Cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni accoppiata all'analisi spettrometrica di massa di metaboliti fenolici nel plasma di anziani

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare metaboliti fenolici nel plasma utilizzando un metodo di cromatografia-spettrometria di massa semi-mirato.

Abstract

A un gruppo di 23 persone anziane sono stati somministrati pasti funzionali (una bevanda e un muffin) appositamente formulati per la prevenzione della sarcopenia (perdita di massa muscolare legata all'età). I campioni di plasma sono stati prelevati all'inizio dell'intervento e dopo 30 giorni di consumo dei pasti funzionali. È stata effettuata una cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni abbinata all'analisi di massa tandem (UPLC-MS/MS) per identificare i composti fenolici e i loro metaboliti. Le proteine plasmatiche sono state precipitate con etanolo e i campioni sono stati concentrati e risospesi nella fase mobile (acetonitrile 1:1: acqua) prima dell'iniezione nello strumento UPLC-MS/MS. La separazione è stata effettuata con una colonna di fase inversa _C18 e i composti sono stati identificati utilizzando la loro massa sperimentale, la distribuzione isotopica e il modello di frammento. I composti di interesse sono stati confrontati con quelli delle banche dati e della libreria semi-mirata interna. I risultati preliminari hanno mostrato che i principali metaboliti identificati dopo l'intervento erano acido fenilacetico, glicina, acido 3-idrossifenilvalerico e gomisina M2.

Introduzione

La sarcopenia è un disturbo scheletrico progressivo correlato ad una perdita accelerata di muscoli nella popolazione anziana. Questa condizione aumenta il rischio di cadute e porta a attività limitate della vita quotidiana. La sarcopenia è presente in circa il 5%-10% delle persone di età superiore ai 65 anni e in circa il 50% delle persone di età pari o superiore a 80 ^anni1. Non sono stati approvati farmaci specifici per il trattamento della sarcopenia, quindi la prevenzione con l'attività fisica e una dieta equilibrata è ^{importante1,2}. Gli interventi nutrizionali con alimenti appositamente formulati arricchiti con proteine del latte e aminoacidi essenziali hanno mostrato risultati positivi nella prevenzione della sarcopenia2. In altri studi, gli autori hanno incluso vitamine e antiossidanti, come la vitamina E e gli isoflavoni, nella dieta, aumentando i benefici per il guadagno muscolare sulla vita e sui ^fianchi3.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) è un albero che cresce nelle regioni tropicali messicane; è stato consumato dalle culture Maya grazie al suo alto valore ^{nutrizionale4}. È una buona fonte di proteine, fibre, minerali e antiossidanti fenolici, come l'acido ^clorogenico5. Poiché può essere macinato in polvere e utilizzato nei prodotti da forno o consumato nelle bevande, studi recenti hanno valutato l'incorporazione della farina di semi di Ramón (RSF) in diversi alimenti per migliorare il loro valore nutrizionale. È stata formulata una bevanda al gusto di cappuccino integrata con RSF, che era ricca di fibre alimentari e aveva più di 6 g di proteine per porzione, ed era altamente accettata dai consumatori; pertanto, è stata considerata una potenziale alternativa per soddisfare esigenze dietetiche ^speciali6. In uno studio di follow-up, RSF è stato utilizzato anche per formulare un muffin e una nuova bevanda ricca di proteine, fibre alimentari, micronutrienti e antiossidanti fenolici. Il muffin e la bevanda sono stati utilizzati in un intervento dietetico per le persone anziane, che hanno consumato entrambi i prodotti due volte al giorno per 30 giorni. Dopo questo periodo, lo stato nutrizionale e sarcopenico dei partecipanti è migliorato e il contenuto fenolico totale del plasma è ^aumentato7. Tuttavia, la determinazione dei composti fenolici totali nel plasma è stata effettuata con un metodo spettrofotometrico, quindi l'identificazione dei composti fenolici effettivi che sono stati assorbiti non è stata possibile; inoltre, questo metodo non è completamente specifico per i composti fenolici, quindi può verificarsi una sovrastima8.

L'identificazione e la quantificazione dei composti fenolici che vengono assorbiti dopo il consumo di alimenti ricchi di questi antiossidanti è un compito difficile ma è necessario per dimostrare l'attività biologica di questi fitochimici. La biodisponibilità della maggior parte dei composti fenolici è bassa; meno del 5% di essi può essere trovato senza trasformazione strutturale nel plasma. I composti fenolici subiscono diverse biotrasformazioni, come la metilazione, la solfonazione o la glucuronidazione, che vengono effettuate da enterociti ed epatociti9. I composti fenolici sono anche biotrasformati dal microbiota in cataboliti batterici che possono esercitare i loro effetti benefici nel corpo dopo essere stati assorbiti nel ^plasma10. Ad esempio, l'acido fenilacetico è un prodotto della trasformazione batterica dei flavonoidi e delle proantocianidine oligomeriche, che possono inibire fino al 40% dell'adesione dei batteri (Escherichia coli) nel tratto urinario dopo il consumo di ^mirtilli11.

La diversità strutturale dei composti fenolici presenti in natura, aggiunta alla diversità dei loro metaboliti e alla loro bassa biodisponibilità, rende la loro identificazione nel plasma ancora più difficile. La profilazione metabolomica, utilizzando piattaforme di analisi spettroscopica come la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la spettroscopia di massa tandem (MS/MS), è probabilmente l'approccio migliore per raggiungere questo obiettivo; sfortunatamente, l'apparecchiatura non è facilmente accessibile e lo sviluppo di protocolli di analisi è ancora ^limitato12. Diversi studi hanno riportato MS / MS accoppiato con un sistema di separazione (come la cromatografia liquida) come strategia per ridurre la complessità degli spettri di massa negli studi metabolomici. La recente introduzione di metodi di separazione per cromatografia liquida (UPLC) ad altissime prestazioni ha ridotto il tempo di analisi e aumentato la risoluzione e la sensibilità rispetto ai protocolli liquidi convenzionali ad alte prestazioni, pertanto i sistemi UPLC-MS/MS sono stati rapidamente ampiamente accettati dalla comunità della metabolomica ^analitica13. In questo modo, alcuni studi hanno studiato metaboliti fenolici e rilevato derivati glucuronidati dall'acido caffeico, quercetina e acido ferulico, nonché derivati solfonati dall'acido siringico e vanillico nel plasma di individui dopo l'assunzione di mirtilli ^rossi14. I protocolli precedenti hanno lo scopo di trovare composti fenolici e metaboliti fenolici in biofluidi come il plasma. Questi protocolli si basavano sull'identificazione e la quantificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata a un rivelatore ^UV-vis15. Tuttavia, tali protocolli richiedono l'uso di standard autentici per valutare l'identificazione assoluta e la quantificazione accurata. Una vasta gamma di studi ha identificato i metaboliti più comuni nei biofluidi (forme solfonate, glucuronidate e metilate) mediante UPLC-MS e UPLC-MS/MS; tuttavia, gran parte dei metaboliti batterici non è stata segnalata a causa della mancanza di database che contengano le loro informazioni ^complete16. L'identificazione dei metaboliti è complicata dal costo e dalla disponibilità commerciale degli standard dei metaboliti. Pertanto, la strategia migliore può essere l'analisi dei metaboliti MS/MS non mirata o semi-mirata, che si basa sull'uso di informazioni sulle caratteristiche molecolari (m/z, massa esatta monoisotopica, distribuzione isotopica e modello di frammentazione) per determinare l'identità chimica e confrontarla con database online liberamente disponibili che contengono metaboliti polifenolici identificati nei biofluidi dopo il consumo di polipolifenoli-ricchi12 . I database più importanti utilizzati negli studi UPLC-MS/MS per l'identificazione di composti fenolici e dei loro metaboliti sono il Database del Metaboloma Umano (HMDB), lipidBlast Library, METLIN Library e altri database complementari, come PubChem, ChemSpider e Phenol ^Explorer17.

Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo UPLC-MS/MS semi-mirato per analizzare i campioni di plasma del gruppo di persone anziane coinvolte nello studio sul consumo di muffin e bevande contenenti ^RSF7. I dati provenienti da diversi database online gratuiti di metaboliti plasmatici sono stati raccolti e integrati in un database specializzato. Questo database è accessibile automaticamente dal software dell'apparecchiatura per identificare i metaboliti polifenolici nei cinque campioni di plasma prima e dopo l'intervento nutrizionale di 30 giorni. Questo viene fatto per identificare i principali composti fenolici, o i loro metaboliti, che vengono assorbiti dagli alimenti funzionali appositamente formulati progettati per la prevenzione della sarcopenia.

Protocollo

I campioni di plasma utilizzati in questo protocollo sono stati raccolti in uno studio precedente seguendo tutte le linee guida etiche e approvati dal Comitato istituzionale di etica e bioetica (CIEB-2018-1-37) dell'Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Il protocollo completo per l'estrazione e l'identificazione dei composti fenolici e dei metaboliti nel plasma da parte di UPLC-MS/MS è rappresentato nella Figura 1.

Figura 1: Rappresentazione schematica dell'estrazione e dell'identificazione di composti fenolici e metaboliti nel plasma mediante il metodo semi-mirato UPLC-MS/MS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del campione

1. Conservare i campioni di plasma a -80 °C fino all'analisi.
2. Scongelare i campioni di plasma a temperatura ambiente per 15 min.
   NOTA: I campioni possono essere posti a bagnomaria a 37 °C per accelerare il processo (5 min).
3. Posizionare 200 μL di campione di plasma in un microtubo da 2 mL e mescolare con 1.000 μL di etanolo puro. Vortice il campione di plasma per 30 s.
   NOTA: utilizzare sempre i guanti quando si lavora con campioni di plasma.
4. Centrifugare il campione a 6.580 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante con una micropipetta o una pipetta Pasteur e posizionarlo in un nuovo microtubo. Conservare il surnatante a 4 °C.
5. Mescolare il pellet della fase precedente con 1.000 μL di etanolo al 100%, vortice per 30 s e quindi centrifugare a 6.580 x g per 5 minuti.
   NOTA: Il pellet è fortemente imballato e deve essere risospeso bene per garantire il contatto tra il campione e l'etanolo puro. Si consiglia l'uso di una micropipetta per lavare il pellet con etanolo.
6. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante e mescolare con il surnatante precedentemente ottenuto dal passo 1.4. in un microtubo da 2 ml.
7. Rimuovere l'etanolo dal campione utilizzando azoto puro (99,997%) a 135 psi. Tenere l'ago a 1 cm di distanza dalla parte superiore del microtubo per evitare la perdita del campione e il lavaggio fino a quando il campione non è asciutto. Non è necessario alcun calore per evaporare l'etanolo.
   NOTA: il flusso di azoto deve essere basso per evitare la perdita del campione. Una volta essiccato l'etanolo, mantenere il flusso di azoto per almeno 5 minuti per garantire la secchezza del campione. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto; i campioni devono essere conservati a -20 °C. Evitare di conservare i campioni per più di 12 ore.
8. Sospendere i campioni secchi in 100 μL di una miscela di acetonitrile: acqua in una proporzione di 50:50 (v:v).
9. Filtrare il campione attraverso una membrana di siringa di nylon da 0,45 μm direttamente in un micro inserto per flaconcino HPLC.
   NOTA: i campioni nel flaconcino possono essere conservati a -20 °C prima dell'analisi. Conservare i campioni per non più di 8 ore. Si consiglia di iniettare i campioni nel sistema UPLC subito dopo la filtrazione.

2. Analisi UPLC-MS/MS

1. Iniettare 3 μL di campione su un UPLC dotato di una colonna inversa _C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Impostare la temperatura dell'autocampionatore a 20 °C e il termostato a colonna a 25 °C. Iniettare ogni campione in triplice copia.
2. Utilizzare acido formico allo 0,1% (v:v) in acqua come solvente A e acetonitrile al 100% come solvente B. Impostare la portata a 0,4 ml/min e un programma di gradiente come segue: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabella 1).
3. Impostare lo spettrometro di massa su ionizzazione in modalità negativa. Utilizzare l'azoto come gas di essiccazione a 340 °C e una portata di 13 L/min. Impostare la pressione del nebulizzatore a 60 psi. Impostare la tensione capillare a 4.000 V, la tensione del frammentatore a 175 V e la tensione dello Skimmer a 65 V. Utilizzare l'energia di collisione a 20 V (Tabella 2).
4. Eseguire la scansione delle masse tra 100-1100 rapporto massa/carica (m/z) e, per MS/MS, masse di scansione comprese tra 50-1000 m/z (Tabella 2). Impostare l'acquisizione dati in modalità Auto MS/MS. Utilizzare la seguente massa di riferimento: 119.036 e 966.0007.

Tempo (min)	Solvente A (0,1 % di acido formico in acqua HPLC)	Solvente B (100 % acetonitrile)
0 a 1	90	10
1 a 4	70	30
4 a 6	62	38
6 a 8	40	60
Da 8 a 8,5	40	60
Da 8,5 a 9	90	10

Tabella 1: Gradiente di fase mobile utilizzato per la separazione di composti fenolici mediante UPLC.

Modalità di ionizzazione	Negativo
Gas di essiccazione	Azoto a 340 °C, portata 13 L/min
Pressione del nebulizzatore	60 psi
Tensione capillare	175 V
Masse di scansione MS	100-1100 m/z
Masse di scansione MS/MS	50-1000 m/z

Tabella 2: Parametri di ionizzazione per l'analisi MS/MS.

3. Costruzione di database

1. Ricerca di composti fenolici, metaboliti fenolici o altri composti di interesse nella letteratura scientifica.
2. Aprire il software di gestione del database incluso nel sistema UPLC. Seleziona file | Nuovo | PCDL (Personal Database Compound Library) Crea nuovo PCDL. Selezionare il tipo di PCDL: LC/MS Metabolomics. Impostare un nome per il PCDL. Quindi seleziona Crea.
3. Nella barra degli strumenti, selezionare PCDL e quindi l'opzione Consenti modifica . Quindi fare clic sul pulsante Trova composti .
   NOTA: poiché si tratta di un nuovo PCDL, i risultati della tabella saranno vuoti. Questo cambierà una volta che nuovi composti saranno aggiunti al PCDL.
   1. Aggiungere composti alla libreria di composti di database personali specializzati copiandoli dalla libreria generale dello strumento. Aprire il database esistente dello strumento incluso nel software di gestione del database. Fare clic sul pulsante Trova composti. Nell'opzione Ricerca singola , inserisci i criteri di ricerca composti per trovare il composto di interesse.
      NOTA: i composti possono essere trovati per nome, formula molecolare, massa esatta e tempo di ritenzione.
   2. Nella tabella dei risultati composti, selezionare il composto di interesse. Per selezionare più composti, fare clic sul primo composto, tenere premuto CTRL e quindi fare clic su ogni composto di interesse. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti i composti evidenziati e selezionare Aggiungi a PCDL.
   3. Nella nuova finestra, cercare e selezionare il file di database personale specializzato. Contrassegnare le caselle Includi spettri per composti se presenti e Includi informazioni sulla mobilità ionica per i composti se presenti. Fare clic sul pulsante Aggiungi . Nella finestra di dialogo Nuovo selezionare Sì per controllare i nuovi composti aggiunti. Selezionare No per continuare a cercare altri composti di interesse.
4. Se i composti di interesse non sono disponibili nella libreria generale dello strumento, aggiungere manualmente nuovi composti.
   1. Aprire il database personale specializzato. Una volta aperto, seguire il passaggio 3.3. Selezionate l'opzione Modifica composti (Edit compounds ). Fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo .
   2. Nella sezione superiore della finestra, completare le informazioni per il nuovo composto. Inserisci la formula, il nome, il nome IUPAC, il numero CAS, l'ID Chemspider e altri identificatori.
   3. Utilizza le informazioni disponibili nelle librerie online gratuite (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) per inserire le informazioni per il nuovo composto di interesse. Una volta terminato, fare clic sul pulsante Salva come nuovo per salvare le nuove informazioni sul composto nel database personale specializzato.
      NOTA: quando si aggiungono informazioni da librerie libere, assicurarsi di includere le informazioni sul composto senza la presenza di ioni cloruro o ioduro. Questo può modificare l'esatta massa e la formula molecolare del composto di interesse.
5. Ripeti il processo con tutti i composti di interesse per completare il database personale specializzato.

4. Analisi dei dati

1. Utilizzare il software di gestione qualitativa dello strumento per identificare i composti fenolici e i metaboliti fenolici presenti nei campioni.
2. Aprire il file di esempio. Nel pannello Cromatogramma, selezionate Definisci cromatogrammi ed estratte il cromatogramma ionico totale (TIC), il cromatogramma ionico estratto di MS (EIC) e l'EIC di MS/MS. Selezionate l'opzione integra cromatogramma.
3. Nel pannello Trova composti , selezionate Trova per formula-Opzioni. Nella nuova finestra selezionare Origine formula e quindi l'opzione Database/Libreria . Trova il database personale creato in precedenza e fai clic su Apri.
4. Selezionate l'opzione Corrispondenza formule (Formula Matching ) e impostate una tolleranza di corrispondenza di massa di 5 parti per milione (ppm).
   NOTA: una diversa tolleranza di corrispondenza delle masse può essere impostata a 10 ppm; questa differenza dipende dallo spettrometro di massa utilizzato.
5. Selezionate l'opzione Ioni negativi (Negative Ions ) e selezionate solo la finestra di dialogo -H . Nell'opzione Risultati selezionare le finestre di dialogo EIC E Extract, Extract Cleaned Spectrum, Extract Raw Spectrum e includi Struttura .
6. Selezionare l'opzione Filtri risultati . Contrassegna se il punteggio è e imposta la corrispondenza del punteggio all'80,00%. Contrassegna Non corrispondere se il punteggio è e imposta il punteggio al 75,00%.
   NOTA: i punteggi di corrispondenza/non corrispondenza possono essere modificati in valori più bassi, se necessario. Ciò ridurrà l'accuratezza dell'identificazione.
7. Fare clic su Trova composti per formula per identificare i composti di interesse nel campione.

Risultati

Il processo passo-passo per l'identificazione dei metaboliti fenolici attraverso l'analisi semi-mirata UPLC-MS/MS, in modalità negativa, di campioni di plasma è illustrato nella Figura 2. In primo luogo, il cromatogramma ionico totale (TIC) dall'estratto fenolico plasmatico (ottenuto dopo la precipitazione proteica del campione plasmatico totale) è stato ottenuto attraverso il software qualitativo dello strumento. Successivamente, è stato utilizzato il cromatogramma...

Discussione

L'identificazione e la quantificazione dei fitochimici bioattivi che vengono assorbiti dopo il consumo di un alimento o di un integratore alimentare sono cruciali per dimostrare e comprendere i benefici per la salute di questi composti e degli alimenti che li contengono. Nel presente lavoro è stato sviluppato il metodo UPLC-MS/MS, finalizzato unicamente all'identificazione dei principali composti fenolici e dei loro metaboliti che sono aumentati di concentrazione nel plasma dopo un intervento nutrizionale di 30 giorni c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tedia	Al1129-001	LC Mass spectrometry
Autosampler	Agilent Technologies	G4226A	1290 Infinity series
C18 reverse phase column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
Centrifuge	Eppendorf	5452000018	Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostat	Agilent Technologies	G1316C	1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)	Agilent Technologies	G4212B	1260 Infinity series
Electrospray ionnization source	Agilent Technologies	G3251B	Dual sprayer ESI source
Formic acid	J.T. Baker	0128-02	Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data Acquisition	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Qualitative Analysis	Agilent Technologies	G3338AA
Microcentrifuge tube	Brand	BR780546	Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-1L	200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MS	Agilent Technologies	G6530B	6530 Accurate Mass
Quaternary pump	Agilent Technologies	G4204A	1290 Infinity series
Syringe filter	Thermo Scientific	44514-NN	17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
Thermostat	Agilent Technologies	G1330B	1290 Infinity series
Vial	Agilent Technologies	8010-0199	Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insert	Agilent Technologies	5183-2089	Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
Water	Tedia	WL2212-001	LC Mass spectrometry