הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה לחקר צמיגות מטריצה חוץ-תאית ותלותה בהרכב החלבון או בגורמים סביבתיים. מערכת המטריצה הממוקדת היא זונולה של העכבר. הביצועים של השיטה מודגמים על ידי השוואת ההתנהגות הצמיגית של סיבים זונולריים מסוג בר עם אלה חסרים מיקרופיבריל הקשורים גליקופרוטאין-1.

Abstract

גמישות חיונית לתפקוד של רקמות כגון כלי דם, שרירים וריאות. מאפיין זה נגזר בעיקר מהמטריצה החוץ-תאית (ECM), רשת החלבון המחברת תאים ורקמות יחד. כיצד המאפיינים האלסטיים של רשת ECM מתייחסים להרכב שלה, והאם תכונות ההרפיה של ECM ממלאות תפקיד פיזיולוגי, הן שאלות שטרם טופלו במלואן. חלק מהאתגר טמון בארכיטקטורה המורכבת של רוב מערכות ה- ECM והקושי לבודד רכיבי ECM מבלי להתפשר על המבנה שלהם. יוצא מן הכלל אחד הוא zonule, מערכת ECM נמצא בעין של בעלי חוליות. הזונולה כוללת סיבים באורך של מאות עד אלפי מיקרומטרים המשתרעים על פני החלל נטול התאים בין העדשה לקיר העין. בדו"ח זה, אנו מתארים טכניקה מכנית המנצלת את המבנה המאורגן ביותר של הזונול כדי לכמת את תכונותיו הוויסקולאסטיות ולקבוע את תרומתם של רכיבי חלבון בודדים. השיטה כוללת ניתוח של עין קבועה כדי לחשוף את העדשה ואת zonule ומשתמשת בטכניקת משיכה למעלה המותחת את הסיבים הזונולריים באותה מידה בזמן שהמתח שלהם מנוטר. הטכניקה זולה יחסית אך רגישה מספיק כדי לזהות שינויים בתכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים בעכברים חסרי חלבונים זונולריים ספציפיים או עם הזדקנות. למרות שהשיטה המוצגת כאן מיועדת בעיקר לחקר התפתחות העין ומחלות, היא יכולה לשמש גם כמודל ניסיוני לחקר שאלות רחבות יותר לגבי התכונות הצמיגיות של ECM אלסטיים ותפקידם של גורמים חיצוניים כגון ריכוז יוני, טמפרטורה ואינטראקציות עם מולקולות איתות.

Introduction

העין של בעל חוליות מכילה עדשה אופטית חיה המסייעת למקד תמונות ^{ברשתית1}. העדשה תלויה על הציר האופטי על ידי מערכת של סיבים עדינים, רדיאליים, כפי שמודגם באיור 1A. בקצה אחד, הסיבים מתחברים לקו המשווה של העדשה, ובקצה השני, אל פני השטח של הגוף הסילארי. האורכים שלהם משתרעים על פני מרחקים הנעים בין 150 מיקרומטר בעכברים ל 1 מ"מ בבני אדם. באופן קולקטיבי, סיבים אלה ידועים בשם zonule של ^Zinn2, zonule ciliary, או פשוט zonule. טראומה עינית, מחלות והפרעות גנטיות מסוימות יכולות להשפיע על שלמות הסיבים הזונולריים3, וכתוצאה מכך כישלונם הסופי ואובדן הראייה הנלווה אליהם. בעכברים, הסיבים יש ליבה המורכבת בעיקר של פיברילין חלבון-2, מוקף מעטפת עשירה פיברילין-14. למרות סיבים זונולריים ייחודיים לעין, הם נושאים קווי דמיון רבים סיבי ECM מבוססי אלסטין שנמצאו במקומות אחרים בגוף. אלה האחרונים מכוסים על ידי פיברילין-1 ^מעטפת5 ויש להם ממדים דומים סיבים ^{זונולריים6}. חלבונים אחרים, כגון פקטורי גדילה β חלבון מחייב β (LTBPs) וגליקופרוטאין-1 הקשור למיקרופיבריל (MAGP-1), נמצאים בשיתוף עם שני סוגי הסיבים7,8,9,10,111 הקשורים למיקרופיבריל. מודולוס אלסטי של סיבים זונולריים הוא בטווח של 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, דומה לזה של סיבים מבוססי אלסטין (0.3-1.2 MPa)¹⁷. קווי דמיון ארכיטקטוניים ומכאניים אלה מובילים אותנו להאמין כי כל תובנה לגבי התפקידים של חלבונים הקשורים לזונולה עשויה לעזור להבהיר את תפקידם בסיבים אלסטיים אחרים של ECM.

המטרה העיקרית של פיתוח השיטה המתוארת כאן היא לקבל תובנות על התפקיד של חלבונים זונולריים ספציפיים בהתקדמות של מחלת עיניים תורשתית. הגישה הכללית היא להשוות את המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבים זונולריים בעכברים מסוג בר עם אלה של עכברים הנושאים מוטציות ממוקדות בגנים המקודדים חלבונים זונולריים. בעוד מספר שיטות שימשו בעבר כדי למדוד את המאפיינים האלסטו-מכניים של סיבים זונולריים, כולם תוכננו לעיניים של בעלי חיים גדולים בהרבה12,13,14,15,16. כמו מודלים כאלה אינם ניתנים למתיחה גנטית; ביקשנו לפתח שיטה ניסיונית שמתאימה יותר לעיניים הקטנות והעדינות של העכברים.

השיטה שפיתחנו להערכת הצמיגות של הסיבים הזונוריים של העכבר היא טכניקה שאנו מכנים "בדיקת משיכה ^{למעלה4,18"}, המסוכמת חזותית באיור 1. תיאור מפורט של שיטת המשיכה למעלה וניתוח התוצאות מסופק להלן. אנו מתחילים בתיאור בניית המנגנון, כולל החלקים המודפסים התלת מימדיים (3D) המשמשים בפרויקט. לאחר מכן, אנו מפרטים את הפרוטוקול המשמש להשגת והכנת העיניים לניסוי. לבסוף, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב כיצד להשיג נתונים לקביעת המאפיינים הצמיגיים של סיבים זונולריים. בסעיף תוצאות מייצגות, אנו משתפים נתונים שלא פורסמו בעבר שהושגו בשיטה שלנו על התכונות הצמיגיות של סיבים זונולריים מעכברים חסרי MAGP-119, כמו גם ערכת בקרה המתקבלת מחיות בר תואמות גיל. לבסוף, אנו מסיימים עם הערות כלליות על היתרונות והמגבלות של השיטה, והצעות לניסויים פוטנציאליים שעשויים להבהיר כיצד גורמים סביבתיים וביוכימיים משפיעים על המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבי ECM.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון.

1. ייצור חלקים מיוחדים ובניית מנגנון

1. ייצור של חלקים מיוחדים
   1. ייצור בדיקה. החזיקו נימי זכוכית בזווית כפי שמוצג בחלונית השמאלית של איור 2A. הניחו להבה ממצית סיגריה כ-2 ס"מ מקצה אחד ושמרו עליה שם עד שהסוף יתכופף ב-90°, כפי שמוצג בחלונית הימנית של איור 2A.
   2. ייצור פלטפורמה לדוגמה. באמצעות תוכנת ציור תלת-ממדית, תכננו פלטפורמה בגודל 30 x 30 x 5 מ"מ ומכילה חריצים חצי כדוריים בקוטר 2.0, 2.5 ו-3.0 מ"מ, כפי שמוצג באיור 2B.
   3. ייצור מחזיק בדיקה. באמצעות תוכנת הציור התלת-ממדית, תכננו תושבה המכילה את הגשושית הנימית וחברו אותה למיקרו-מניפולטור (ראו איור 2C).
      הערה: קובץ 3D לדוגמה לייצור פלטפורמה וייצור מחזיק בדיקה בפורמט STL זמין על פי בקשה מהמחבר המתאים.
   4. הרכבת עדשה שלילית. הניחו עדשה גלילית שלילית (75 מ"מ באורך מוקד וכ-50 מ"מ גובה ואורך) כפי שמוצג באיור 1C ובאיור 1D כדי לתקן את העיוות שנגרם על ידי הוספת נוזל לצלחת פטרי (תוספת נוזל מעוותת את מבט העין המנותחת כאשר היא מדמה מהצד).
   5. הדבק את העדשה השלילית לאחד מהבסיסים עם שני המחורצים (ראו איור 2D למיקום העדשה בבסיס).
   6. הרכיבו את החלקים הנותרים כפי שמוצג באיור 2D.
   7. התאם את גובה העמוד כך שהעדשה בקושי מרחפת מעל הסולם ומהדק את הבורג במחזיק הדואר.
2. בניית מנגנון
   1. התקן במחשב את תוכנית הרישום שסופקה עם קנה המידה, את תוכנת מצלמת המיקרוסקופ ואת יישום בקר המיקרומטר הממונע.
   2. חבר את המיקרומטר הממונע לבקר מנוע הסרוו ואחרון למחשב. הפעל את יישום בקר המנוע וערוך את הגדרות המנוע.
      הערה: הגדרות המנוע, המפורטות להלן, נבחרו לאחר ניסויים ראשוניים שגילו כי הלחצים נרגעו בסולם זמן של 10-20 שניות. בהתבסס על קביעה זו, בחרנו מהירות ותאוצה שאפשרו למנוע להשלים תזוזה של 50 מיקרומטר בזמן קטן יותר מזמן ההרפיה, אך לא קצר מדי כדי למנוע טלטלה במדגם. כאן בחרנו זמן עקירה של כ 5-10 שניות.
   3. הגדר את המהירות המרבית ל- 0.01 מ"מ / s ואת התאוצה ל- 0.005 מ"מ / ^s2.
   4. התקן את המצלמה במיקרוסקופ הבדיקה ובדוק את תוכנת הדמיית המצלמה.
   5. מניחים את קנה המידה על שטח הספסל המוקדש למנגנון.
   6. הדבק פלטפורמה בהדפסה תלת-ממדית (משלב 1.1.2) לצלחת פטרי והוסף חרוז זכוכית 2-3 מ"מ לאחת הבארות. מניחים את צלחת פטרי על הסולם, כך החרוז ממוקם ליד מרכז המחבת.
   7. החלף את המיקרומטר הידני מהמיקרו-מניפולטור במנוע.
   8. בורג שני ברגי 4-40 למחזיק הבדיקה. צרפו את מחזיק הבדיקה למניפולטור כפי שמוצג באיור 1C.
   9. הכינו בדיקה כפי שמודגם באיור 2A, הניחו אותה בתוך מחזיק הגשושית כשהחלק הכפוף פונה כלפי מטה והדקו את הברגים.
   10. מקם את המיקרו-מניפולטור על השולחן כך שקצה הגשוש יהיה מעל החרוז על הרציף. הצמד את המיקרו-מניפולטור לשולחן כדי למנוע תנועה מקרית במהלך הניסוי.
   11. מקם את המיקרוסקופ הצדדי על השולחן כך שהחרוז נמצא במרכז שדה הראייה שלו ובמיקוד.

2. הכנה לדוגמה ורכישת נתונים

1. קיבוע עיניים וחיתוך
   1. שמור על עכברים פראיים ובעלי חיים מסוג Magp1-null על רקע C57/BL6J זהה. המתת חסד לעכברים בני חודש או בן שנה משאיפת _CO2 .
   2. הסר את העיניים עם מלקחיים עדינים ולתקן את גלובוסים enucleated ב 4 °C (60 °F5000med לילה ב 4% paraformaldehyde / תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4). לשמור על לחץ חיובי של 15-20 מ"מ כספית בעין במהלך תהליך הקיבעון, ^{כמתואר6}.
      הערה: ניסויים נערכים על עכברים זכרים, כדי לשלוט על הבדלים אפשריים הקשורים למין בגודל של כדור העין. הלחץ החיובי מבטיח כי כדור הארץ נשאר מנופח, שמירה על הפער בין העדשה לבין הקיר של העין המשתרעת על ידי סיבים זונולריים.
   3. לשטוף את העיניים במשך 10 דקות PBS. באמצעות מספריים כירורגיים עיניים ועבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, לעשות חתך בעובי מלא בדופן העין ליד ראש עצב הראייה.
   4. להרחיב את החתך קדימה לקו המשווה, ולאחר מכן סביב היקף קו המשווה של העין. הקפד לחסוך את התהליכים ciliary עדין סיבים זונולריים הקשורים.
   5. הסר את החלק האחורי של הגלובוס, חשיפת המשטח האחורי של העדשה.
   6. השתמש במלקחיים כדי להסיר עין ניתחה מתמיסת החיץ והנח אותה על מגבון משימה יבשה כשהקרנית פונה כלפי מטה. גרור בעדינות את הקרנית מעל פני השטח של המגבון כדי לייבש אותו.
   7. הוסף 3 μL של דבק מיידי לבארות הפלטפורמה שיתאימו את העין בצלחת פטרי.
   8. מניחים את המנה על צלחת הבמה של סטריאומיקרוסקופ, כך הבאר עם הדבק הוא בתצוגה.
   9. מעבירים את העין מהנגב לקצה הבאר המכילה דבק. לאחר מכן, בזהירות לגרור את העין לתוך הבאר במהירות להתאים את הכיוון שלה, כך האחורי של העדשה הוא העליון ביותר.
   10. ייבשו את הצד החשוף של העדשה על ידי הכתמתה בעדינות בפינת המגבון היבש.
   11. החל טיפה של דבק מיידי לתחתית צלחת פטרי 50 מ"מ ומלט את הפלטפורמה אליו.
2. מדידה של תגובה ויסקולסטית זונורית
   1. הפעל את קנה המידה, הפעל את תוכנית רישום קנה המידה ואת תוכנת המצלמה. ודא שתוכנית הרישום יכולה לרכוש נתונים למשך 30 דקות, מכיוון שניסיונות מסוימים יכולים להימשך זמן רב כל כך.
   2. הפעל את בקר מנוע הסרוו והפעל את יישום הבקר במחשב. ודא שהבקר מוגדר לנוע במרווחים של 50 מיקרומטר באמצעות פרמטרי תנועה דומים לאלה המתוארים בהערה בשלב 1.2.2.
   3. צור עיקול של 90° במוט נימי כמתואר בשלב 1.1.1.
   4. החלק את הנימים המכופפים לתוך מחזיק הבדיקה הנימית והידק את הברגים המאבטחים.
      הערה: כדי למזער התייבשות מדגם, אנו ממליצים כי שלבים 1-4 יושלמו לפני, או במהלך, ניתוח עיניים.
   5. הוסף חרוז קטן (~ 1 מ"מ) של דבק לריפוי UV לקצה הנימים.
   6. באמצעות התאמות ידניות על המניפולטור, להזיז את קצה הבדיקה נימי, כך שהוא ישירות מעל מרכז העדשה. בדוק אם החלק התחתון של דבק UV מופיע ממורכז מעל החלק העליון של העדשה כאשר הוא נצפה מקדימה (על ידי בדיקה חזותית) ומהצד (דרך מצלמת המיקרוסקופ).
   7. תוך כדי התבוננות במצלמה, הורידו את קצה הגשוש עד שדבק ה-UV ייצור קשר עם העדשה ויכסה שליש עד מחצית מהמשטח העליון שלה.
   8. השתמש בעוצמה נמוכה (~ 1 mW), כיווני, כמעט גלוי UV (380-400 ננומטר) מקור אור כדי לרפא את הדבק.
      הערה: מפרטים אלה מספיקים כדי לרפא את הדבק תוך מספר שניות תוך מזעור הפוטנציאל לגרימת קישור צולב חלבונים. מקורות אור UV המסופקים עם עטי דבק UV מסחריים עומדים במפרטים אלה.
   9. מוסיפים פתרון PBS לצלחת עד שהעין מכוסה בנוזל לעומק של 2 מ"מ לפחות.
   10. מניחים את העדשה הגלילית מול מיקרוסקופ הבדיקה וקרוב ככל האפשר לצלחת פטרי מבלי לגעת בה.
   11. הפעל בו-זמנית את תוכנית הרישום ואת תוכנית שעון העצר. צלם תמונה של העין / בדיקה באמצעות המצלמה.
   12. לאחר 60 שניות, ליזום עוד 50 מיקרומטר תזוזה, ולאחר מכן כל 60 s עד הניסוי הושלם, כלומר, עד כל הסיבים נשברו. שים לב שהאות לא יחזור לרמות בסיסיות עקב אידוי מאגר במהלך הניסוי. תקן את הסחף הבא בקריאה במהלך ניתוח הנתונים, כפי שהודגם בשלב 2.2.14.
   13. עם השלמת ריצה, שמור את נתוני רישום קנה המידה וייצא אותם לתבנית התואמת לגיליון האלקטרוני, לדוגמה, תבנית .csv. שמור את תמונות העדשה שנאספו במהלך הריצה.
   14. יבא נתונים לגיליון אלקטרוני. השתמש בקריאה הראשונה והאחרונה בקנה מידה כדי לתמצת את הסחף בקריאה ברקע לאורך זמן עקב אידוי (ראו איור 3). הפחת את הקריאה המתובלת מהקריאה בכל נקודת זמן.
       הערה: אם אתה משתמש בגיליון אלקטרוני, ניתן לבצע את האינטרפולציה באופן אוטומטי על-ידי הזנת הנוסחה = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 בתא מימין לקריאת קנה המידה הראשון, ולאחר מכן הזזת הסמן לפינה הימנית-נמוכה יותר של התא וגרירתו כלפי מטה לערך הנתונים האחרון. הנוסחה מניחה שהנתונים מאורגנים בעמודה כאשר נקודת הנתונים הראשונה מופיעה בתא B2. אם תרצה, הנתונים המעובדים בשלב 2.2.14 עשויים להיות מנותחים עם מודל ויסקולסטי מעין אלסטי שפותח על ידי אחד המחברים השותפים, ד"ר מתיו ^ריילי4.

תוצאות

טכניקת המשיכה למעלה המתוארת כאן מספקת גישה פשוטה לקביעת תכונות ויסקולאסטיות של סיבים זונולריים בעכברים. בקצרה, עין העכבר נשמרת לראשונה על ידי הזרקת קבוע בלחץ תוך עיני פיזיולוגי. גישה זו שומרת על האינפלציה הטבעית של העין ושומרת על הסיבים כראוי מראש מתוחים (קיבעון נחשב מקובל לאחר ניסויים ר?...

Discussion

הזונולה היא מערכת ECM יוצאת דופן שבה סיבים מסודרים באופן סימטרי וניתן לתמרן אותם באופן זהה על ידי הזזת עדשת העין לאורך הציר האופטי. ניתן גם לגשת בקלות לחלל ללא הפרעה תאית, מה שמאפשר ללמוד את הסיבים בסביבה הקרובה למצבם הטבעי. טכניקת המשיכה למעלה מנצלת את מצגת ECM זו כדי לתפעל את הסיבים העדינים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon