测定带状纤维粘弹性的生物制备及机械技术

摘要

该协议描述了研究细胞外基质粘弹性及其对蛋白质组成或环境因素的依赖性的方法。目标基质系统是鼠标区域。通过比较野生型带状纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的粘弹性行为来证明该方法的性能。

摘要

弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种性质主要来自细胞外基质（ECM），这是将细胞和组织结合在一起的蛋白质网状物。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的弛豫特性是否起生理作用，都是尚未完全解决的问题。部分挑战在于大多数 ECM 系统的复杂架构，以及在不影响其结构的情况下隔离 ECM 组件的困难。一个例外是区域，这是一种在脊椎动物眼中发现的ECM系统。该区域由数百至数千微米长的纤维组成，横跨晶状体和眼壁之间的无细胞空间。在本报告中，我们描述了一种机械技术，该技术利用区域的高度组织结构来量化其粘弹性并确定单个蛋白质组分的贡献。该方法涉及解剖固定的眼睛以暴露晶状体和区域，并采用引体向上技术，在监测其张力的同时均匀拉伸带状纤维。该技术相对便宜，但灵敏度足以检测缺乏特定区域蛋白或随着年龄的增长而产生的小鼠中区域纤维粘弹性特性的改变。虽然这里介绍的方法主要用于研究眼发育和疾病，但它也可以作为一个实验模型，用于探索有关弹性ECM的粘弹性性质以及外部因素（如离子浓度，温度和与信号分子的相互作用）的作用的更广泛问题。

引言

脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上¹。透镜通过一组精密的径向光纤悬挂在光轴上，如图1A所示。在一端，纤维附着在晶状体赤道上，在另一端，附着在睫状体的表面上。它们的长度范围从小鼠的150μm到人类的1 mm。这些纤维统称为^Zinn2的带状体，睫状状体，或简称为状状带。眼外伤、疾病和某些遗传性疾病可影响区域纤维的完整性³，导致其最终衰竭并伴随视力丧失。在小鼠中，纤维的核心主要由蛋白质纤维菌素-2组成，周围是富含纤毛素-¹⁴的地幔。虽然区域纤维是眼睛独有的，但它们与身体其他部位发现的基于弹性蛋白的ECM纤维有许多相似之处。后者由纤毛素-1地幔⁵覆盖，并且具有与带状纤维相似的尺寸⁶。其他蛋白质，如潜伏转化生长因子β结合蛋白（LTBPs）和微纤维相关糖蛋白-1（MAGP-1），与两种类型的纤维有关^{7，8，9，10，11}。带状纤维的弹性模量在0.18~1.50 ^{MPa12、13、14、15、16}之间，与弹性蛋白基纤维（0.3~1.2 MPa）^相当17.这些结构和机械上的相似性使我们相信，对区域相关蛋白质的作用的任何见解都可能有助于阐明它们在其他ECM弹性纤维中的作用。

开发这里描述的方法的主要目的是深入了解特定区域蛋白在遗传性眼病进展中的作用。一般方法是将野生型小鼠中带状纤维的粘弹性与携带编码区状蛋白基因的靶向突变的小鼠的粘弹性特性进行比较。虽然以前已经使用了几种方法来测量带状纤维的弹性力学性能，但所有这些都是为更大的动物的眼睛设计的^{12，13，14，15，16}。由于这些模型在遗传上是不可处理的;我们试图开发一种更适合小鼠小而细腻的眼睛的实验方法。

我们开发的用于评估小鼠区域纤维粘弹性的方法是我们称之为上拉测定^法4，18的技术，如图1直观地总结。下面详细介绍了上拉方法和对结果的分析。我们首先描述设备的构造，包括项目中使用的三维（3D）打印部件。接下来，我们详细介绍了用于获取和准备实验眼睛的方案。最后，我们提供了有关如何获取数据以确定带状纤维粘弹性的分步说明。在代表性结果部分，我们分享了以前未发表的数据，这些数据来自缺乏MAGP-119的小鼠的带状纤维的粘弹性特性，以及从年龄匹配的野生型动物获得的对照集。最后，我们总结了该方法的优点和局限性的一般性评论，并提出了可能阐明环境和生化因素如何影响ECM纤维粘弹性的潜在实验的建议。

研究方案

所有动物实验均获得华盛顿大学动物研究委员会的批准，并遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。

1. 专用零件的制造和设备的制造

1. 专用零件的制造
   1. 探头制造。以 图2A左面板所示的角度握住玻璃毛细管。从点烟器中取出一个火焰，从一端约2厘米处点燃，并保持在那里，直到末端弯曲90°，如图 2A的右面板所示。
   2. 示例平台制造。使用3D绘图软件，设计一个尺寸为30 x 30 x 5 mm的平台，其中包含直径为2.0，2.5和3.0 mm的半球形压痕，如图 2B所示。
   3. 探头支架制造。使用3D绘图软件，设计一个支架，用于固定毛细管探头并将其连接到显微操作器（见 图2C）。
      注:可根据通讯作者的要求，提供用于平台制造和探头支架制造的 STL 格式的示例 3D 文件。
   4. 负片镜头组件。如图1C和图1D所示，放置一个负圆柱透镜（焦距为-75 mm，高度和长度约为50 mm），以纠正因向培养皿中添加液体而引起的失真（添加流体会扭曲从侧面成像时解剖的眼睛的视野）。
   5. 将负片镜头粘在2槽底座之一上（有关底座上透镜的定位，请参见 图2D ）。
   6. 组装其余零件， 如图 2D 所示。
   7. 调整立柱的高度，使镜头几乎不会悬停在刻度上，并拧紧立柱支架中的螺钉。
2. 设备构造
   1. 在计算机上安装随秤、显微镜相机软件和电动千分尺控制器应用程序一起提供的日志记录程序。
   2. 将电动千分尺连接到伺服电机控制器，后者连接到计算机。启动电机控制器应用程序并编辑电机设置。
      注:下面列出的电机设置是在初步实验后选择的，该实验显示应力在10-20秒的时间尺度上放松。基于这一测定，我们选择了一种速度和加速度，允许电机在小于弛豫时间的时间内完成50μm的位移，但不会太短以避免震动样品。在这里，我们选择了大约5-10秒的位移时间。
   3. 将最大速度设置为 0.01 mm/s，将加速度设置为 0.005 mm/^s2。
   4. 将相机安装在检查显微镜中并测试相机成像软件。
   5. 将秤放在专用于设备的台式空间上。
   6. 将3D打印平台（从步骤1.1.2）粘合到培养皿中，并将2-3毫米的玻璃珠添加到其中一个孔中。将培养皿放在秤上，使磁珠位于平底锅中心附近。
   7. 将显微操作器上的手动千分尺更换为电动千分尺。
   8. 将两个4-40螺钉拧入探头支架。将探头支架连接到机械手， 如图1C所示。
   9. 如图 2A所示准备探头，将其放在探头支架内，弯曲部分朝下，然后拧紧螺钉。
   10. 将显微操作器放置在工作台上，使探头的尖端位于平台上的磁珠上方。将显微操作器贴在工作台上，以防止在实验过程中意外移动。
   11. 将侧显微镜放在桌子上，使珠子位于其视野的中心并聚焦。

2. 样品制备和数据采集

1. 眼睛固定和解剖
   1. 将野生型小鼠和 Magp1-null动物保持在相同的C57 / BL6J背景上。通过吸入_CO2 对1个月大或1岁的小鼠实施安乐死。
   2. 用细镊子取出眼睛，并将去核球体在4°C下在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中过夜。如^所述，在固定过程中，眼睛中保持15-20 mmHg的正压6。
      注意:在雄性小鼠上进行实验，以控制眼球大小中可能存在的与性别相关的差异。正压确保球体保持充气，保持晶状体与眼壁之间的间隙，由带状纤维跨越。
   3. 在PBS中洗眼睛10分钟。使用眼科手术剪刀并在立体显微镜下工作，在靠近视神经头的眼睛壁上做一个全层切口。
   4. 将切口向前延伸到赤道，然后围绕眼睛的赤道周长。注意避免脆弱的睫状过程和相关的区域纤维。
   5. 取下地球背面，露出晶状体的后表面。
   6. 使用镊子从缓冲溶液中取出解剖的眼睛，并将其放在干燥的干湿巾上，角膜朝下。轻轻地将角膜拖过湿巾表面以使其干燥。
   7. 将3μL速溶胶水加入平台孔中，以容纳培养皿中的眼睛。
   8. 将盘子放在立体显微镜的舞台板上，以便可以看到带有胶水的井。
   9. 将眼睛从湿巾转移到含有胶水的井的边缘。然后，小心地将眼睛拖入孔中，并快速调整其方向，使镜片的背面最上方。
   10. 用干湿巾的一角轻轻擦拭镜片的外露面，将其擦干。
   11. 在50毫米培养皿的底部涂抹一点速溶胶，并将平台粘合到其上。
2. 测量区域粘弹性响应
   1. 打开秤，启动秤记录程序和相机软件。确保日志记录程序可以获取30分钟的数据，因为某些试验可以持续很长时间。
   2. 打开伺服电机控制器，然后在计算机上启动控制器应用程序。确保控制器设置为以 50 μm 为增量移动，使用的运动参数类似于步骤 1.2.2 中注释中概述的参数。
   3. 如步骤 1.1.1 中所述，在毛细管棒中创建 90° 弯曲。
   4. 将弯曲的毛细管滑入毛细管探头支架，然后拧紧固定螺钉。
      注意:为了尽量减少样品脱水，我们建议在眼部解剖之前或期间完成步骤1-4。
   5. 在毛细管尖端加入一小（~1毫米）UV固化胶珠。
   6. 使用机械手上的手动调整，移动毛细管探头的尖端，使其直接位于镜头的中心上方。从正面（通过目视检查）和侧面（通过显微镜相机）观察时，检查UV胶水的底部是否在镜头顶部居中。
   7. 在通过相机观察时，降低探头尖端，直到UV胶与镜头接触并覆盖其上表面的三分之一至一半。
   8. 使用低强度（~1 mW）、定向、近可见的紫外线（380-400nm）光源固化胶水。
      注意:这些规格足以在几秒钟内固化胶水，同时最大限度地减少诱导蛋白质交联的可能性。商用 UV 胶笔随附的 UV 光源符合这些规格。
   9. 将PBS溶液加入培养皿中，直到眼睛被液体覆盖至至少2毫米的深度。
   10. 将圆柱形透镜放在检查显微镜的前面，并尽可能靠近培养皿，不要触摸它。
   11. 同时启动日志记录程序和计时器程序。使用相机拍摄眼睛/探头的照片。
   12. 60秒后，再启动一次50μm位移，此后每60秒一次，直到实验完成，即直到所有纤维都断裂。请注意，由于实验过程中缓冲液蒸发，信号不会返回到基线水平。在数据分析过程中纠正读数中随后的漂移，如步骤2.2.14所示。
   13. 运行完成后，保存秤记录数据并将其导出为与电子表格兼容的格式，例如.csv格式。保存在运行过程中收集的镜头图片。
   14. 将数据导入电子表格。使用第一个和最后一个刻度读数来插值背景读数中由于蒸发而随时间变化的漂移（见 图3）。从每个时间点的读数中减去插值读数。
       注意:如果使用电子表格，则可以自动执行插值，方法是输入公式 = B2 - $B$2 +（$B$ 2 - @INDIRECT（"B"&COUNTA（B:B）））/（COUNTA（B:B）-2） * A2 在第一个刻度读数右侧的单元格中，然后将光标移动到单元格的右下角并将其向下拖动到最后一个数据值。该公式假定数据组织在一列中，第一个数据点出现在单元格 B2 中。如果需要，可以使用共同作者之一Matthew ^Riley4博士开发的准弹性粘弹性模型分析步骤2.2.14中处理的数据。

结果

这里描述的引体向上技术为确定小鼠中带状纤维的粘弹性特性提供了一种直接的方法。简而言之，首先通过在生理眼内压下注射固定剂来保存小鼠眼睛。这种方法保持了眼睛的自然膨胀，并保持纤维适当的预张紧（在初步实验证明它不会显着改变纤维的弹性或强度后，固定被认为是可以接受的）。然后通过解剖去除小鼠眼睛的后部，以暴露晶状体和悬挂它的带状纤维。眼睛的前部固定在平台上，?...

讨论

区域是一种不寻常的ECM系统，其中光纤对称排列，并且可以通过沿光轴置换眼镜片来相同地操纵。该空间也可以很容易地进入而不会破坏细胞，从而允许在接近其原始状态的环境中研究纤维。引体向上技术利用这种ECM演示来操纵来自小鼠的脆弱纤维，这是一个遗传上可处理的系统，并准确地量化其机械性能。这使我们能够检查关键ECM蛋白（原纤维化素-¹¹⁸，LTBP-24和此处报道的MAGP-...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon