노인의 혈장에서 페놀 대사 산물의 질량 분광법 분석에 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피

요약

이 프로토콜의 목표는 반표적 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 혈장에서 페놀 대사 산물을 검출하는 것입니다.

초록

23 명의 노인 그룹에게 유육종 구균증 (근육 질량의 연령 관련 손실)의 예방을 위해 특별히 공식화 된 기능성 식사 (음료 및 머핀)가 주어졌습니다. 혈장 샘플은 개입의 시작과 기능성 식사를 섭취 한 30 일 후에 채취되었다. 페놀 화합물과 그 대사 산물을 확인하기 위해 탠덤 질량 (UPLC-MS/MS) 분석과 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피가 수행되었습니다. 혈장 단백질을 에탄올로 침전시키고, 샘플을 농축하고 UPLC-MS/MS 기기에 주입하기 전에 이동상(1:1 아세토니트릴: 물)에 재현탁시켰다. 분리는 _C18 역상 컬럼으로 수행되었고, 화합물은 그들의 실험 질량, 동위원소 분포 및 단편 패턴을 사용하여 확인되었다. 관심있는 화합물은 데이터 뱅크 및 내부 반 표적 라이브러리의 화합물과 비교되었습니다. 예비 결과는 개입 후 확인 된 주요 대사 산물이 페닐 아세트산, 글리시틴, 3-하이드록시 페닐발레르산 및 고미신 M2임을 보여주었습니다.

서문

유육종증은 노인 인구의 근육 손실이 가속화되는 것과 관련된 진행성 골격 장애입니다. 이 상태는 낙상의 위험을 증가시키고 일상 생활의 제한된 활동으로 이어집니다. 사르크로니아는 65세 이상 인구의 약 5%-10%, 80세 이상의 사람의 약 50%에 존재합니다¹. 유육종증 치료를 위해 특정 약물이 승인되지 않았으므로 신체 활동과 균형 잡힌 식단으로 예방하는 것이 중요합니다^1,2. 유제품 단백질과 필수 아미노산이 풍부한 특수 공식화 식품에 대한 영양 개입은 유육종 감소증을 예방하는 데 긍정적 인 결과를 보여주었습니다². 다른 연구에서, 저자들은 비타민 E와 이소플라본과 같은 비타민과 항산화제를 식단에 포함시켜 허리와 엉덩이의 근육 증가에 대한 이점을 증가시켰다³.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón)는 멕시코 열대 지방에서 자라는 나무입니다. 그것은 높은 영양 가치로 인해 마야 문화에 의해 소비되었습니다⁴. 그것은 단백질, 섬유, 미네랄 및 클로로겐산⁵과 같은 페놀 성 산화 방지제의 좋은 원천입니다. 분말로 분쇄하여 베이킹 제품에 사용하거나 음료에 섭취 할 수 있기 때문에 최근 연구에 따르면 라몬 종자 가루 (RSF)를 다른 식품에 혼입하여 영양 가치를 향상시키는 것으로 평가했습니다. RSF가 보충 된 카푸치노 맛의 음료가 공식화되었으며,식이 섬유가 풍부하고 서빙 당 6g 이상의 단백질을 함유하고 있으며 소비자들에게 높은 평가를 받았습니다. 따라서, 그것은 특별한식이 요구 사항을 충족하기위한 잠재적 인 대안으로 간주되었습니다⁶. 후속 연구에서 RSF는 머핀과 단백질,식이 섬유, 미량 영양소 및 페놀 성 항산화 물질이 풍부한 새로운 음료를 공식화하는 데에도 사용되었습니다. 머핀과 음료는 30 일 동안 하루에 두 번 두 번 섭취 한 노인을위한식이 중재에 사용되었습니다. 이 기간이 지나면 참가자의 영양 및 유육종 상태가 개선되고 혈장의 총 페놀 함량이 증가했습니다⁷. 그러나 혈장에서 총 페놀 화합물의 결정은 분광 광도법에 의해 수행되었으므로 흡수 된 실제 페놀 화합물의 확인은 불가능했습니다. 또한,이 방법은 페놀 화합물에 대해 완전히 특이적이지 않으므로 일부 과대 평가가 발생할 수 있습니다⁸.

이러한 항산화제가 풍부한 식품을 섭취한 후 흡수되는 페놀계 화합물의 동정 및 정량화는 어려운 작업이지만 이러한 파이토케미컬의 생물학적 활성을 입증하기 위해서는 필요하다. 대부분의 페놀 화합물의 생체 이용률은 낮다; 그 중 5 % 미만은 플라즈마에서 구조적 변형없이 발견 될 수 있습니다. 페놀계 화합물은 메틸화, 설폰화 또는 글루쿠로니데이션과 같은 여러 가지 생물변형을 겪으며, 이는 장세포 및 간세포에 의해 수행된다⁹. 페놀 화합물은 또한 미생물에 의해 박테리아 이화 물질로 생물 변환되어 혈장에 흡수 된 후 신체에서 유익한 효과를 발휘할 수 있습니다¹⁰. 예를 들어, 페닐아세트산은 플라보노이드 및 올리고머성 프로안토시아니딘의 박테리아 형질전환의 산물이며, 이는 크랜베리 섭취 후 요로에서의 박테리아(Escherichia coli) 부착을 최대 40%까지 억제할 수 있다¹¹.

자연 발생 페놀 화합물의 구조적 다양성은 대사 산물의 다양성과 낮은 생체 이용률에 추가되어 혈장에서의 식별을 더욱 어렵게 만듭니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 탠덤 질량 분광법 (MS / MS)과 같은 분광학적 분석 플랫폼을 사용하는 대사 체학 프로파일 링은이 목표를 달성하기위한 최선의 방법 일 것입니다. 불행히도 장비에 쉽게 접근 할 수 없으며 분석 프로토콜 개발은 여전히 제한적입니다¹². 몇몇 연구는 MS/MS가 분리 시스템(액체 크로마토그래피와 같은)과 결합되어 대사체 연구에서 질량 스펙트럼의 복잡성을 감소시키기 위한 전략이라고 보고했다. 최근 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 분리 방법이 도입됨에 따라 기존의 고성능 액체 프로토콜에 비해 분석 시간이 단축되고 분해능과 감도가 향상되어 UPLC-MS/MS 시스템은 분석 대사체학 커뮤니티에서 빠르게 널리 받아들여지고 있습니다¹³. 이러한 방식으로 일부 연구는 페놀 대사 산물을 조사하고 카페산, 퀘르세틴 및 페룰산의 글루쿠로니다제 유도체뿐만 아니라 크랜베리 섭취 후 개인의 혈장에서 주사기 및 바닐산의 술폰화 유도체를 검출했습니다¹⁴. 이전의 프로토콜은 혈장과 같은 생체 유체에서 페놀 화합물과 페놀 대사 산물을 발견하기위한 것입니다. 이들 프로토콜은 UV-vis 검출기(¹⁵)에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 동정 및 정량화에 기초하였다. 그럼에도 불구하고 이러한 프로토콜은 절대 식별 및 정확한 정량화를 평가하기 위해 확실한 표준을 사용해야합니다. 광범위한 연구가 UPLC-MS 및 UPLC-MS / MS에 의한 생체 유체 (황산화, 글루 쿠로 니드 및 메틸화 된 형태)에서 가장 흔한 대사 산물을 확인했습니다. 그러나, 박테리아 대사산물의 상당 부분은 그들의 완전한 정보를 포함하는 데이터베이스의 부족으로 인해보고되지 않았다¹⁶. 대사 산물 식별은 대사 산물 표준의 비용과 상업적 가용성으로 인해 복잡합니다. 따라서 가장 좋은 전략은 분자 특징 정보 (m / z, 단일 동위원소 정확한 질량, 동위원소 분포 및 단편화 패턴)의 사용에 의존하여 화학적 동일성을 결정하고 폴리 폴리 페놀 풍부 섭취 후 생체 유체에서 확인 된 폴리페놀 대사 산물을 포함하는 자유롭게 이용 가능한 온라인 데이터베이스와 비교하는 비표적 또는 반 표적 MS / MS 대사 산물 분석 일 수 있습니다.¹² . 페놀 화합물 및 그 대사 산물의 식별을 위해 UPLC-MS/MS 연구에 사용되는 가장 중요한 데이터베이스는 HMDB(Human Metabolome Database), LipidBlast Library, METLIN Library, PubChem, ChemSpider 및 Phenol ^Explorer17과 같은 기타 보완 데이터베이스입니다.

본 연구에서, RSF 함유 머핀 및 음료 소비 연구에 참여한 노인 그룹의 혈장 샘플을 분석하기 위해 반표적 UPLC-MS/MS 방법이 개발되었다⁷. 혈장 대사 산물의 다른 무료 온라인 데이터베이스의 데이터가 수집되어 특수 데이터베이스에 통합되었습니다. 이 데이터베이스는 장비 소프트웨어에 의해 자동으로 액세스하여 영양 개입 30 일 전후의 다섯 가지 혈장 샘플에서 폴리 페놀 대사 산물을 식별 할 수 있습니다. 이것은 유육종증의 예방을 위해 특별히 공식화 된 기능성 식품에서 흡수되는 주요 페놀 화합물 또는 그 대사 산물을 확인하기 위해 수행됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 사용 된 혈장 샘플은 모든 윤리적 지침에 따라 이전 연구에서 수집되었으며 Universidad Autónoma de Ciudad Juárez의 기관 윤리 및 생명 윤리위원회 (CIEB-2018-1-37)의 승인을 받았습니다. UPLC-MS/MS에 의한 혈장 내 페놀계 화합물 및 대사산물의 추출 및 확인을 위한 완전한 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1: 반표적 UPLC-MS/MS 방법에 의한 혈장 내 페놀 화합물 및 대사산물의 추출 및 확인에 대한 개략적인 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 시료 준비

1. 분석될 때까지 혈장 샘플을 -80°C에서 보관한다.
2. 플라즈마 샘플을 실온에서 15분 동안 해동시킨다.
   참고: 샘플을 37°C의 수조에 배치하여 공정을 가속화할 수 있습니다(5분).
3. 200 μL의 혈장 샘플을 2 mL 마이크로튜브에 넣고 1,000 μL의 순수한 에탄올과 혼합한다. 플라즈마 샘플을 30초 동안 소용돌이친다.
   참고: 플라즈마 샘플로 작업할 때는 항상 장갑을 착용하십시오.
4. 샘플을 6,580 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 마이크로피펫 또는 파스퇴르 피펫으로 상층액을 수집하여 새로운 마이크로튜브에 넣는다. 상청액을 4°C에서 보관한다.
5. 이전 단계로부터의 펠렛을 1,000 μL의 100% 에탄올과 혼합하고, 30초 동안 와동시킨 다음, 6,580 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   참고 : 펠렛은 강하게 포장되어 있으며 샘플과 순수한 에탄올 사이의 접촉을 보장하기 위해 잘 재현탁해야합니다. 펠렛을 에탄올로 플러시하기 위해 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
6. 원심분리 후, 상층액을 수집하고 단계 1.4로부터 이전에 수득된 상청액과 혼합한다. 2 mL 마이크로튜브에서.
7. 135 psi에서 순수한 질소 (99.997 %)를 사용하여 샘플에서 에탄올을 제거하십시오. 바늘을 마이크로튜브 상단에서 1cm 떨어진 곳에 두어 시료 손실을 방지하고 시료가 건조될 때까지 플러시합니다. 에탄올을 증발시키기 위해 열이 필요하지 않습니다.
   참고: 질소 흐름은 샘플 손실을 방지하기 위해 낮아야 합니다. 에탄올이 건조되면 시료 건조를 보장하기 위해 질소 흐름을 적어도 5 분 동안 유지하십시오. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 -20°C에서 보관해야 합니다. 샘플을 12 시간 이상 보관하지 마십시오.
8. 건조 샘플을 아세토니트릴:50:50의 비율로 물 혼합물의 100 μL에 재현탁시킨다 (v:v).
9. 샘플을 0.45 μm 나일론 주사기 멤브레인을 통해 HPLC 바이알 마이크로 인서트 내로 직접 여과한다.
   참고: 바이알의 샘플은 분석 전에 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 샘플을 8시간 이상 보관하지 마십시오. 여과 직후에 샘플을 UPLC 시스템에 주입하는 것이 좋습니다.

2. UPLC-MS/MS 분석

1. 3μL의 샘플을 _C18 역상 컬럼(50mm x 2.1mm, 1.8μm)이 장착된 UPLC에 주입합니다. 자동 시료 주입기 온도를 20°C로 설정하고 컬럼 온도 조절기를 25°C로 설정합니다. 각 샘플을 세 배로 주입하십시오.
2. 물에 0.1% (v:v) 포름산을 용매 A로, 용매 B로 100% 아세토니트릴을 사용하십시오. 유속을 0.4 mL/min으로 설정하고 다음과 같이 구배 프로그램을 설정하십시오: 0-1분 10% B, 1-4분 30% B, 4-6분 38% B, 6-8분 60% B, 8-8.5분 60% B, 8.5-9분 10% B(표 1).
3. 질량 분광계를 음의 모드 이온화로 설정하십시오. 질소를 340°C에서 건조 가스로 사용하고 유량은 13L/min입니다. 분무기 압력을 60psi로 설정합니다. 모세관 전압을 4,000V, 단편기 전압을 175V, 스키머 전압을 65V로 설정합니다. 충돌 에너지를 20V에서 사용합니다(표 2).
4. 100-1100 질량 대 전하 비율(m/z) 사이의 질량을 스캔하고, MS/MS의 경우 50-1000 m/z 사이의 질량을 스캔합니다(표 2). 데이터 수집을 자동 MS/MS 모드로 설정합니다. 다음 참조 질량을 사용하십시오: 119.036 및 966.0007.

시간(분)	용매 A (HPLC 물 중 0.1 % 포름산)	용매 B (100% 아세토니트릴)
0 대 1	90	10
1 대 4	70	30
4 대 6	62	38
6 대 8	40	60
8 ~ 8.5	40	60
8.5 ~ 9	90	10

표 1: UPLC에 의한 페놀 화합물의 분리에 사용되는 이동상 구배.

이온화 모드	마이너스
건조 가스	340 °C에서 질소, 유량 13 L/min
분무기 압력	60 psi
모세관 전압	175 V
MS 스캔 매스	100-1100 m/z
MS/MS 스캔 매스	50-1000 m/z

표 2: MS/MS 분석을 위한 이온화 파라미터.

3. 데이터베이스 구축

1. 페놀 화합물, 페놀 대사 산물 또는 과학 문헌에서 관심있는 다른 화합물을 검색하십시오.
2. UPLC 시스템에 포함된 데이터베이스 관리 소프트웨어를 엽니다. 파일 | 선택 새 PCDL(개인 데이터베이스 복합 라이브러리) | 새 PCDL을 만듭니다. PCDL 유형: LC/MS 대사체학을 선택합니다. PCDL의 이름을 설정합니다. 그런 다음 만들기를 선택합니다.
3. 도구 모음에서 PCDL을 선택한 다음 편집 허용 옵션을 선택합니다. 그런 다음 컴파운드 찾기 단추를 클릭합니다.
   참고: 새 PCDL이므로 테이블 결과가 비어 있습니다. 이것은 새로운 화합물이 PCDL에 첨가되면 바뀔 것이다.
   1. 특수 개인 데이터베이스 복합 라이브러리에 컴파운드를 추가하여 계측기의 일반 라이브러리에서 복사합니다. 데이터베이스 관리 소프트웨어에 포함된 계측기의 기존 데이터베이스를 엽니다. 컴파운드 찾기 버튼을 클릭합니다. 단일 검색 옵션에서 복합 검색 조건을 입력하여 관심 있는 화합물을 찾습니다.
      참고: 화합물은 이름, 분자식, 정확한 질량 및 체류 시간으로 찾을 수 있습니다.
   2. 화합물 결과 표에서 관심 있는 화합물을 선택합니다. 둘 이상의 화합물을 선택하려면 첫 번째 화합물을 클릭하고 Ctrl 키를 누른 채 관심 있는 각 화합물을 클릭합니다. 그런 다음 강조 표시된 모든 화합물을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 PCDL에 추가를 선택합니다.
   3. 새 창에서 특수 개인 데이터베이스 파일을 검색하고 선택합니다. 존재하는 경우 화합물에 대한 스펙트럼 포함 상자를 표시하고 존재하는 경우 화합물에 대한 이온 이동성 정보를 포함합니다. 추가 단추를 클릭합니다. 새 대화 상자에서 예를 선택하여 추가된 새 화합물을 확인합니다. 아니요 를 선택하여 더 많은 관심 화합물을 계속 검색합니다.
4. 관심있는 화합물을 기기의 일반 라이브러리에서 사용할 수없는 경우 수동으로 새 화합물을 추가하십시오.
   1. 특수 개인 데이터베이스를 엽니다. 일단 열리면 3.3 단계를 따르십시오. 컴파운드 편집 옵션을 선택합니다. 새로 추가 단추를 클릭합니다.
   2. 창의 위쪽 섹션에서 새 화합물에 대한 정보를 완료합니다. 수식, 이름, IUPAC 이름, CAS 번호, Chemspider ID 및 기타 식별자를 입력합니다.
   3. 무료 온라인 라이브러리 (Chemspider, PubChem 및 Phenol Explorer)에서 사용할 수있는 정보를 사용하여 관심있는 새로운 화합물에 대한 정보를 입력하십시오. 완료되면 새로 저장 버튼을 클릭하여 새 복합 정보를 특수 개인 데이터베이스에 저장합니다.
      참고 : 무료 라이브러리에서 정보를 추가 할 때 염화물 또는 요오드화물 이온이 존재하지 않고 화합물 정보를 포함해야합니다. 이는 관심있는 화합물의 정확한 질량 및 분자식을 수정할 수 있다.
5. 관심있는 모든 화합물로 프로세스를 반복하여 특수 개인 데이터베이스를 완성하십시오.

4. 데이터 분석

1. 장비의 정성적 관리자 소프트웨어를 사용하여 샘플에 존재하는 페놀 화합물과 페놀 대사 산물을 확인하십시오.
2. 샘플 파일을 엽니다. 크로마토그램 패널에서 크로마토그램 정의를 선택하고 총 이온 크로마토그램(TIC), MS의 추출된 이온 크로마토그램(EIC) 및 MS/MS의 EIC를 추출합니다. 통합 크로마토그램 옵션을 선택합니다.
3. 화합물 찾기 패널에서 수식 옵션으로 찾기를 선택합니다. 새 창에서 수식 원본을 선택한 다음 데이터베이스/라이브러리 옵션을 선택합니다. 이전에 만든 개인 데이터베이스를 찾아 열기를 클릭하십시오.
4. [수식 일치] 옵션을 선택하고 질량 일치 공차를 5ppm(백만개)으로 설정합니다.
   참고: 질량의 다른 일치 허용 오차는 10ppm으로 설정할 수 있습니다. 이 차이는 사용 된 질량 분광계에 따라 다릅니다.
5. 음이온 옵션을 선택하고 -H 대화상자만 선택합니다. 결과 옵션에서 추출 EIC, 정리된 스펙트럼 추출, 원시 스펙트럼 추출 및 구조 포함 대화 상자를 표시합니다.
6. 결과 필터 옵션을 선택합니다. 점수가 있으면 Mark에게 경고하고 점수 일치를 80.00%로 설정합니다. 점수가 일치하면 마크 일치하지 않으며 점수를 75.00 %로 설정하십시오.
   참고: 일치/일치하지 않는 점수는 필요한 경우 더 낮은 값으로 변경할 수 있습니다. 이렇게하면 식별의 정확성이 떨어집니다.
7. 수식별 화합물 찾기를 클릭하여 샘플에서 관심 있는 화합물을 식별합니다.

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결과

혈장 샘플의 음성 모드에서 반표적 UPLC-MS/MS 분석을 통해 페놀 대사산물을 확인하기 위한 단계별 공정은 그림 2에 묘사되어 있다. 먼저, 혈장 페놀학 추출물(총 혈장 샘플의 단백질 침전 후 수득됨)로부터의 총 이온 크로마토그램(TIC)을 기기의 정성 소프트웨어를 통해 수득하였다. 그런 다음 추출 된 이온 크로마토그램을 사용하고 각 신호 (또는 분자 특징)의 ?...

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토론

식품 또는 식품 보충제를 섭취 한 후에 흡수되는 생리 활성 식물 화학 물질의 식별 및 정량화는 이러한 화합물과 그 함유 식품의 건강상의 이점을 입증하고 이해하는 데 중요합니다. 본 연구에서, UPLC-MS/MS 방법은 노인을 위해 특별히 공식화된 두 가지 식품으로 30일간의 영양 개입 후 혈장 내 농도가 증가한 주요 페놀 화합물과 그 대사 산물의 확인만을 목표로 개발되었다. 하나의 화합물이 개입 기...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tedia	Al1129-001	LC Mass spectrometry
Autosampler	Agilent Technologies	G4226A	1290 Infinity series
C18 reverse phase column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
Centrifuge	Eppendorf	5452000018	Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostat	Agilent Technologies	G1316C	1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)	Agilent Technologies	G4212B	1260 Infinity series
Electrospray ionnization source	Agilent Technologies	G3251B	Dual sprayer ESI source
Formic acid	J.T. Baker	0128-02	Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data Acquisition	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Qualitative Analysis	Agilent Technologies	G3338AA
Microcentrifuge tube	Brand	BR780546	Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-1L	200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MS	Agilent Technologies	G6530B	6530 Accurate Mass
Quaternary pump	Agilent Technologies	G4204A	1290 Infinity series
Syringe filter	Thermo Scientific	44514-NN	17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
Thermostat	Agilent Technologies	G1330B	1290 Infinity series
Vial	Agilent Technologies	8010-0199	Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insert	Agilent Technologies	5183-2089	Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
Water	Tedia	WL2212-001	LC Mass spectrometry