Cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni accoppiata all'analisi spettrometrica di massa di metaboliti fenolici nel plasma di anziani

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare metaboliti fenolici nel plasma utilizzando un metodo di cromatografia-spettrometria di massa semi-mirato.

Abstract

A un gruppo di 23 persone anziane sono stati somministrati pasti funzionali (una bevanda e un muffin) appositamente formulati per la prevenzione della sarcopenia (perdita di massa muscolare legata all'età). I campioni di plasma sono stati prelevati all'inizio dell'intervento e dopo 30 giorni di consumo dei pasti funzionali. È stata effettuata una cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni abbinata all'analisi di massa tandem (UPLC-MS/MS) per identificare i composti fenolici e i loro metaboliti. Le proteine plasmatiche sono state precipitate con etanolo e i campioni sono stati concentrati e risospesi nella fase mobile (acetonitrile 1:1: acqua) prima dell'iniezione nello strumento UPLC-MS/MS. La separazione è stata effettuata con una colonna di fase inversa _C18 e i composti sono stati identificati utilizzando la loro massa sperimentale, la distribuzione isotopica e il modello di frammento. I composti di interesse sono stati confrontati con quelli delle banche dati e della libreria semi-mirata interna. I risultati preliminari hanno mostrato che i principali metaboliti identificati dopo l'intervento erano acido fenilacetico, glicina, acido 3-idrossifenilvalerico e gomisina M2.

Introduzione

La sarcopenia è un disturbo scheletrico progressivo correlato ad una perdita accelerata di muscoli nella popolazione anziana. Questa condizione aumenta il rischio di cadute e porta a attività limitate della vita quotidiana. La sarcopenia è presente in circa il 5%-10% delle persone di età superiore ai 65 anni e in circa il 50% delle persone di età pari o superiore a 80 ^anni1. Non sono stati approvati farmaci specifici per il trattamento della sarcopenia, quindi la prevenzione con l'attività fisica e una dieta equilibrata è ^{importante1,2}. Gli interventi nutrizionali ....

Protocollo

I campioni di plasma utilizzati in questo protocollo sono stati raccolti in uno studio precedente seguendo tutte le linee guida etiche e approvati dal Comitato istituzionale di etica e bioetica (CIEB-2018-1-37) dell'Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Il protocollo completo per l'estrazione e l'identificazione dei composti fenolici e dei metaboliti nel plasma da parte di UPLC-MS/MS è rappresentato nella Figura 1.

Figura 1

Risultati

Il processo passo-passo per l'identificazione dei metaboliti fenolici attraverso l'analisi semi-mirata UPLC-MS/MS, in modalità negativa, di campioni di plasma è illustrato nella Figura 2. In primo luogo, il cromatogramma ionico totale (TIC) dall'estratto fenolico plasmatico (ottenuto dopo la precipitazione proteica del campione plasmatico totale) è stato ottenuto attraverso il software qualitativo dello strumento. Successivamente, è stato utilizzato il cromatogramma.......

Discussione

L'identificazione e la quantificazione dei fitochimici bioattivi che vengono assorbiti dopo il consumo di un alimento o di un integratore alimentare sono cruciali per dimostrare e comprendere i benefici per la salute di questi composti e degli alimenti che li contengono. Nel presente lavoro è stato sviluppato il metodo UPLC-MS/MS, finalizzato unicamente all'identificazione dei principali composti fenolici e dei loro metaboliti che sono aumentati di concentrazione nel plasma dopo un intervento nutrizionale di 30 giorni c.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tedia	Al1129-001	LC Mass spectrometry
Autosampler	Agilent Technologies	G4226A	1290 Infinity series
C18 reverse phase column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
Centrifuge	Eppendorf	5452000018	Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostat	Agilent Technologies	G1316C	1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)	Agilent Technologies	G4212B	1260 Infinity series
Electrospray ionnization source	Agilent Technologies	G3251B	Dual sprayer ESI source
Formic acid	J.T. Baker	0128-02	Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data Acquisition	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Qualitative Analysis	Agilent Technologies	G3338AA
Microcentrifuge tube	Brand	BR780546	Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-1L	200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MS	Agilent Technologies	G6530B	6530 Accurate Mass
Quaternary pump	Agilent Technologies	G4204A	1290 Infinity series
Syringe filter	Thermo Scientific	44514-NN	17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
Thermostat	Agilent Technologies	G1330B	1290 Infinity series
Vial	Agilent Technologies	8010-0199	Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insert	Agilent Technologies	5183-2089	Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
Water	Tedia	WL2212-001	LC Mass spectrometry