Biologische Präparation und mechanische Technik zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der viskoelastizität der extrazellulären Matrix und ihrer Abhängigkeit von der Proteinzusammensetzung oder Umweltfaktoren. Das zielgerichtete Matrixsystem ist die Mauszonule. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird durch den Vergleich des viskoelastischen Verhaltens von Wildtyp-Zonularfasern mit denen ohne Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 demonstriert.

Zusammenfassung

Elastizität ist essentiell für die Funktion von Geweben wie Blutgefäßen, Muskeln und Lungen. Diese Eigenschaft leitet sich hauptsächlich von der extrazellulären Matrix (ECM) ab, dem Proteingeflecht, das Zellen und Gewebe miteinander verbindet. Wie sich die elastischen Eigenschaften eines ECM-Netzwerks auf seine Zusammensetzung beziehen und ob die Relaxationseigenschaften des ECM eine physiologische Rolle spielen, sind Fragen, die noch nicht vollständig geklärt sind. Ein Teil der Herausforderung liegt in der komplexen Architektur der meisten ECM-Systeme und der Schwierigkeit, ECM-Komponenten zu isolieren, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen. Eine Ausnahme ist die Zonule, ein ECM-System, das im Auge von Wirbeltieren vorkommt. Die Zonule besteht aus hunderten bis tausenden Mikrometer langen Fasern, die den zellfreien Raum zwischen Linse und Augenwand überspannen. In diesem Bericht beschreiben wir eine mechanische Technik, die die hochorganisierte Struktur der Zonule nutzt, um ihre viskoelastischen Eigenschaften zu quantifizieren und den Beitrag einzelner Proteinkomponenten zu bestimmen. Die Methode beinhaltet die Dissektion eines festen Auges, um die Linse und die Zonule freizulegen, und verwendet eine Pull-up-Technik, die die Zonularfasern gleichmäßig dehnt, während ihre Spannung überwacht wird. Die Technik ist relativ kostengünstig, aber empfindlich genug, um Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern bei Mäusen ohne spezifische zonuläre Proteine oder mit zunehmendem Alter nachzuweisen. Obwohl die hier vorgestellte Methode in erster Linie für die Untersuchung der Augenentwicklung und -erkrankung konzipiert ist, könnte sie auch als experimentelles Modell dienen, um breitere Fragen zu den viskoelastischen Eigenschaften elastischer ECMs und der Rolle externer Faktoren wie Ionenkonzentration, Temperatur und Wechselwirkungen mit Signalmolekülen zu untersuchen.

Einleitung

Das Auge eines Wirbeltiers enthält eine lebende optische Linse, die hilft, Bilder auf die Netzhaut zu ^fokussieren1. Die Linse wird an der optischen Achse durch ein System empfindlicher, radial orientierter Fasern aufgehängt, wie in Abbildung 1A dargestellt. An einem Ende heften sich die Fasern an den Linsenäquator und am anderen Ende an die Oberfläche des Ziliarkörpers. Ihre Längen reichen von 150 μm bei Mäusen bis zu 1 mm beim Menschen. Zusammen sind diese Fasern als die Zonule von ^Zinn2, die Ziliarzonule oder einfach die Zonule bekannt. Augentraumata, Krankheiten und bestimmte genetische Störungen können die Integrität der zonulären ^Fasern3 beeinträchtigen, was zu ihrem eventuellen Versagen und dem damit einhergehenden Verlust des Sehvermögens führt. Bei Mäusen haben die Fasern einen Kern, der hauptsächlich aus dem Protein Fibrillin-2 besteht, umgeben von einem Mantel, der reich an Fibrillin-14 ^ist. Obwohl zonuläre Fasern einzigartig für das Auge sind, haben sie viele Ähnlichkeiten mit Elastin-basierten ECM-Fasern, die anderswo im Körper vorkommen. Letztere sind von einem Fibrillin-1-Mantel5 bedeckt und haben ähnliche Abmessungen wie zonuläre ^Fasern6. Andere Proteine, wie latent transformierende Wachstumsfaktor-β-bindende Proteine (LTBPs) und Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 (MAGP-1), werden in Verbindung mit beiden Fasertypen gefunden7,8,9,10,11. Der Elastizitätsmodul von Zonularfasern liegt im Bereich von 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, vergleichbar mit dem von Elastin-basierten Fasern (0,3-1,2 MPa)¹⁷. Diese architektonischen und mechanischen Ähnlichkeiten führen uns zu der Annahme, dass jeder Einblick in die Rolle von zonuli-assoziierten Proteinen dazu beitragen kann, ihre Rolle in anderen EKVM-Fasern aufzuklären.

Der Hauptzweck der Entwicklung der hier beschriebenen Methode besteht darin, Einblicke in die Rolle spezifischer zonulärer Proteine beim Fortschreiten der erblichen Augenerkrankung zu gewinnen. Der allgemeine Ansatz besteht darin, die viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Wildtypmäusen mit denen von Mäusen zu vergleichen, die gezielte Mutationen in Genen tragen, die für zonuläre Proteine kodieren. Während zuvor mehrere Methoden verwendet wurden, um die elasto-mechanischen Eigenschaften von zonulären Fasern zu messen, wurden alle für die Augen von viel größeren Tieren entwickelt12,13,14,15,16. Da solche Modelle genetisch nicht behandelbar sind; Wir wollten eine experimentelle Methode entwickeln, die besser für die kleinen und empfindlichen Augen von Mäusen geeignet ist.

Die von uns entwickelte Methode zur Beurteilung der Viskoelastizität von Mauszonulafasern ist eine Technik, die wir als Pull-up-Assay4,18 bezeichnen und die in Abbildung 1 visuell zusammengefasst ist. Eine detaillierte Beschreibung der Pull-up-Methode und der Analyse der Ergebnisse finden Sie unten. Wir beginnen mit der Beschreibung der Konstruktion der Apparatur, einschließlich der dreidimensionalen (3D)gedruckten Teile, die im Projekt verwendet werden. Als nächstes beschreiben wir das Protokoll, das zum Erhalten und Vorbereiten der Augen für das Experiment verwendet wird. Schließlich geben wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie Daten für die Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern erhalten. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse teilen wir bisher unveröffentlichte Daten, die mit unserer Methode zu den viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern von Mäusen ohne ^MAGP-119 gewonnen wurden, sowie einen Kontrollsatz, der von altersangepassten Wildtyptieren erhalten wurde. Schließlich schließen wir mit allgemeinen Bemerkungen zu den Vorteilen und Einschränkungen der Methode und Vorschlägen für mögliche Experimente, die aufklären können, wie Umwelt- und biochemische Faktoren die viskoelastischen Eigenschaften von ECM-Fasern beeinflussen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Animal Studies Committee der Washington University genehmigt und hielten sich an die ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Herstellung von Spezialteilen und Konstruktion von Apparaten

1. Herstellung von Spezialteilen
   1. Sondenfertigung. Halten Sie eine Glaskapillare in einem Winkel, wie in der linken Abbildung 2A dargestellt. Legen Sie eine Flamme aus einem Zigarettenanzünder etwa 2 cm von einem Ende entfernt und halten Sie sie dort, bis sich das Ende um 90° biegt, wie in der rechten Abbildung 2A gezeigt.
   2. Beispiel für die Herstellung von Plattformen. Entwerfen Sie mithilfe einer 3D-Zeichensoftware eine Plattform mit den Maßen 30 x 30 x 5 mm und halbkugelförmigen Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,0, 2,5 mm und 3,0 mm, wie in Abbildung 2B dargestellt.
   3. Herstellung von Sondenhaltern. Entwerfen Sie mit der 3D-Zeichensoftware eine Halterung, die die Kapillarsonde hält, und befestigen Sie sie an einem Mikromanipulator (siehe Abbildung 2C).
      HINWEIS: Eine Beispiel-3D-Datei für die Plattformherstellung und die Herstellung von Sondenhaltern im STL-Format ist auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.
   4. Negative Linsenmontage. Platzieren Sie eine negative zylindrische Linse (-75 mm Brennweite und ca. 50 mm in Höhe und Länge), wie in Abbildung 1C und Abbildung 1D gezeigt, um die Verzerrung zu korrigieren, die durch die Zugabe von Flüssigkeit zur Petrischale verursacht wird (die Zugabe von Flüssigkeit verzerrt die Sicht auf das sezierte Auge, wenn es von der Seite aufgenommen wird).
   5. Kleben Sie die Negativlinse auf eine der 2-schlitzigen Basen (siehe Abbildung 2D für die Positionierung der Linse auf der Basis).
   6. Setzen Sie die verbleibenden Teile wie in Abbildung 2D dargestellt zusammen.
   7. Stellen Sie die Höhe des Pfostens so ein, dass das Objektiv kaum über der Skala schwebt und ziehen Sie die Schraube im Pfostenhalter fest.
2. Bau von Apparaten
   1. Installieren Sie das mit der Waage gelieferte Protokollierungsprogramm, die Mikroskopkamerasoftware und die motorisierte Mikrometer-Controller-Anwendung auf einem Computer.
   2. Schließen Sie das motorisierte Mikrometer an den Servomotorregler und diesen an den Computer an. Starten Sie die Motorsteuerungsanwendung und bearbeiten Sie die Motoreinstellungen.
      HINWEIS: Die unten aufgeführten motorischen Einstellungen wurden nach vorläufigen Experimenten ausgewählt, die zeigten, dass sich die Belastungen auf einer Zeitskala von 10-20 s entspannten. Basierend auf dieser Bestimmung wählten wir eine Geschwindigkeit und Beschleunigung, die es dem Motor ermöglichten, eine Verschiebung von 50 μm in einer Zeit zu vollenden, die kleiner als die Relaxationszeit war, aber nicht zu kurz, um ein Ruckeln der Probe zu vermeiden. Hier wählten wir eine Verdrängungszeit von ca. 5-10 s.
   3. Stellen Sie die maximale Geschwindigkeit auf 0,01 mm/s und die Beschleunigung auf 0,005 mm/^{s2 ein}.
   4. Installieren Sie die Kamera im Inspektionsmikroskop und testen Sie die Kamerabildgebungssoftware.
   5. Platzieren Sie die Waage auf dem Bankraum, der dem Gerät gewidmet ist.
   6. Kleben Sie eine 3D-gedruckte Plattform (ab Schritt 1.1.2) auf eine Petrischale und fügen Sie eine 2-3 mm große Glasperle zu einer der Vertiefungen hinzu. Stellen Sie die Petrischale auf die Waage, so dass sich die Perle in der Nähe der Mitte der Pfanne befindet.
   7. Ersetzen Sie das manuelle Mikrometer des Mikromanipulators durch das motorisierte.
   8. Schrauben Sie die beiden 4-40 Schrauben in den Sondenhalter. Befestigen Sie den Sondenhalter am Manipulator, wie in Abbildung 1C dargestellt.
   9. Bereiten Sie eine Sonde wie in Abbildung 2A dargestellt vor, legen Sie sie mit dem gebogenen Teil nach unten in den Sondenhalter, und ziehen Sie die Schrauben fest.
   10. Positionieren Sie den Mikromanipulator so auf dem Tisch, dass sich die Spitze der Sonde über der Perle auf der Plattform befindet. Befestigen Sie den Mikromanipulator auf dem Tisch, um eine versehentliche Bewegung während des Experiments zu verhindern.
   11. Positionieren Sie das Seitenmikroskop so auf dem Tisch, dass sich die Perle in der Mitte ihres Sichtfeldes befindet und scharf ist.

2. Probenvorbereitung und Datenerfassung

1. Augenfixierung und Dissektion
   1. Pflegen Sie Wildtypmäuse und Magp1-Null-Tiere auf einem identischen C57/BL6J-Hintergrund. 1 Monat alte oder 1-jährige Mäuse durch _{CO2-Inhalation} einschläfern.
   2. Die Augen mit einer feinen Pinzette entfernen und die enukleierten Kugeln über Nacht bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) fixieren. Halten Sie während des Fixierungsprozesses einen Überdruck von 15-20 mmHg im Auge aufrecht, wie ^beschrieben6.
      HINWEIS: Experimente werden an männlichen Mäusen durchgeführt, um mögliche geschlechtsspezifische Unterschiede in der Größe des Augenglobus zu kontrollieren. Der Überdruck sorgt dafür, dass der Globus aufgeblasen bleibt und der Spalt zwischen der Linse und der Wand des Auges, die von den zonulären Fasern überspannt wird, erhalten bleibt.
   3. Waschen Sie die Augen für 10 minuten in PBS. Machen Sie mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere und unter einem Stereomikroskop einen Einschnitt in voller Dicke in die Augenwand in der Nähe des Sehnervenkopfes.
   4. Verlängern Sie den Schnitt nach vorne zum Äquator und dann um den Äquatorumfang des Auges. Achten Sie darauf, die empfindlichen Ziliarprozesse und die damit verbundenen zonulären Fasern zu schonen.
   5. Entfernen Sie die Rückseite des Globus und legen Sie die hintere Oberfläche des Objektivs frei.
   6. Verwenden Sie die Pinzette, um ein seziertes Auge aus der Pufferlösung zu entfernen und es mit der Hornhaut nach unten auf ein trockenes Aufgabenwischen zu legen. Ziehen Sie die Hornhaut vorsichtig über die Oberfläche des Tuchs, um sie zu trocknen.
   7. Fügen Sie 3 μL Sofortkleber zu den Plattformschächten hinzu, die das Auge in der Petrischale aufnehmen.
   8. Legen Sie die Schüssel auf die Bühnenplatte des Stereomikroskops, so dass der Brunnen mit dem Kleber in Sicht ist.
   9. Übertragen Sie das Auge vom Tuch auf den Rand des Brunnens, der Klebstoff enthält. Ziehen Sie dann das Auge vorsichtig in den Brunnen und passen Sie seine Ausrichtung schnell so an, dass sich die Rückseite der Linse ganz oben befindet.
   10. Trocknen Sie die belichtete Seite der Linse, indem Sie sie vorsichtig mit der Ecke eines Trockentuchs abtupfen.
   11. Tragen Sie einen Klecks Instantkleber auf den Boden einer 50 mm Petrischale auf und zementieren Sie die Plattform darauf.
2. Messung der zonulären viskoelastischen Reaktion
   1. Schalten Sie die Waage ein, starten Sie das Waagenprotokollierungsprogramm und die Kamerasoftware. Stellen Sie sicher, dass das Protokollierungsprogramm Daten für 30 Minuten erfassen kann, da einige Versuche so lange dauern können.
   2. Schalten Sie den Servomotorregler ein und starten Sie die Steuerungsanwendung auf dem Computer. Stellen Sie sicher, dass der Regler so eingestellt ist, dass er sich in Schritten von 50 μm bewegt, indem Sie Bewegungsparameter verwenden, die denen ähneln, die im HINWEIS in Schritt 1.2.2 beschrieben sind.
   3. Erzeugen Sie eine 90°-Biegung in einem Kapillarstab, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
   4. Schieben Sie die gebogene Kapillare in den Kapillarsondenhalter und ziehen Sie die Sicherungsschrauben fest.
      HINWEIS: Um die Austrocknung der Probe zu minimieren, empfehlen wir, die Schritte 1-4 vor oder während der Augendissektion abzuschließen.
   5. Fügen Sie eine kleine (~ 1 mm) Perle aus UV-härtendem Klebstoff an die Spitze der Kapillare hinzu.
   6. Bewegen Sie die Spitze der Kapillarsonde mit den manuellen Einstellungen am Manipulator so, dass sie sich direkt über der Mitte der Linse befindet. Überprüfen Sie, ob der untere Teil des UV-Klebers über der Oberseite des Objektivs zentriert erscheint, wenn er von vorne (durch visuelle Inspektion) und von der Seite (durch die Mikroskopkamera) betrachtet wird.
   7. Während Sie durch die Kamera schauen, senken Sie die Sondenspitze ab, bis der UV-Kleber mit dem Objektiv in Kontakt kommt und ein Drittel bis die Hälfte seiner Oberseite bedeckt.
   8. Verwenden Sie eine direktionale, nahezu sichtbare UV-Lichtquelle (380-400 nm) mit geringer Intensität (~ 1 mW), um den Klebstoff auszuhärten.
      HINWEIS: Diese Spezifikationen reichen aus, um den Klebstoff in wenigen Sekunden auszuhärten und gleichzeitig das Potenzial für die Induktion einer Proteinvernetzung zu minimieren. Die mit handelsüblichen UV-Klebestiften gelieferten UV-Lichtquellen erfüllen diese Spezifikationen.
   9. Fügen Sie PBS-Lösung in die Schüssel hinzu, bis das Auge bis zu einer Tiefe von mindestens 2 mm von Flüssigkeit bedeckt ist.
   10. Platzieren Sie die zylindrische Linse vor dem Inspektionsmikroskop und so nah wie möglich an der Petrischale, ohne sie zu berühren.
   11. Starten Sie gleichzeitig das Protokollierungsprogramm und ein Timer-Programm. Machen Sie ein Foto des Auges / der Sonde mit der Kamera.
   12. Nach 60 s werden weitere 50 μm Verschiebung eingeleitet und danach alle 60 s, bis das Experiment abgeschlossen ist, d.h. bis alle Fasern gebrochen sind. Beachten Sie, dass das Signal aufgrund der Pufferverdampfung während des Experiments nicht auf das Ausgangsniveau zurückkehrt. Korrigieren Sie die daraus resultierende Abweichung der Messwerte während der Datenanalyse, wie in Schritt 2.2.14 veranschaulicht.
   13. Speichern Sie nach Abschluss eines Durchlaufs die Skalenprotokollierungsdaten und exportieren Sie sie in ein format, das mit der Tabellenkalkulation kompatibel ist, z. B. ein .csv Format. Speichern Sie die Objektivbilder, die während des Laufs gesammelt wurden.
   14. Importieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle. Verwenden Sie den ersten und den letzten Skalenwert, um die Drift im Hintergrundwert im Laufe der Zeit aufgrund von Verdunstung zu interpolieren (siehe Abbildung 3). Subtrahieren Sie den interpolierten Messwert von dem Messwert zu jedem Zeitpunkt.
       HINWEIS: Wenn Sie eine Tabelle verwenden, kann die Interpolation automatisch durchgeführt werden, indem Sie die Formel = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 in die Zelle rechts neben dem ersten Maßstabsmesswert eingeben, dann den Cursor in die rechte untere Ecke der Zelle bewegen und bis zum letzten Datenwert nach unten ziehen. Bei der Formel wird davon ausgegangen, dass die Daten in einer Spalte organisiert sind, wobei der erste Datenpunkt in Zelle B2 angezeigt wird. Falls gewünscht, können die in Schritt 2.2.14 verarbeiteten Daten mit dem quasi-elastischen viskoelastischen Modell analysiert werden, das von einem der Co-Autoren, Dr. Matthew ^Riley4, entwickelt wurde.

Ergebnisse

Die hier beschriebene Pull-up-Technik bietet einen einfachen Ansatz zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Mäusen. Kurz gesagt, das Mausauge wird zuerst durch Injektion eines Fixiermittels beim physiologischen Augeninnendruck konserviert. Dieser Ansatz behält die natürliche Inflation des Auges bei und hält die Fasern richtig vorgespannt (die Fixierung wurde als akzeptabel angesehen, nachdem vorläufige Experimente gezeigt hatten, dass sie die Elastizität oder Festigkeit der Fasern...

Diskussion

Die Zonule ist ein ungewöhnliches ECM-System, bei dem die Fasern symmetrisch angeordnet sind und identisch manipuliert werden können, indem die Augenlinse entlang der optischen Achse verschoben wird. Der Raum kann auch ohne zelluläre Störung leicht zugänglich gemacht werden, so dass die Fasern in einer Umgebung in der Nähe ihres ursprünglichen Zustands untersucht werden können. Die Pull-up-Technik nutzt diese ECM-Präsentation, um die empfindlichen Fasern von Mäusen, einem genetisch handhabbaren System, zu manip...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon