezuelae ATCC 10712

  1. Jour 1 - Préparation des milieux/tampons et pré-culture pendant la nuit
    1. Préparer 1 L de milieu liquide stérile GYM dans une fiole déconcertée de 2 L, comme décrit dans le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour connaître les sources d’équipement,de produits chimiques et de réactifs.
    2. Préparer 1 x 50 mL de milieu liquide stérile GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL, comme décrit dans le tableau 1.
    3. Préparer 100 mL de 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 mL de 1 M MgCl2 et 500 mL de 4 M NH4Cl pour fabriquer 1 L de tampons de lavage S30A et 1 L de tampons de lavage S30B. Voir tableau 2 pour les recettes.
    4. Préparez la pré-culture du jour au lendemain. Préchauffer les 50 mL stériles du milieu liquide GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL à 28 °C pendant 30 min.
    5. Inoculer une seule colonie de S. venezuelae ATCC 10712 (ou souche apparentée) à partir d’une plaque de gélose GYM dans 50 mL de milieu liquide GYM préavertissé et incuber à 28 °C, 200 tr/min pendant 16 h (pré-culture pendant la nuit).
  2. Jour 2- Préparer la pré-culture diurne et la culture de croissance principale.
    1. Préchauffer 50 mL de milieu liquide stérile GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL à 28 °C pendant 30 min.
    2. Transférer 1 mL de pré-culture pendant la nuit dans 50 mL de milieu liquide GYM préchauffé et incuber à 28 °C, 200 tr/min pendant 8 h (pré-culture diurne).
    3. Après cette période de croissance, vérifiez l’OD600 dans un spectrophotomètre à l’aide d’une dilution 1:10 avec un milieu GYM stérile dans une cuvette en plastique de 1 mL (longueur de trajet de 1 cm).
      REMARQUE: L’OD600 doit avoir atteint au moins 3-4. S’il y a une mauvaise croissance, il est conseillé de répéter les étapes 2.2.1-2.2.2.
    4. Sous-culture 0,25 mL de pré-culture diurne dans 1 L de milieu liquide GYM dans des flacons déconcertés de 2 L.
    5. Agiter toute la nuit à 28 °C, 200 tr/min pendant 14 h.
  3. Jour 3- Récolter des cellules
    1. Après la période d’incubation précédente (14 h), enregistrez l’OD600 de la culture principale. Diluer la culture pendant la nuit 1:10 avec un milieu GYM frais pour la mesure de l’OD600 .
      REMARQUE: L’OD600 devrait avoir atteint 3.0-4.0 à ce stade.
    2. Si OD600<3.0, augmentez la vitesse de secousse à 250-300 tr/min et augmentez jusqu’à ce qu’un OD600 de 3.0 soit atteint. Ne pas cultiver plus de 2 h supplémentaires (16 h au total).
    3. Si OD600>3.0, transférer les cultures dans des récipients de centrifugation et refroidir rapidement sur de la glace humide pendant 30 min.
    4. En attendant que la culture cellulaire refroidisse sur la glace, préparez 4 mL de tampons frais de 1 M de dithiothréitol (TNT), S30A et S30B, comme décrit dans le tableau 1, et conservez-les sur la glace. Voir le tableau des matériaux pour la source chimique/réactif.
    5. Pré-peser un tube de centrifugeuse vide de 50 mL et pré-refroidir à -20 °C.
    6. Ajouter 2 mL de 1 M TNT à 1 L de tampon S30A sur glace et bien mélanger.
      REMARQUE: Ajoutez DTT aux tampons de lavage S30A et S30B uniquement avant de les utiliser.
    7. Centrifugez les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 10 min, et jetez soigneusement le surnageant en un seul mouvement rapide.
      REMARQUE: Si la pastille est perturbée, maximiser la rétention cellulaire avec le milieu GYM résiduel et poursuivre le protocole.
    8. Ajouter 500 mL de tampon S30A et remettre en suspension les cellules en secouant vigoureusement les bouteilles de centrifugation jusqu’à ce que les amas cellulaires soient dispersés de manière homogène.
    9. Centrifugez les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 6 min et jetez soigneusement le surnageant.
      REMARQUE : Bien que la pastille de cellule soit plus ferme à ce stade, certaines cellules resteront en suspension (voir la figure 1). Traiter comme décrit au point 2.3.7 et retenir autant de cellules que possible.
    10. Répétez les étapes 2.3.8 à 2.3.9.
    11. Ajouter 2 mL de 1 M TNT à 1 L de tampon S30B sur la glace et bien mélanger. Ajoutez 500 mL de tampon S30B aux cellules. Répétez l’étape 2.3.9.
    12. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de tampon S30B et la transférer dans le tube centrifugeur de 50 mL pré-pesé et pré-réfrigéré. Si nécessaire, transférez les cellules résiduelles avec 5 à 10 mL supplémentaires de tampon S30B. Remplir à 50 mL avec S30B.
    13. Centrifuger les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 10 min, et éliminer soigneusement le surnageant.
    14. Répétez l’étape 2.3.13.
    15. Aspirer soigneusement le surnageant S30B restant avec une pipette de 100 à 200 μL.
    16. Peser la pastille de cellule humide.
      REMARQUE: Le poids typique des granulés de cellules humides pour 1 L de culture GYM pendant la nuit (OD600 = 3,0) est d’environ 4,5 g.
    17. Pour chaque 1 g de cellules humides, ajoutez 0,9 mL de tampon S30B. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un vortex.
    18. Centrifuger brièvement (~10 s) jusqu’à 500 × g pour sédimenter les cellules.
      REMARQUE: Le protocole peut être suspendu à ce stade, et les cellules peuvent être congelées sur de l’azote liquide ou de la glace carbonique et stockées à -80 ° C. Pour des raisons de sécurité, portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez de l’azote liquide, y compris des écrans faciaux et des gants.

3. Lyse cellulaire par sonication pour obtenir l’extrait cellulaire brut

REMARQUE: À ce stade, l’utilisateur peut choisir de perturber les cellules par sonication soit en fractions de 1 mL (option 1), soit en suspension cellulaire plus grande (5 mL) dans un tube de 50 mL (option 2). Les deux options ont été détaillées ci-dessous pour assurer la reproductibilité, car le volume final de la suspension cellulaire peut changer en raison de la perte de cellules lors des étapes précédentes de récolte et de lavage. Un nouvel utilisateur doit d’abord essayer l’option 2.1 pour établir le protocole.

  1. Lyse cellulaire par sonication en fractions de 1 mL
    1. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL (couper l’extrémité de la pointe pour augmenter la taille de l’alésage), transférer 1 mL de la suspension de la cellule dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL.
      REMARQUE: Si les cellules sont congelées, décongeler rapidement le tube de 50 mL contenant la pastille dans de l’eau tiède avant la lyse cellulaire. Transférer le tube sur de la glace humide dès que la pastille a commencé à décongeler et refroidir pendant 10 minutes.
    2. Placez chaque tube de microcentrifugation dans un bécher d’eau glacée, en utilisant un support à tubes en plastique pour maintenir le tube pour la sonication.
      REMARQUE: En raison de la sensibilité de l’extrait cellulaire à la surchauffe, il est essentiel de s’assurer que les tubes ne se réchauffent pas pour empêcher la précipitation des protéines et réduire l’activité enzymatique.
    3. Utilisez une sonde sonique avec une pointe de 3 mm de diamètre et nettoyez-la avec de l’éthanol à 70% (v / v) et de l’eau distillée en double (ddH2O). Abaissez la pointe du sonicateur dans la suspension de la cellule jusqu’à ce qu’elle soit à environ 1 cm sous la surface du liquide.
    4. Entrez les paramètres suivants dans le sonicator: fréquence 20 kHz, amplitude 65%, temps ON d’impulsion de 10 s, temps d’arrêt d’impulsion de 10 s, temps de sonication total de 1 min.
    5. Exécutez le protocole de sonication. Déplacez le tube vers le haut / vers le bas et latéralement pendant les deux premiers cycles de repos pour vous assurer que les cellules sont soniquées uniformément. Enregistrez l’apport d’énergie.
      REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez une protection auditive appropriée pendant la sonication. La viscosité diminuera à mesure que les cellules seront perturbées, et la pastille de cellule humide crème pâle devrait se transformer en un fluide brun homogène. L’apport énergétique recommandé est de 240 J par mL de cellules humides. Si les cellules ne sont que partiellement lysées, la suspension apparaîtra toujours de couleur crème avec des amas visqueux de cellules, en particulier sur les côtés du tube.
    6. Inverser le tube 2-3 fois et répéter la sonication pendant un ou deux cycles supplémentaires de 10 s, en mélangeant fréquemment jusqu’à ce que les cellules soient complètement perturbées.
  2. Lyse cellulaire par sonication d’une suspension cellulaire de 5 mL
    1. Si les cellules sont congelées, décongeler rapidement le tube de 50 mL contenant la pastille dans de l’eau tiède en agitant avant la lyse cellulaire. Transférer le tube sur de la glace humide dès que la pastille a commencé à décongeler et refroidir pendant 10 minutes.
    2. Faites tourner brièvement le tube à 500 x g pour sédimenter les cellules.
    3. Placez le tube de 50 mL dans un bécher d’eau glacée pour la sonication.
      REMARQUE: En raison de la sensibilité de l’extrait cellulaire à la surchauffe, il est essentiel de s’assurer que les tubes ne se réchauffent pas pour empêcher la précipitation des protéines et réduire l’activité enzymatique.
    4. Utilisez une sonde sonique avec une pointe de 6 mm de diamètre et nettoyez-la avec de l’éthanol à 70 % (v/v) et du ddH2O (voir le schéma visuel de la sonde de 6 mm à la figure 1). Abaissez la pointe du sonicateur dans la suspension de la cellule (~5 mL) jusqu’à ce qu’elle soit à ~1 cm sous la surface du liquide.
    5. Entrez les paramètres suivants dans le sonicator : fréquence 20 kHz, amplitude 65 %, temps ON d’impulsion de 10 s, temps d’arrêt d’impulsion de 10 s, temps de sonication total de 1 min par mL de cellules humides (5 min au total).
    6. Exécutez le protocole de sonication. Déplacez le tube vers le haut / vers le bas et latéralement pendant les deux premiers cycles de repos pour vous assurer que les cellules sont soniquées uniformément.
      REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez une protection auditive appropriée pendant la sonication. La viscosité diminuera à mesure que les cellules seront perturbées et que la pastille de cellule humide crème pâle devrait se transformer en un fluide brun homogène. Enregistrez l’apport d’énergie. Un apport énergétique optimal de 240 J par mL de cellules humides (~1200 J au total à partir de 5 min de sonication) est recommandé.
    7. Si certaines cellules restent intactes, suivez les instructions de l’étape 3.1.5.
    8. Transférer les extraits cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL.

4. Clarification de l’extrait cellulaire et réaction de ruissellement

  1. Centrifuger les cellules lysées à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sous forme d’aliquotes de 1 mL.
  2. Effectuer la réaction de ruissellement pour les extraits de cellules. Incuber les tubes de 1,5 mL contenant les extraits cellulaires à 30 °C pendant 60 min sur un bloc thermique ou un incubateur sans secousse.
  3. Centrifuger les extraits de cellules à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Regrouper les surnageants dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Mélangez le surnageant en inversant le tube cinq fois jusqu’à ce qu’il soit homogène, puis conservez-le sur la glace. Inverser doucement pour éviter la formation de bulles d’air.
  4. Diluer 10 μL de l’extrait cellulaire 100 fois avec un tampon S30B et mesurer la concentration totale en protéines à l’aide d’un test de Bradford avec trois répétitions techniques (voir Le matériau supplémentaire S2 pour les conseils de test de Bradford).
  5. Si la concentration en protéines est de 20 à 25 mg/mL, transférer les extraits cellulaires sous forme de aliquotes de 100 μL dans de nouveaux tubes de 1,5 mL, congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
    REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez un EPI approprié lorsque vous manipulez de l’azote liquide, y compris des écrans faciaux et des gants.
  6. Si la concentration en protéines est de <20 mg/mL, répétez les étapes de préparation de l’extrait brut pour vous assurer que les rendements en extrait cellulaire et en TX-TL de haute qualité sont comparables aux travaux publiés précédemment5.

5. Préparation du gabarit d’ADN plasmidique

  1. Purifier le plasmide pTU1-A-SP44-mScarlet-I (origine pUC19) d’une souche de plasmide E. coli fraîchement transformée (DH10β, JM109) cultivée dans 50 mL de culture LB (avec 100 mg/mL de carbenicilline) à l’aide d’un kit de purification de l’ADN plasmidique approprié conformément aux instructions du fabricant.
  2. Éluez le plasmide dans 2 x 300 μL d’eau sans nucléase et combinez les fractions.
  3. Ajouter 0,1 volume (66 μL) d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2).
  4. Ajouter 0,7 volume (462 μL) d’isopropanol.
  5. Incuber l’ADN à -20 °C pendant 30 min.
  6. Centrifuger à 16 000 × g pendant 30 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  7. Ajouter 2 mL d’éthanol à 70 % (v/v) à la pastille d’ADN.
  8. Inverser le tube 3-4 fois pour remettre en suspension la pastille d’ADN plasmidique.
  9. Centrifuger à 16 000 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  10. Répétez les étapes 5.7 à 5.9 et retirez tout le liquide visible.
  11. Sécher à l’air libre la pastille d’ADN pendant 10-30 min ou sécher pendant 5 min avec une centrifugeuse à vide.
  12. Remettre en suspension la pastille séchée avec 600 μL de ddH2O sans nucléase.
  13. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
  14. Préparer des aliquotes de 50 à 100 μL et les conserver à -20 °C.
    REMARQUE: Une concentration élevée d’ADN dans la gamme de 500-1000 ng / μL est recommandée en raison des contraintes de volume serrées des réactions sans cellules. Diluer le stock d’ADN plasmidique à 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide équivaut à 80 nM.

6. Préparation de la solution Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Solution d’acides aminés
    1. Utilisez le kit d’échantillonneur d’acides aminés pour éviter les erreurs manuelles et réduire le temps de préparation, en suivant les instructions du fabricant fournies en ligne.
    2. Diluer la solution mère d’acides aminés 20x en utilisant ddH2O à une concentration finale de 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Diluer davantage à 2,4 mM (2 mM L-Leu) dans la solution 2,4x SMM (voir tableau 3).
      REMARQUE: La concentration finale dans la réaction TX-TL est de 1 mM 19x d’acides aminés et de 0,83 mM de L-Leu.
  2. Solution énergétique et additifs
    1. Préparez les autres composants de la solution SMM 2,4x en suivant la recette décrite dans le tableau 3.
    2. Vous pouvez également préparer une solution énergétique minimale (MES) 2,4x, en suivant la recette décrite dans le tableau 3.

7. Mise en place d’une réaction S. venezuelae TX-TL standard

  1. Décongeler l’extrait cellulaire, la solution SMM (ou MES) et l’ADN plasmidique sur la glace. Pré-refroidir une plaque de 384 puits à -20 °C.
  2. Mettre en place des réactions TX-TL où 25% du volume est de l’ADN plasmidique, 33,33% est de l’extrait de cellule et 41,67% est une solution de SMM ; gardez-les sur la glace pour éviter le biais de l’heure de début.
    REMARQUE : Un modèle TX-TL standard a été fourni (tableau 4) pour calculer le volume de réactifs nécessaires en fonction du nombre de réactions. Le volume standard pour une réaction de 33 μL est le suivant : 11 μL d’extrait cellulaire, 13,75 μL de SMM et 8,25 μL d’ADN plasmidique.
  3. Vaporisez doucement le mélange pendant environ 5 s à basse vitesse pour vous assurer que la solution est homogène. Évitez la formation de mousse ou de bulles.
  4. Transférer des aliquotes de 10 μL dans trois puits d’une plaque de 384 puits en tant que triplicate technique sans introduire de bulles d’air. Scellez la plaque avec un couvercle transparent et faites tourner à 400 × g pendant 5 s.
  5. Incuber la réaction à 28 °C soit dans un incubateur (pour les lectures de point final) ou dans un lecteur de plaques sans secousse.
    REMARQUE: Les réactions nécessitent généralement 3-4 h pour atteindre leur achèvement. Voir Matériau supplémentaire S2 pour obtenir des conseils sur un lecteur de plaques et les mesures standard mScarlet-I.

Résultats

Ce protocole détaillé est fourni à titre d’exemple pour aider l’utilisateur à établir un système Streptomyces TX-TL basé sur la souche modèle S. venezuelae ATCC 10712 (Figure 1). L’utilisateur peut chercher à étudier d’autres souches de Streptomyces; cependant, les étapes de croissance/récolte d’autres souches avec des temps de doublement plus longs ou des préférences de croissance distinctes devront être optimisées sur mesure pour obtenir...

Discussion

Dans ce manuscrit, un protocole S. venezuelae TX-TL à haut rendement a été décrit avec des étapes détaillées qui sont simples à mener pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux des systèmes TX-TL. Plusieurs caractéristiques des protocoles Streptomyces45 et E. coli TX-TL41 existants ont été supprimées pour établir un protocole minimal, mais à haut rendement pour S. venezuelae TX-TL5,26.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner le soutien à la recherche suivant : EPSRC [EP/K038648/1] pour SJM en tant que PDRA avec PSF; Wellcome Trust a parrainé une bourse ISSF pour SJM avec PSF à l’Imperial College de Londres; Subvention de recherche de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Prix Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] pour SJM à l’Université du Kent; et bourse de doctorat du Global Challenges Research Fund (GCRF) pour KC à l’Université du Kent.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 L UltraYield FlaskThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well Black/Clear Bottom PlateThermoFisher10692202
Ammonium chloride (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)MelfordG32040
DFHBI (≥98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contact supplier for purity)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)MelfordB2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)Sigma49605
Magnesium chloride (98%)Fluorochem494356
Malt extractSigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly(vinyl sulfate) potassium saltSigma271969
Potassium glutamate (>99%)SigmaG1149
RTS amino acid sampler5 Prime2401530
Sodium chloride (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)Sigma505471
Yeast ExtractMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega

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