Préparation biologique et technique mécanique pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zozonulaires

Résumé

Le protocole décrit une méthode pour l’étude de la viscoélasticité de la matrice extracellulaire et de sa dépendance à la composition protéique ou aux facteurs environnementaux. Le système matriciel ciblé est la zonule de souris. La performance de la méthode est démontrée en comparant le comportement viscoélastique des fibres zonulaires de type sauvage avec celles dépourvues de glycoprotéine-1 associée aux microfibrilles.

Résumé

L’élasticité est essentielle à la fonction des tissus tels que les vaisseaux sanguins, les muscles et les poumons. Cette propriété est dérivée principalement de la matrice extracellulaire (ECM), le maillage protéique qui lie les cellules et les tissus ensemble. Comment les propriétés élastiques d’un réseau ECM sont liées à sa composition, et si les propriétés de relaxation de l’ECM jouent un rôle physiologique, sont des questions qui n’ont pas encore été pleinement abordées. Une partie du défi réside dans l’architecture complexe de la plupart des systèmes ECM et la difficulté d’isoler les composants ECM sans compromettre leur structure. Une exception est la zonule, un système ECM trouvé dans l’œil des vertébrés. La zonule comprend des fibres de centaines à des milliers de micromètres de longueur qui couvrent l’espace sans cellule entre la lentille et la paroi oculaire. Dans ce rapport, nous décrivons une technique mécanique qui tire parti de la structure hautement organisée de la zonule pour quantifier ses propriétés viscoélastiques et déterminer la contribution des composants protéiques individuels. La méthode implique la dissection d’un œil fixe pour exposer la lentille et la zonule et utilise une technique de traction qui étire les fibres zonulaires de manière égale pendant que leur tension est surveillée. La technique est relativement peu coûteuse mais suffisamment sensible pour détecter des altérations des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez des souris dépourvues de protéines zonulaires spécifiques ou avec le vieillissement. Bien que la méthode présentée ici soit conçue principalement pour étudier le développement oculaire et la maladie, elle pourrait également servir de modèle expérimental pour explorer des questions plus larges concernant les propriétés viscoélastiques des ECM élastiques et le rôle de facteurs externes tels que la concentration ionique, la température et les interactions avec les molécules de signalisation.

Introduction

L’œil d’un vertébré contient une lentille optique vivante qui aide à focaliser les images sur la ^rétine1. La lentille est suspendue sur l’axe optique par un système de fibres délicates orientées radialement, comme illustré à la figure 1A. À une extrémité, les fibres se fixent à l’équateur de la lentille et, à l’autre, à la surface du corps ciliaire. Leurs longueurs s’étendent sur des distances allant de 150 μm chez la souris à 1 mm chez l’homme. Collectivement, ces fibres sont connues sous le nom de zonule de ^Zinn2, la zonule ciliaire, ou simplement la zonule. Les traumatismes oculaires, les maladies et certains troubles génétiques peuvent affecter l’intégrité des fibres zonulaires3, entraînant leur échec éventuel et une perte de vision qui l’accompagne. Chez la souris, les fibres ont un noyau composé principalement de la protéine fibrilline-2, entourée d’un manteau riche en fibrilline-14. Bien que les fibres zonulaires soient uniques à l’œil, elles présentent de nombreuses similitudes avec les fibres ECM à base d’élastine trouvées ailleurs dans le corps. Ces dernières sont recouvertes d’un manteau de fibrilline-15 et ont des dimensions similaires à celles des fibres zonulaires6. D’autres protéines, telles que les protéines de liaison β (LTBPs) et la glycoprotéine 1 associée aux microfibrilles (MAGP-1), se trouvent en association avec les deux types de fibres7,8,9,10,11. Le module élastique des fibres zonulaires est compris entre 0,18 et 1,50 MPa12,13,14,15,16, comparable à celui des fibres à base d’élastine (0,3-1,2 MPa)¹⁷. Ces similitudes architecturales et mécaniques nous amènent à croire que tout aperçu des rôles des protéines associées aux zonules peut aider à élucider leurs rôles dans d’autres fibres élastiques ECM.

L’objectif principal du développement de la méthode décrite ici est de mieux comprendre le rôle de protéines zonulaires spécifiques dans la progression de la maladie oculaire héréditaire. L’approche générale consiste à comparer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez les souris de type sauvage avec celles des souris porteuses de mutations ciblées dans les gènes codant pour les protéines zonulaires. Bien que plusieurs méthodes aient été utilisées précédemment pour mesurer les propriétés élasto-mécaniques des fibres zonulaires, toutes ont été conçues pour les yeux d’animaux beaucoup plus grands12,13,14,15,16. En tant que tels modèles, ils ne sont pas génétiquement traitables; nous avons cherché à développer une méthode expérimentale mieux adaptée aux petits et délicats yeux des souris.

La méthode que nous avons développée pour évaluer la viscoélasticité des fibres zonulaires de souris est une technique que nous appelons le test pull-up4,18, qui est résumé visuellement dans la figure 1. Une description détaillée de la méthode pull-up et de l’analyse des résultats est fournie ci-dessous. Nous commençons par décrire la construction de l’appareil, y compris les pièces imprimées en trois dimensions (3D) utilisées dans le projet. Ensuite, nous détaillons le protocole utilisé pour obtenir et préparer les yeux pour l’expérience. Enfin, nous fournissons des instructions étape par étape sur la façon d’obtenir des données pour la détermination des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires. Dans la section Résultats représentatifs, nous partageons des données inédites obtenues avec notre méthode sur les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires de souris dépourvues de ^MAGP-119 ainsi qu’un ensemble de contrôle obtenu à partir d’animaux de type sauvage appariés selon l’âge. Enfin, nous concluons par des remarques générales sur les avantages et les limites de la méthode, et des suggestions d’expériences potentielles qui pourraient élucider comment les facteurs environnementaux et biochimiques affectent les propriétés viscoélastiques des fibres ECM.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université de Washington et ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Fabrication de pièces spécialisées et construction d’appareils

1. Fabrication de pièces spécialisées
   1. Fabrication de sondes. Tenez un capillaire en verre à un angle comme illustré dans le panneau de gauche de la figure 2A. Placez une flamme d’un allume-cigare à environ 2 cm d’une extrémité et maintenez-la là jusqu’à ce que l’extrémité se plie de 90°, comme le montre le panneau de droite de la figure 2A.
   2. Fabrication d’échantillons de plate-forme. À l’aide d’un logiciel de dessin 3D, concevez une plate-forme mesurant 30 x 30 x 5 mm et contenant des indentations hémisphériques de 2,0, 2,5 et 3,0 mm de diamètre, comme illustré à la figure 2B.
   3. Fabrication du porte-sonde. À l’aide du logiciel de dessin 3D, concevez un support qui maintient la sonde capillaire et fixez-la à un micromanipulateur (voir Figure 2C).
      REMARQUE: Un exemple de fichier 3D pour la fabrication de plate-forme et la fabrication de porte-sonde au format STL est disponible sur demande auprès de l’auteur correspondant.
   4. Assemblage de lentilles négatives. Placez une lentille cylindrique négative (-75 mm de distance focale et environ 50 mm de hauteur et de longueur) comme illustré à la figure 1C et à la figure 1D pour corriger la distorsion causée par l’ajout de liquide à la boîte de Pétri (l’ajout de liquide déforme la vue de l’œil disséqué lorsqu’il est imagé de côté).
   5. Collez la lentille négative sur l’une des bases à 2 fentes (voir la figure 2D pour le positionnement de l’objectif sur la base).
   6. Assemblez les pièces restantes comme illustré à la figure 2D.
   7. Ajustez la hauteur du poteau de sorte que l’objectif plane à peine sur la balance et serrez la vis dans le support du poteau.
2. Construction d’appareils
   1. Installez sur un ordinateur le programme de journalisation fourni avec la balance, le logiciel de caméra de microscope et l’application de contrôleur de micromètre motorisé.
   2. Connectez le micromètre motorisé au contrôleur du servomoteur et ce dernier à l’ordinateur. Démarrez l’application du contrôleur de moteur et modifiez les paramètres du moteur.
      REMARQUE: Les réglages du moteur, qui sont énumérés ci-dessous, ont été choisis à la suite d’expériences préliminaires qui ont révélé que les contraintes se détendaient sur une échelle de temps de 10 à 20 s. Sur la base de cette détermination, nous avons sélectionné une vitesse et une accélération qui permettaient au moteur de réaliser un déplacement de 50 μm dans un temps inférieur au temps de relaxation, mais pas trop court pour éviter de secouer l’échantillon. Ici, nous avons choisi un temps de déplacement d’environ 5-10 s.
   3. Réglez la vitesse maximale à 0,01 mm/s et l’accélération à 0,005 mm/^s2.
   4. Installez la caméra dans le microscope d’inspection et testez le logiciel d’imagerie de la caméra.
   5. Placez la balance sur l’espace de banc consacré à l’appareil.
   6. Collez une plate-forme imprimée en 3D (à partir de l’étape 1.1.2) dans une boîte de Petri et ajoutez une perle de verre de 2 à 3 mm à l’un des puits. Placez la boîte de Petri sur la balance de sorte que la perle soit située près du centre de la casserole.
   7. Remplacez le micromètre manuel du micromanipulateur par le micromanipulateur motorisé.
   8. Vissez les deux vis 4-40 dans le porte-sonde. Fixez le porte-sonde au manipulateur comme illustré à la Figure 1C.
   9. Préparez une sonde comme illustré à la Figure 2A, placez-la à l’intérieur du porte-sonde avec la partie pliée vers le bas et serrez les vis.
   10. Placez le micromanipulateur sur la table de manière à ce que la pointe de la sonde soit au-dessus de la perle sur la plate-forme. Fixez le micromanipulateur à la table pour éviter tout mouvement accidentel pendant l’expérience.
   11. Positionnez le microscope latéral sur la table de sorte que la perle soit au centre de son champ de vision et au point.

2. Préparation des échantillons et acquisition des données

1. Fixation et dissection oculaires
   1. Maintenir les souris de type sauvage et les animaux Magp1-null sur un fond C57/BL6J identique. Euthanasier des souris de 1 mois ou 1 an par inhalation de _CO2 .
   2. Retirer les yeux avec une pince fine et fixer les globes énucléés à 4 °C pendant la nuit dans une solution saline tamponnée à 4 % de paraformaldéhyde/phosphate (PBS, pH 7,4). Maintenir une pression positive de 15-20 mmHg dans l’œil pendant le processus de fixation, comme ^décrit6.
      REMARQUE: Des expériences sont menées sur des souris mâles, afin de contrôler les différences possibles liées au sexe dans la taille du globe oculaire. La pression positive assure que le globe reste gonflé, préservant l’espace entre la lentille et la paroi de l’œil enjambé par les fibres zonulaires.
   3. Lavez les yeux pendant 10 min dans PBS. À l’aide de ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et en travaillant sous un stéréomicroscope, faites une incision de pleine épaisseur dans la paroi de l’œil près de la tête du nerf optique.
   4. Étendez la coupe vers l’équateur, puis autour de la circonférence équatoriale de l’œil. Prenez soin d’épargner les processus ciliaires délicats et les fibres zonulaires associées.
   5. Retirez l’arrière du globe, exposant la surface postérieure de la lentille.
   6. Utilisez la pince pour retirer un œil disséqué de la solution tampon et placez-le sur une lingette sèche avec la cornée tournée vers le bas. Faites glisser doucement la cornée sur la surface de la lingette pour la sécher.
   7. Ajouter 3 μL de colle instantanée aux puits de la plate-forme qui accueilleront l’œil dans la boîte de Pétri.
   8. Placez le plat sur la plaque de scène du stéréomicroscope afin que le puits avec la colle soit en vue.
   9. Transférez l’œil de la lingette au bord du puits qui contient de la colle. Ensuite, faites glisser soigneusement l’œil dans le puits et ajustez rapidement son orientation de sorte que l’arrière de la lentille soit le plus haut.
   10. Séchez le côté exposé de la lentille en l’épongeant doucement avec le coin d’une lingette sèche.
   11. Appliquez une noisette de colle instantanée au fond d’une boîte de Petri de 50 mm et cimentez la plate-forme.
2. Mesure de la réponse viscoélastique zozonulaire
   1. Allumez la balance, démarrez le programme d’enregistrement de la balance et le logiciel de la caméra. Assurez-vous que le programme de journalisation peut acquérir des données pendant 30 minutes, car certains essais peuvent durer aussi longtemps.
   2. Allumez le contrôleur du servomoteur et démarrez l’application du contrôleur sur l’ordinateur. Assurez-vous que le contrôleur est configuré pour se déplacer par incréments de 50 μm à l’aide de paramètres de mouvement similaires à ceux décrits dans la NOTE de l’étape 1.2.2.
   3. Créez une courbure de 90° dans une tige capillaire comme décrit à l’étape 1.1.1.
   4. Glissez le capillaire plié dans le porte-sonde capillaire et serrez les vis de fixation.
      REMARQUE: Pour minimiser la déshydratation de l’échantillon, nous recommandons que les étapes 1 à 4 soient complétées avant ou pendant la dissection oculaire.
   5. Ajouter une petite perle (~1 mm) de colle uvdurcissable à l’extrémité du capillaire.
   6. À l’aide des réglages manuels sur le manipulateur, déplacez la pointe de la sonde capillaire de sorte qu’elle soit directement au-dessus du centre de la lentille. Vérifiez si la partie inférieure de la colle UV semble centrée sur le dessus de l’objectif lorsqu’elle est vue de l’avant (par inspection visuelle) et du côté (à travers la caméra du microscope).
   7. En regardant à travers l’appareil photo, abaissez la pointe de la sonde jusqu’à ce que la colle UV entre en contact avec l’objectif et couvre un tiers à la moitié de sa surface supérieure.
   8. Utilisez une source de lumière UV (380-400 nm) de faible intensité (~ 1 mW), directionnelle et presque visible pour durcir la colle.
      REMARQUE: Ces spécifications suffisent à durcir la colle en quelques secondes tout en minimisant le potentiel d’induction de la réticulation des protéines. Les sources de lumière UV fournies avec les stylos à colle UV commerciaux répondent à ces spécifications.
   9. Ajouter la solution de PBS à la boîte jusqu’à ce que l’œil soit recouvert de liquide à une profondeur d’au moins 2 mm.
   10. Placez la lentille cylindrique devant le microscope d’inspection et aussi près que possible de la boîte de Pétri sans la toucher.
   11. Démarrez simultanément le programme de journalisation et un programme de minuterie. Prenez une photo de l’œil / de la sonde à l’aide de l’appareil photo.
   12. Après 60 s, initier un autre déplacement de 50 μm, puis toutes les 60 s jusqu’à ce que l’expérience soit terminée, c’est-à-dire jusqu’à ce que toutes les fibres aient été brisées. Notez que le signal ne reviendra pas aux niveaux de base en raison de l’évaporation du tampon pendant l’expérience. Corrigez la dérive qui s’ensuit dans les lectures au cours de l’analyse des données, comme illustré à l’étape 2.2.14.
   13. À la fin d’une exécution, enregistrez les données de journalisation de l’échelle et exportez-les dans un format compatible avec la feuille de calcul, par exemple un format .csv. Enregistrez les images de l’objectif qui ont été collectées pendant la course.
   14. Importer des données dans une feuille de calcul. Utilisez la première et la dernière lecture d’échelle pour interpoler la dérive de la lecture d’arrière-plan au fil du temps due à l’évaporation (voir la figure 3). Soustrayez la lecture interpolée de la lecture à chaque point temporel.
       REMARQUE: Si vous utilisez une feuille de calcul, l’interpolation peut être effectuée automatiquement en entrant la formule = B2 - $B $2 + ($B $2 - @INDIRECT(« B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 dans la cellule à droite de la première lecture d’échelle, puis en déplaçant le curseur dans le coin inférieur droit de la cellule et en le faisant glisser vers le bas jusqu’à la dernière valeur de données. La formule suppose que les données sont organisées dans une colonne avec le premier point de données apparaissant dans la cellule B2. Si vous le souhaitez, les données traitées à l’étape 2.2.14 peuvent être analysées avec le modèle viscoélastique quasi-élastique développé par l’un des co-auteurs, le Dr Matthew ^Riley4.

Résultats

La technique de traction décrite ici fournit une approche simple pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez la souris. En bref, l’œil de souris est d’abord préservé par injection d’un fixateur à la pression intraoculaire physiologique. Cette approche maintient le gonflage naturel de l’œil et maintient les fibres correctement pré-tendues (la fixation a été jugée acceptable après que des expériences préliminaires ont démontré qu’elle ne modifiait pas l’élastici...

Discussion

La zonule est un système ECM inhabituel où les fibres sont disposées symétriquement et peuvent être manipulées à l’identique en déplaçant la lentille oculaire le long de l’axe optique. L’espace est également facilement accessible sans perturbation cellulaire, ce qui permet d’étudier les fibres dans un environnement proche de leur état natif. La technique pull-up tire parti de cette présentation ECM pour manipuler les fibres délicates de souris, un système génétiquement traitable, et quantifier av...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon