Yaşlı Yetişkinlerin Plazmasındaki Fenolik Metabolitlerin Kütle Spektrometri Analizine Bağlanan Yarı Hedefli Ultra Yüksek Performanslı Kromatografi

Özet

Bu protokolün amacı, yarı hedefli kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemi kullanarak plazmadaki fenolik metabolitleri tespit etmektir.

Özet

23 yaşlı kişiden oluşan bir gruba, sarkopeninin (yaşa bağlı kas kütlesi kaybı) önlenmesi için özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel yemekler (bir içecek ve bir kek) verildi. Plazma örnekleri, müdahalenin başlangıcında ve fonksiyonel öğünlerin tüketilmesinden 30 gün sonra alındı. Fenolik bileşikleri ve metabolitlerini tanımlamak için tandem kütle (UPLC-MS / MS) analizi ile birleştirilmiş yarı hedefli ultra yüksek performanslı kromatografi gerçekleştirildi. Plazma proteinleri etanol ile çökeltildi ve numuneler UPLC-MS / MS cihazına enjeksiyondan önce mobil fazda (1: 1 asetonitril: su) konsantre edildi ve yeniden askıya alındı. Ayırma bir _C18 ters faz sütunu ile gerçekleştirildi ve bileşikler deneysel kütleleri, izotopik dağılımları ve fragman desenleri kullanılarak tanımlandı. İlgilenilen bileşikler, veri bankalarının ve dahili yarı hedefli kütüphaneninkilerle karşılaştırıldı. Ön sonuçlar, müdahaleden sonra tanımlanan başlıca metabolitlerin fenilasetik asit, glisitin, 3-hidroksifenilvalerik asit ve gomisin M2 olduğunu göstermiştir.

Giriş

Sarkopeni yaşlı popülasyonda hızlandırılmış kas kaybına bağlı ilerleyici bir iskelet hastalığıdır. Bu durum düşme riskini arttırır ve günlük yaşam aktivitelerinin sınırlı olmasına neden olur. Sarkopeni, 65 yaşın üzerindeki kişilerin yaklaşık% 5-10'unda ve 80 yaş ve üstü kişilerin yaklaşık% 50'sinde ^bulunur1. Sarkopeni tedavisi için spesifik bir ilaç onaylanmamıştır, bu nedenle fiziksel aktivite ve dengeli bir diyetle korunma ^{önemlidir1,2}. Süt proteini ve esansiyel amino asitlerle zenginleştirilmiş özel olarak formüle edilmiş gıdalarla yapılan beslenme müdahaleleri, sarkopeninin önlenmesinde olumlu sonuçlar ^{göstermiştir2}. Diğer çalışmalarda, yazarlar diyete E vitamini ve izoflavonlar gibi vitamin ve antioksidanları dahil ederek, bel ve kalçalardaki kas kazanımının faydalarını ^{arttırmıştır3}.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón), Meksika tropikal bölgelerinde yetişen bir ağaçtır; yüksek besin değeri nedeniyle Maya kültürleri tarafından ^{tüketilmiştir4}. İyi bir protein, lif, mineral ve klorojenik asit gibi fenolik antioksidanlar ^{kaynağıdır5}. Toz haline getirilebildiği ve pişirme ürünlerinde kullanılabildiği veya içeceklerde tüketilebildiği için, son çalışmalar Ramón tohumu ununun (RSF) besin değerlerini artırmak için farklı gıdalara dahil edilmesini değerlendirmiştir. RSF takviyeli kapuçino aromalı bir içecek formüle edildi, diyet lifi bakımından yüksekti ve porsiyon başına 6 g'dan fazla protein içeriyordu ve tüketiciler tarafından oldukça kabul edildi; bu nedenle, özel diyet gereksinimlerini karşılamak için potansiyel bir alternatif olarak kabul ^edildi6. Bir takip çalışmasında, RSF ayrıca bir kek ve protein, diyet lifi, mikro besinler ve fenolik antioksidanlar bakımından zengin yeni bir içecek formüle etmek için kullanıldı. Muffin ve içecek, her iki ürünü de 30 gün boyunca günde iki kez tüketen yaşlı bireyler için bir diyet müdahalesinde kullanıldı. Bu süreden sonra, katılımcıların beslenme ve sarkopenik durumları iyileşti ve plazmanın toplam fenolik içeriği ^arttı7. Bununla birlikte, plazmadaki toplam fenolik bileşiklerin belirlenmesi spektrofotometrik bir yöntemle gerçekleştirilmiştir, bu nedenle emilen gerçek fenolik bileşiklerin tanımlanması mümkün olmamıştır; Dahası, bu yöntem fenolik bileşikler için tamamen spesifik değildir, bu nedenle bazı abartılı tahminler meydana ^gelebilir8.

Bu antioksidanlar bakımından zengin gıdaların tüketiminden sonra emilen fenolik bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi zor bir iştir, ancak bu fitokimyasalların biyolojik aktivitesini göstermek için gereklidir. Çoğu fenolik bileşiğin biyoyararlanımı düşüktür; Bunların %5'inden azı plazmada yapısal dönüşüm olmadan bulunabilir. Fenolik bileşikler, enterositler ve hepatositler tarafından gerçekleştirilen metilasyon, sülfonasyon veya glukuronidasyon gibi çeşitli biyotransformasyonlara ^uğrar9. Fenolik bileşikler ayrıca mikrobiyota tarafından plazmaya emildikten sonra vücutta yararlı etkilerini gösterebilecek bakteriyel katabolitlere biyotransforme ^edilir10. Örneğin, fenilasetik asit, flavonoidlerin ve oligomerik proantosiyanidinlerin bakteriyel dönüşümünün bir ürünüdür ve kızılcık tüketiminden sonra idrar yollarındaki bakterilerin (Escherichia coli) yapışmasının% 40'ına kadarını inhibe ^edebilir11.

Doğal olarak oluşan fenolik bileşiklerin yapısal çeşitliliği, metabolitlerinin çeşitliliğine ve düşük biyoyararlanımlarına eklendiğinde, plazmadaki tanımlamalarını daha da zorlaştırmaktadır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve tandem kütle spektroskopisi (MS / MS) gibi spektroskopik analiz platformlarını kullanan metabolomik profilleme, muhtemelen bu hedefe ulaşmak için en iyi yaklaşımdır; ne yazık ki, ekipmana kolayca erişilemez ve analiz protokollerinin geliştirilmesi hala ^{sınırlıdır12}. Birçok çalışma, metabolomik çalışmalarda kütle spektrumlarının karmaşıklığını azaltmak için bir strateji olarak MS / MS'in bir ayırma sistemi (sıvı kromatografisi gibi) ile birleştiğini bildirmiştir. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ayırma yöntemlerinin yakın zamanda piyasaya sürülmesi, analiz süresini kısaltmış ve geleneksel yüksek performanslı sıvı protokollerine kıyasla çözünürlüğü ve hassasiyeti artırmıştır, bu nedenle UPLC-MS / MS sistemleri analitik metabolomik topluluğu tarafından hızla kabul ^{görmüştür13}. Bu şekilde, bazı çalışmalar fenolik metabolitleri araştırmış ve kızılcık alımından sonra bireylerin plazmasında kafeinik asit, quercetin ve ferulik asitten glukuronid türevlerinin yanı sıra şırıngaik ve vanilik asitten sülfonlu türevleri tespit ^etmiştir14. Önceki protokoller, plazma gibi biyoakışkanlarda fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri bulmayı amaçlamıştır. Bu protokoller, bir UV-vis dedektörüne bağlanmış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tanımlama ve nicelleştirmeye ^{dayanıyordu15}. Bununla birlikte, bu tür protokoller, mutlak tanımlamayı ve doğru nicelemeyi değerlendirmek için otantik standartların kullanılmasını gerektirir. Çok çeşitli çalışmalar, biyoakışkanlarda (sülfonlanmış, glukuronidlenmiş ve metillenmiş formlar) UPLC-MS ve UPLC-MS / MS tarafından en yaygın metabolitleri tanımlamıştır; Bununla birlikte, bakteriyel metabolitlerin büyük bir kısmı, tam bilgilerini içeren veritabanlarının bulunmaması nedeniyle ^{bildirilmemiştir16}. Metabolit tanımlama, metabolit standartlarının maliyeti ve ticari kullanılabilirliği nedeniyle karmaşıktır. Bu nedenle, en iyi strateji, kimyasal kimliği belirlemek için moleküler özellik bilgilerinin (m / z, monoizotopik tam kütle, izotopik dağılım ve parçalanma paterni) kullanılmasına dayanan ve polipolifenol-richts tüketiminden sonra biyoakışkanlarda tanımlanan polifenol metabolitlerini içeren serbestçe kullanılabilen çevrimiçi veritabanlarıyla karşılaştıran hedefsiz veya yarı hedefli MS / MS metabolit analizi ^olabilir12 . Fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanması için UPLC-MS / MS çalışmalarında kullanılan en önemli veritabanları İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB), LipidBlast Kütüphanesi, METLIN Kütüphanesi ve PubChem, ChemSpider ve Phenol ^Explorer17 gibi diğer tamamlayıcı veritabanlarıdır.

Bu çalışmada, RSF içeren çörek ve içecek tüketimi çalışmasına katılan yaşlı insan grubunun plazma örneklerini analiz etmek için yarı hedefli bir UPLC-MS/MS yöntemi ^{geliştirilmiştir7}. Plazma metabolitlerinin farklı ücretsiz çevrimiçi veritabanlarından elde edilen veriler toplandı ve özel bir veritabanına entegre edildi. Bu veritabanına, 30 günlük beslenme müdahalesinden önce ve sonra beş plazma örneğindeki polifenolik metabolitleri tanımlamak için ekipman yazılımı tarafından otomatik olarak erişilebilir. Bu, sarkopeninin önlenmesi için tasarlanmış özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel gıdalardan emilen ana fenolik bileşikleri veya metabolitlerini tanımlamak için yapılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokolde kullanılan plazma örnekleri, tüm etik kuralları takip eden ve Universidad Autónoma de Ciudad Juárez'den Kurumsal Etik ve Biyoetik Komitesi (CIEB-2018-1-37) tarafından onaylanan önceki bir çalışmada toplanmıştır. Plazmadaki fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin UPLC-MS / MS ile ekstraksiyonu ve tanımlanması için tam protokol Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Plazmadaki fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin yarı hedefli UPLC-MS/MS yöntemi ile ekstraksiyonu ve tanımlanmasının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Numune hazırlama

1. Plazma numunelerini analize kadar -80 °C'de saklayın.
2. Plazma numunelerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözün.
   NOT: Numuneler, prosesi hızlandırmak için 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirilebilir (5 dk).
3. 200 μL plazma örneğini 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin ve 1.000 μL saf etanol ile karıştırın. 30 sn için plazma örneğini vorteksleyin.
   NOT: Plazma numuneleriyle çalışırken daima eldiven kullanın.
4. Numuneyi 5 dakika boyunca 6.580 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir mikropipet veya Pasteur pipet ile toplayın ve yeni bir mikrotüpe yerleştirin. Süpernatantı 4 °C'de saklayın.
5. Önceki adımdaki peleti 1.000 μL %100 etanol, 30 s vorteks ile karıştırın ve ardından 5 dakika boyunca 6.580 x g'de santrifüj yapın.
   NOT: Pelet güçlü bir şekilde paketlenmiştir ve numune ile saf etanol arasındaki teması sağlamak için iyice askıya alınması gerekir. Peletin etanol ile yıkanması için mikropipet kullanılması önerilir.
6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı toplayın ve daha önce Adım 1.4'ten elde edilen süpernatant ile karıştırın. 2 mL'lik bir mikrotüp içinde.
7. 135 psi'de saf azot (% 99.997) kullanarak etanol'ü numuneden çıkarın. Numune kaybını önlemek için iğneyi mikrotüpün üstünden 1 cm uzakta tutun ve numune kuruyana kadar yıkayın. Etanolün buharlaştırılması için ısıya gerek yoktur.
   NOT: Numune kaybını önlemek için azot akışı düşük olmalıdır. Etanol kuruduktan sonra, numune kuruluğunu sağlamak için azot akışını en az 5 dakika tutun. Protokol bu noktada duraklatılabilir; numuneler -20 °C'de saklanmalıdır. Numuneleri 12 saatten fazla saklamaktan kaçının.
8. Kuru numuneleri 100 μL'lik bir asetonitril karışımında yeniden askıya alın: 50:50 (v:v) oranında su.
9. Numuneyi 0,45 μm naylon şırınga membranından doğrudan bir HPLC şişe mikro ekine filtreleyin.
   NOT: Flakondaki numuneler analizden önce -20 °C'de saklanabilir. Numuneleri en fazla 8 saat saklayın. Numunelerin filtrasyondan hemen sonra UPLC sistemine enjekte edilmesi önerilir.

2. UPLC-MS/MS analizi

1. C18 ters faz sütunu (50 mm x 2,1 mm; _1,8 μm) ile donatılmış bir UPLC'ye 3 μL numune enjekte edin. Otomatik numune alma cihazı sıcaklığını 20 °C'ye ve kolon termostatını 25 °C'ye ayarlayın. Her numuneyi üçlü olarak enjekte edin.
2. Suda çözücü A olarak% 0.1 (v: v) formik asit ve çözücü B olarak% 100 asetonitril kullanın Akış hızını 0.4 mL / dak ve gradyan programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0-1 dakika % 10 B, 1-4 dakika % 30 B, 4-6 dakika% 38 B, 6-8 dakika % 60 B, 8-8.5 dakika% 60 B, 8.5-9 dakika % 10 B (Tablo 1).
3. Kütle spektrometresini negatif mod iyonizasyonuna ayarlayın. 340 °C'de kurutma gazı olarak azot ve 13 L/dak debi kullanın. Nebülizör basıncını 60 psi'ye ayarlayın. Kılcal gerilimi 4.000 V'a, parçalayıcı voltajını 175 V'a ve Sıyırıcı voltajını 65 V'a ayarlayın. çarpışma enerjisini 20 V'ta kullanın (Tablo 2).
4. 100-1100 kütle-yük oranı (m/z) arasındaki kütleleri tarayın ve MS/MS için 50-1000 m/z arasındaki kütleleri tarayın (Tablo 2). Veri alımını Otomatik MS/MS moduna ayarlayın. Aşağıdaki referans kütlesini kullanın: 119.036 ve 966.0007.

Süre (dk)	Solvent A (HPLC suyunda %0,1 formik asit)	Solvent B (%100 asetonitril)
0 ila 1	90	10
1 ila 4	70	30
4 ila 6	62	38
6 ila 8	40	60
8 ila 8,5	40	60
8,5 ila 9	90	10

Tablo 1: Fenolik bileşiklerin UPLC ile ayrılması için kullanılan mobil faz gradyanı.

İyonizasyon modu	Negatif
Kurutma gazı	340 °C'de azot, akış hızı 13 L/dak
Nebülizör basıncı	60 psi
Kılcal gerilim	175 V
MS tarama kütleleri	100-1100 m/z
MS/MS tarama kütleleri	50-1000 m/z

Tablo 2: MS/MS analizi için iyonizasyon parametreleri.

3. Veritabanı oluşturma

1. Fenolik bileşikleri, fenolik metabolitleri veya bilimsel literatürde ilgi çeken diğer bileşikleri arayın.
2. UPLC sisteminde bulunan veritabanı yönetim yazılımını açın. Dosya |'nı seçin Yeni Kişisel Veritabanı Bileşik Kitaplığı (PCDL) | Yeni PCDL oluşturun. PCDL türünü seçin: LC/MS Metabolomics. PCDL için bir ad ayarlayın. Ardından Oluştur'u seçin.
3. Araç çubuğunda PCDL'yi ve ardından Düzenlemeye izin ver seçeneğini belirleyin. Ardından Bileşikleri bul düğmesini tıklayın.
   NOT: Yeni bir PCDL olduğundan, tablo sonuçları boş olacaktır. PCDL'ye yeni bileşikler eklendiğinde bu durum değişecektir.
   1. Bileşikleri, cihazın genel kütüphanesinden kopyalayarak özel kişisel veritabanı bileşik kütüphanesine ekleyin. Cihazın veritabanı yönetim yazılımında bulunan mevcut veritabanını açın. Bileşikleri bul düğmesini tıklayın. Tek arama seçeneğinde, ilgilenilen bileşiği bulmak için bileşik arama ölçütlerini girin.
      NOT: Bileşikler isim, moleküler formül, tam kütle ve tutma süresi ile bulunabilir.
   2. Bileşik sonuçlar tablosunda, faiz bileşiğini seçin. Birden fazla bileşik seçmek için, ilk bileşiği tıklatın, CTRL tuşunu basılı tutun ve ardından ilgilenilen her bileşiği tıklatın. Ardından, vurgulanan tüm bileşiklere sağ tıklayın ve PCDL'ye Ekle'yi seçin.
   3. Yeni pencerede, özelleştirilmiş kişisel veritabanı dosyasını arayın ve seçin. Kutuları işaretleyin Varsa bileşikler için spektrumları dahil edin ve varsa bileşikler için iyon hareketlilik bilgilerini ekleyin. Ekle düğmesini tıklatın. Yeni iletişim kutusunda, eklenen yeni bileşikleri kontrol etmek için Evet'i seçin. İlgilendiğiniz daha fazla bileşik aramaya devam etmek için Hayır'ı seçin.
4. İlgilenilen bileşikler cihazın genel kütüphanesinde mevcut değilse, yeni bileşikleri manuel olarak ekleyin.
   1. Özel kişisel veritabanını açın. Açıldıktan sonra, Adım 3.3'ü izleyin. Bileşikleri düzenle seçeneğini belirleyin. Yeni ekle düğmesini tıklayın.
   2. Pencerenin üst kısmında, yeni bileşik için bilgileri doldurun. Formülü, adı, IUPAC adını, CAS numarasını, Chemspider ID'yi ve diğer tanımlayıcıları doldurun.
   3. Yeni ilgi alanı bileşiğinin bilgilerini doldurmak için ücretsiz çevrimiçi kütüphanelerde (Chemspider, PubChem ve Phenol Explorer) bulunan bilgileri kullanın. İşiniz bittiğinde, yeni bileşik bilgileri özel kişisel veritabanına kaydetmek için Yeni olarak kaydet düğmesine tıklayın.
      NOT: Serbest kütüphanelerden bilgi eklerken, klorür veya iyodür iyonları olmadan bileşik bilgileri eklediğinizden emin olun. Bu, ilgilenilen bileşiğin tam kütlesini ve moleküler formülünü değiştirebilir.
5. Özel kişisel veritabanını tamamlamak için işlemi ilgilendiğiniz tüm bileşiklerle tekrarlayın.

4. Veri analizi

1. Numunelerde bulunan fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri tanımlamak için cihazın kalitatif yönetici yazılımını kullanın.
2. Örnek dosyayı açın. Kromatogram panelinde, Kromatogramları Tanımla'yı seçin ve toplam iyon kromatogramını (TIC), çıkarılan MS iyon kromatogramını (EIC) ve MS/MS'nin EIC'sini ayıklayın.
3. Bileşikleri Bul panelinde, Formüle Göre Bul-Seçenekler'i seçin. Yeni pencerede, Formül Kaynağı'nı ve ardından Veritabanı/Kitaplık seçeneğini belirleyin. Daha önce oluşturulmuş kişisel veritabanını bulun ve Aç'a tıklayın.
4. Formül Eşleştirme seçeneğini belirleyin ve milyonda 5 parçalık (ppm) bir kütle eşleşme toleransı ayarlayın.
   NOT: Kütlelerin farklı bir eşleşme toleransı 10 ppm'ye ayarlanabilir; bu fark kullanılan kütle spektrometresine bağlıdır.
5. Negatif İyonlar seçeneğini belirleyin ve yalnızca -H iletişim kutusunu seçin. Sonuçlar seçeneğinde, Extract EIC, Extract Clean Spectrum, Extract Raw Spectrum ve include Structure iletişim kutularını işaretleyin.
6. Sonuç Filtreleri seçeneğini belirleyin. Mark Skor ise uyar ve skor eşleşmesini %80,00 olarak ayarla. İşaret Skoru eşleşmiyorsa eşleşmiyor ve skoru %75,00 olarak ayarlayın.
   NOT: Eşleşme/eşleşmeme skorları gerekirse daha düşük değerlerle değiştirilebilir. Bu, tanımlamanın doğruluğunu azaltacaktır.
7. Numunede ilgilenilen bileşikleri tanımlamak için Formüle Göre Bileşikleri Bul'a tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Plazma örneklerinin negatif modda yarı hedefli UPLC-MS/MS analizi yoluyla fenolik metabolitlerin tanımlanması için adım adım süreç Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, plazma fenolik ekstraktından elde edilen toplam iyon kromatogramı (TIC) (toplam plazma örneğinin protein çökelmesinden sonra elde edilen), cihazın kalitatif yazılımı aracılığıyla elde edildi. Daha sonra, ekstrakte edilen iyon kromatogramı kullanıldı ve her sinyalin (veya mo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bir gıda veya gıda takviyesinin tüketiminden sonra emilen biyoaktif fitokimyasalların tanımlanması ve miktarının belirlenmesi, bu bileşiklerin ve bunları içeren gıdaların sağlık yararlarını göstermek ve anlamak için çok önemlidir. Bu çalışmada, sadece yaşlılar için özel olarak formüle edilmiş iki gıda ürünü ile 30 günlük bir beslenme müdahalesinden sonra plazmada konsantrasyonu artan ana fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanmasına yönelik UPLC-MS / MS yöntemi gelişti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tedia	Al1129-001	LC Mass spectrometry
Autosampler	Agilent Technologies	G4226A	1290 Infinity series
C18 reverse phase column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
Centrifuge	Eppendorf	5452000018	Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostat	Agilent Technologies	G1316C	1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)	Agilent Technologies	G4212B	1260 Infinity series
Electrospray ionnization source	Agilent Technologies	G3251B	Dual sprayer ESI source
Formic acid	J.T. Baker	0128-02	Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data Acquisition	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Qualitative Analysis	Agilent Technologies	G3338AA
Microcentrifuge tube	Brand	BR780546	Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-1L	200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MS	Agilent Technologies	G6530B	6530 Accurate Mass
Quaternary pump	Agilent Technologies	G4204A	1290 Infinity series
Syringe filter	Thermo Scientific	44514-NN	17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
Thermostat	Agilent Technologies	G1330B	1290 Infinity series
Vial	Agilent Technologies	8010-0199	Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insert	Agilent Technologies	5183-2089	Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
Water	Tedia	WL2212-001	LC Mass spectrometry