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摘要

该协议的目标是使用半靶向色谱 - 质谱法检测血浆中的酚类代谢物。

摘要

一组23名老年人被给予功能性膳食（饮料和松饼），这些膳食是专门为预防肌肉减少症（与年龄相关的肌肉质量损失）而配制的。在干预开始时和食用功能性膳食30天后采集血浆样本。进行半靶向超高效色谱结合串联质量（UPLC-MS / MS）分析以鉴定酚类化合物及其代谢物。用乙醇沉淀血浆蛋白，浓缩样品并重悬于流动相（1:1乙腈:水）中，然后注射到UPLC-MS / MS仪器中。用C18 反相柱进行分离，并利用其实验质量，同位素分布和片段模式鉴定化合物。将感兴趣的化合物与数据库和内部半目标图书馆的化合物进行比较。初步结果表明，干预后鉴定出的主要代谢物为苯乙酸、甘氨酸、3-羟基苯戊酸和地黄素M2。

引言

肌肉减少症是一种进行性骨骼疾病，与老年人群肌肉加速丧失有关。这种情况会增加跌倒的风险，并导致日常生活活动有限。肌肉减少症见于约 5%-10% 的 65 岁以上人群和约 50% 的 80 岁或以上人群1。尚未批准用于治疗肌肉减少症的特定药物，因此通过身体活动和均衡饮食进行预防非常重要1，2。使用富含乳蛋白和必需氨基酸的特殊配方食品进行营养干预，在预防肌肉减少症方面显示出积极的结果2。在其他研究中，作者在饮食中加入了维生素和抗氧化剂，如维生素E和异黄酮，增加了腰部和臀部肌肉增加的益处3。

Brosimum alicastrum Sw.（Ramón）是一种生长在墨西哥热带地区的树木;由于其高营养价值，它已被玛雅文化食用4。它是蛋白质，纤维，矿物质和酚类抗氧化剂（如绿原酸5）的良好来源。由于它可以磨成粉末并用于烘焙产品或饮料中食用，最近的研究已经评估了将Ramón种子粉（RSF）掺入不同的食物中以提高其营养价值。配制了RSF补充的卡布奇诺风味饮料，该饮料富含膳食纤维，每份含有超过6克蛋白质，并被消费者高度接受;因此，它被认为是满足特殊饮食要求的潜在替代方案6。在一项后续研究中，RSF还用于配制松饼和富含蛋白质，膳食纤维，微量营养素和酚类抗氧化剂的新饮料。松饼和饮料用于老年人的饮食干预，他们每天食用两次产品，持续30天。在此期间之后，参与者的营养和肌肉减少状况有所改善，血浆的总酚含量增加7。然而，血浆中总酚类化合物的测定是通过分光光度法进行的，因此无法鉴定被吸收的实际酚类化合物;此外，这种方法对酚类化合物并不完全特异，因此可能会发生一些高估8。

鉴定和定量食用富含这些抗氧化剂的食物后被吸收的酚类化合物是一项艰巨的任务，但对于证明这些植物化学物质的生物活性是必要的。大多数酚类化合物的生物利用度较低;其中不到5%可以在血浆中没有结构转变的情况下被发现。酚类化合物经历几种生物转化，如甲基化、磺化或葡萄糖醛酸化，由肠细胞和肝细胞9进行。酚类化合物也被微生物群生物转化成细菌分解代谢物，这些分解代谢物在被吸收到血浆中后可能在体内发挥其有益作用10。例如，苯乙酸是类黄酮和低聚原花青素的细菌转化的产物，其可以抑制蔓越莓食用后尿道中高达40%的细菌（大肠杆菌）粘附11。

天然存在的酚类化合物的结构多样性，加上其代谢物的多样性和低生物利用度，使它们在血浆中的鉴定更具挑战性。使用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS / MS）等光谱分析平台进行代谢组学分析可能是实现这一目标的最佳方法;不幸的是，该设备不容易获得，分析协议的开发仍然有限12。一些研究报告了MS / MS与分离系统（如液相色谱）相结合，作为降低代谢组学研究中质谱复杂性的策略。与传统的高效液体实验方案相比，最近引入的超高效液相色谱（UPLC）分离方法缩短了分析时间，提高了分辨率和灵敏度，因此UPLC-MS/MS系统已迅速被分析代谢组学界广泛接受13。通过这种方式，一些研究调查了酚类代谢物，并检测了蔓越莓摄入后个体血浆中来自咖啡酸、槲皮素和阿魏酸的葡萄糖醛酸衍生物，以及来自注射剂和香草酸的磺化衍生物14。以前的方案旨在发现生物流体（如血浆）中的酚类化合物和酚类代谢物。这些实验方案基于高效液相色谱（HPLC）耦合到紫外可见分光检测器15的鉴定和定量。然而，此类方案要求使用真实标准来评估绝对鉴定和准确定量。广泛的研究已经确定了UPLC-MS和UPLC-MS / MS生物流体（磺化，葡萄糖醛酸化和甲基化形式）中最常见的代谢物;然而，由于缺乏包含其完整信息的数据库，很大一部分细菌代谢物尚未被报道16。代谢物鉴定因代谢物标准品的成本和商业可用性而变得复杂。因此，最佳策略可能是无靶向或半靶向MS / MS代谢物分析，其依赖于使用分子特征信息（m / z，同位素精确质量，同位素分布和片段化模式）来确定化学特性，并将其与免费提供的在线数据库进行比较，这些数据库包含消耗多酚富集后在生物流体中鉴定的多酚代谢物12.UPLC-MS/MS研究中使用的用于鉴定酚类化合物及其代谢物的最重要数据库是人类代谢组数据库（HMDB），脂质细胞文库，METLIN文库和其他补充数据库，如PubChem，ChemSpider和Phenol Explorer17。

在本研究中，开发了一种半靶向UPLC-MS / MS方法来分析参与含RSF松饼和饮料消费研究的老年人组的血浆样本7。收集来自不同免费在线血浆代谢物数据库的数据并将其整合到一个专门的数据库中。该数据库可通过设备软件自动访问，以识别30天营养干预前后的五种血浆样品中的多酚代谢物。这样做是为了鉴定从专门配制的用于预防肌肉减少症的功能性食品中吸收的主要酚类化合物或其代谢物。

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研究方案

该协议中使用的血浆样品是在遵循所有伦理准则的先前研究中收集的，并得到了华雷斯自治大学的机构伦理和生物伦理委员会（CIEB-2018-1-37）的批准。通过UPLC-MS / MS提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的完整方案如图 1所示。

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图1:通过半靶向UPLC-MS / MS方法提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 样品制备

  1. 将血浆样品储存在-80°C直至分析。
  2. 在室温下解冻血浆样品15分钟。
    注意:样品可以放置在37°C的水浴中以加速该过程（5分钟）。
  3. 将200μL血浆样品置于2mL微管中，并与1，000μL纯乙醇混合。涡旋等离子体样品30秒。
    注意:处理血浆样品时，请始终使用手套。
  4. 将样品以6，580× g 离心5分钟。离心后，用微量移液管或巴斯德移液器收集上清液，并将其置于新的微管中。将上清液储存在4°C。
  5. 将上一步中的沉淀与1，000μL100%乙醇混合，涡旋30秒，然后以6，580× g 离心5分钟。
    注意:沉淀是强力包装的，需要重悬良好，以确保样品与纯乙醇之间的接触。建议使用微量移液器用乙醇冲洗沉淀。
  6. 离心后，收集上清液并与先前从步骤1.4获得的上清液混合。在2 mL微管中。
  7. 使用纯氮（99.997%）在135 psi下从样品中除去乙醇。保持针头远离微管顶部1厘米，以防止样品丢失并冲洗直至样品干燥。无需加热即可蒸发乙醇。
    注意:氮气流量必须很低，以防止样品损失。一旦乙醇干燥，保持氮气流量至少5分钟，以确保样品干燥。此时可以暂停协议;样品必须储存在-20°C。 避免将样品储存超过12小时。
  8. 将干样品重悬于100μL乙腈混合物中:水的比例为50:50（v:v）。
  9. 通过0.45μm尼龙注射器膜将样品直接过滤到HPLC小瓶微插入物中。
    注意:样品瓶中的样品可以在分析前储存在-20°C。将样品储存不超过8小时。建议在过滤后立即将样品注入UPLC系统。

2. UPLC-MS/MS 分析

  1. 将3μL样品注入装有C18 反相柱（50 mm x 2.1 mm; 1.8μm）的UPLC中。将自动进样器温度设置为20°C，柱式恒温器设置为25°C。 将每个样品一式三份注入。
  2. 在水中使用0.1%（v:v）甲酸作为溶剂A，100%乙腈作为溶剂B.将流速设置为0.4 mL / min，梯度程序如下:0-1分钟10%B，1-4分钟30%B，4-6分钟38%B，6-8分钟60%B，8-8.5分钟60%B，8.5-9分钟10%B（表1）。
  3. 将质谱仪设置为负模式电离。在340°C和13 L / min的流速下使用氮气作为干燥气体。将雾化器压力设置为 60 psi。将毛细管电压设置为 4，000 V，将碎片器电压设置为 175 V，将撇油器电压设置为 65 V。在 20 V 时使用碰撞能量（表 2）。
  4. 扫描质量在100-1100质量电荷比（m/z）之间，对于MS/MS，扫描质量在50-1000 m/z 之间（表2）。将数据采集设置为自动 MS/MS 模式。使用以下参考质量:119.036 和 966.0007。
时间（分钟）溶剂A（高效液相色谱水中0.1%甲酸）溶剂B（100%乙腈）
0 比 19010
1 至 47030
4 至 66238
6 至 84060
8 到 8.54060
8，5 到 99010

表1:用于通过UPLC分离酚类化合物的流动相梯度。

电离模式阴性
干燥气体氮气在340°C，流量13升/分钟
雾化器压力60 磅/平方英寸
毛细管电压175 V
MS 扫描质量100-1100 米/z
MS/MS 扫描质量50-1000 米/z

表2:MS/MS分析的电离参数。

3. 数据库建设

  1. 在科学文献中搜索酚类化合物、酚类代谢物或其他感兴趣的化合物。
  2. 打开UPLC系统中包含的数据库管理软件。选择 文件|新的个人数据库复合库 （PCDL） |创建新的 PCDL。选择PCDL的类型: LC / MS代谢组学。设置 PCDL 的名称。然后选择" 创建"。
  3. 在工具栏中，选择" PCDL "，然后选择 "允许编辑 "选项。然后单击" 查找化合物 "按钮。
    注意:由于它是新的 PCDL，因此表结果将为空。一旦新的化合物被添加到PCDL中，这种情况就会改变。
    1. 通过从仪器的通用库中复制化合物，将化合物添加到专门的个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。单击" 查找化合物"按钮。在 "单次搜索 "选项中，输入化合物搜索条件以查找感兴趣的化合物。
      注意:化合物可以通过名称，分子式，确切质量和保留时间找到。
    2. 在化合物结果表中，选择感兴趣的化合物。若要选择多个化合物，请单击第一个化合物，按住 Ctrl 键，然后单击每个感兴趣的化合物。然后，右键单击所有突出显示的化合物，然后选择" 追加到 PCDL"。
    3. 在新窗口中，搜索并选择专用的个人数据库文件。标记" 包括化合物的光谱（如果存在 ）"和 "包括化合物的离子淌度信息（如果存在）"框。单击 追加 按钮。在新对话框中，选择" 是 "以检查添加的新化合物。选择" 否 "以继续搜索更多感兴趣的化合物。
  4. 如果仪器的通用库中没有感兴趣的化合物，请手动添加新化合物。
    1. 打开专用个人数据库。打开后，请按照步骤 3.3 操作。选择 "编辑化合物 "选项。单击 添加新 按钮。
    2. 在窗口的上半部分，填写新化合物的信息。填写公式，名称，IUPAC名称，CAS编号，化学蜘蛛ID和其他标识符。
    3. 使用免费在线库（Chemspider，PubChem和Phenol Explorer）中提供的信息来填写新感兴趣化合物的信息。完成后，单击" 另存为新 "按钮，将新的化合物信息保存在专门的个人数据库中。
      注意:添加来自自由库的信息时，请确保包含不存在氯化物或碘离子的化合物信息。这可能会改变目标化合物的确切质量和分子式。
  5. 对所有感兴趣的化合物重复该过程，以完成专门的个人数据库。

4. 数据分析

  1. 使用仪器的定性管理器软件来鉴定样品中存在的酚类化合物和酚类代谢物。
  2. 打开示例文件。在"色谱图"面板中，选择"定义色谱 图 "并提取总离子色谱图 （TIC）、提取的 MS 离子色谱图 （EIC） 和 MS/MS 的 EIC。选择"集成色谱图"选项。
  3. 在 "查找化合物"面板中 ，选择" 按公式查找-选项"。在新窗口中，选择" 公式源 "，然后选择" 数据库/库" 选项。找到以前创建的个人数据库，然后单击" 打开"。
  4. 选择 "公式匹配 "选项，并将质量匹配公差设置为百万分之 5 （ppm）。
    注意:不同的质量匹配公差可以设置为10 ppm;这种差异取决于所使用的质谱仪。
  5. 选择" 负离子 "选项，然后仅选择" -H "对话框。在 "结果 "选项中，标记 "提取 EIC"、"提取清理的频谱"、"提取原始频谱"以及" 包括结构 "对话框。
  6. 选择" 结果筛选器" 选项。 如果分数为， 则标记警告，并将分数匹配设置为 80.00%。 如果分数为， 则标记为不匹配，并将分数设置为 75.00%。
    注意:如果需要，匹配/不匹配的分数可以更改为较低的值。这将降低识别的准确性。
  7. 单击" 按配方查找化合物" 以识别样品中感兴趣的化合物。

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结果

图2描述了通过半靶向UPLC-MS / MS分析在阴性模式下鉴定酚类代谢物的分步过程。首先，通过仪器的定性软件获得来自血浆酚醛提取物的总离子色谱图（TIC）（在总血浆样品的蛋白质沉淀后获得）。然后，使用提取的离子色谱图，并将每个信号（或分子特征）的确切质量和碎片模式（MS / MS分析）与仪器软件中创建的特定个人数据库的质量和片段模式进行比较。?...

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讨论

在食用食品或食品补充剂后被吸收的生物活性植物化学物质的鉴定和定量对于证明和理解这些化合物和含有它们的食物的健康益处至关重要。在目前的工作中，开发了UPLC-MS / MS方法，仅针对鉴定主要酚类化合物及其代谢物，这些化合物在使用两种专门为老年人配制的食品进行30天的营养干预后血浆中浓度增加。据推测，如果一种化合物仅在干预期后增加或出现在血浆中，则该化合物已被吸收和/或?...

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披露声明

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

作者感谢墨西哥CONACYT（CB-2016-01-286449）和UACJ-PIVA（项目313-17-16和335-18-13）的财政支持。OAMB希望感谢CONACYT的博士奖学金。非常感谢UACJ多媒体制作办公室的技术支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileTediaAl1129-001LC Mass spectrometry
AutosamplerAgilent TechnologiesG4226A1290 Infinity series
C18 reverse phase columnAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
CentrifugeEppendorf5452000018Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostatAgilent TechnologiesG1316C1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)Agilent TechnologiesG4212B1260 Infinity series
Electrospray ionnization sourceAgilent TechnologiesG3251BDual sprayer ESI source
Formic acidJ.T. Baker0128-02Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data AcquisitionAgilent TechnologiesG3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library ManagerAgilent TechnologiesG3338AA
Mass Hunter Qualitative AnalysisAgilent TechnologiesG3338AA
Microcentrifuge tubeBrandBR780546Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanolSigma-AldrichE7023-1L200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MSAgilent TechnologiesG6530B6530 Accurate Mass
Quaternary pumpAgilent TechnologiesG4204A1290 Infinity series
Syringe filterThermo Scientific44514-NN17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
ThermostatAgilent TechnologiesG1330B1290 Infinity series
VialAgilent Technologies8010-0199Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insertAgilent Technologies5183-2089Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
WaterTediaWL2212-001LC Mass spectrometry

参考文献

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