구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 생물학적 제제 및 기계적 기술

요약

프로토콜은 세포외 매트릭스 점성 및 단백질 조성 또는 환경 요인에 대한 의존성 연구를 위한 방법을 설명합니다. 대상 매트릭스 시스템은 마우스 구역입니다. 이 방법의 성능은 야생식 구역 섬유의 점탄성 거동을 미세피브릴 관련 당단백질-1이 부족한 것과 비교하여 입증된다.

초록

탄력은 혈관, 근육 및 폐와 같은 조직의 기능에 필수적입니다. 이 성질은 세포와 조직을 함께 결합하는 단백질 메쉬워크인 세포외 매트릭스(ECM)에서 주로 유래된다. ECM 네트워크의 탄성 특성이 그 구성과 어떻게 관련이 있는지, 그리고 ECM의 이완 특성이 생리적 역할을 하는지 여부는 아직 완전히 해결되지 않은 질문입니다. 과제의 일부는 대부분의 ECM 시스템의 복잡한 아키텍처와 구조를 손상시키지 않으면서 ECM 구성 요소를 분리하는 데 어려움을 가지는 것입니다. 한 가지 예외는 척추 동물의 눈에서 발견되는 ECM 시스템인 조눌(zonule)입니다. 구역은 렌즈와 안벽 사이의 세포 없는 공간에 걸쳐 길이가 수백에서 수천 마이크로미터의 섬유를 포함한다. 이 보고서에서는 구역의 고도로 조직된 구조를 활용하여 점성탄성 특성을 정량화하고 개별 단백질 성분의 기여를 결정하는 기계 기술을 설명합니다. 이 방법은 렌즈와 구역을 노출하기 위해 고정 된 눈의 해부를 포함하고 장력을 모니터링하는 동안 구역 섬유를 동등하게 뻗어당기는 풀업 기술을 사용합니다. 이 기술은 상대적으로 저렴하지만 특정 구역 단백질이 부족하거나 노화가 있는 마우스의 구역 섬유의 점탄성 특성의 변화를 감지할 만큼 민감합니다. 여기에 제시된 방법은 주로 안구 발달 과 질병을 연구하기 위해 설계되었지만, 탄성 ECM의 점탄성 특성및 이온 농도, 온도 및 신호 분자와의 상호 작용과 같은 외부 요인의 역할에 관한 광범위한 질문을 탐구하기위한 실험 모델역할을 할 수 있습니다.

서문

척추 동물의 눈에는 망막¹에 이미지를 집중하는 데 도움이되는 살아있는 광학 렌즈가 포함되어 있습니다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 렌즈는 섬세하고 복사 지향적인 섬유 시스템에 의해 광축에 매달려 있습니다. 한쪽 끝에서 섬유는 렌즈 적도에 부착하고 다른 쪽은 주모 체의 표면에 부착합니다. 그들의 길이는 마우스에 있는 150 μm에서 인간에 있는 1 mm에 구역 수색하는 거리입니다. 전체적으로, 이 섬유는 Zinn2의 구역, 섬모 구역 또는 단순히 구역으로 알려져 있습니다. 안구 외상, 질병 및 특정 유전 질환은 구역 섬유3의 무결성에 영향을 미칠 수 ^{있으며, 이로} 인해 최종 실패와 시력 상실이 발생할 수 있습니다. 마우스에서 섬유는 피브릴린-¹⁴가 풍부한 맨틀에 둘러싸여 주로 단백질 피브릴린-2로 구성된 코어를 가지고 있다. 구역 섬유는 눈에 고유하지만 신체의 다른 곳에서 발견되는 엘라스틴 기반 ECM 섬유와 많은 유사점을 지니고 있습니다. 후자는 피브릴린-1 맨틀⁵로 덮여 있으며 구역 섬유⁶과 유사한 치수를 가지고 있습니다. 잠복 변환 성장 인자 β 결합 단백질 (LTBPs) 및 마이크로 피브릴 관련 당단백질-1 (MAGP-1)와 같은 다른 단백질은 두 가지 유형의 섬유7,8,9,10,11과 관련하여 발견됩니다. 구역 섬유의 탄성 계수는 엘라스틴 기반 섬유(0.3-1.2 MPa)¹⁷과 비교할 수 있는 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16의 범위에 있다. 이러한 건축 및 기계적 유사성은 구역 관련 단백질의 역할에 대한 통찰력이 다른 ECM 탄성 섬유에서 자신의 역할을 해명하는 데 도움이 될 수 있다고 믿게 합니다.

여기서 설명된 방법을 개발하는 주요 목적은 상속된 눈 질환의 진행에 특정 구역 단백질의 역할에 대한 통찰력을 얻는 것입니다. 일반적인 접근은 구역 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 표적으로 한 돌연변이를 운반하는 마우스의 그것과 야생 형 마우스에 있는 구역 섬유의 점성탄성 속성을 비교하는 것입니다. 이전에는 구역 섬유의 엘라스토-기계적 특성을 측정하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었지만, 모두 훨씬 더 큰 동물의 눈을 위해 설계되었습니다12,13,14,15,16. 이러한 모델은 유전적으로 유전적으로 유전적으로 견딜 수 없습니다. 우리는 마우스의 작고 섬세한 눈에 더 적합한 실험 방법을 개발하기 위해 노력했습니다.

마우스 구역 섬유의 점성을 평가하기 위해 개발한 방법은 도 1에서 시각적으로 요약되는 풀업 분석^4,18로 지칭하는 기술입니다. 풀업 방법과 결과의 분석에 대한 자세한 설명은 아래에 제공됩니다. 우리는 프로젝트에 사용되는 3차원 (3D) 인쇄 부품을 포함하여 장치의 건설을 설명하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 실험을 위해 눈을 얻고 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 구역 섬유의 점탄성 특성 판정을 위한 데이터를 얻는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 대표 결과 섹션에서는 MAGP-119가 부족한 마우스로부터 구역 섬유의 점탄성 특성과 연령일치 야생형 동물로부터 얻은 대조군 세트에 대해 이전에 공개되지 않은 데이터를 공유합니다. 마지막으로, 우리는 방법의 장점과 한계에 대한 일반적인 발언과 환경 및 생화학 적 요인이 ECM 섬유의 점탄성 특성에 미치는 영향을 설명 할 수있는 잠재적 인 실험에 대한 제안으로 결론을 내립니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 워싱턴 대학 동물 연구 위원회에 의해 승인되고 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 성명서를 준수했다.

1. 특수 부품 의 제조 및 장치의 건설

1. 특수 부품의 제조
   1. 프로브 제작. 도 2A의 왼쪽 패널에 도시된 바와 같이 유리 모세관을 비스듬히 잡습니다. 한쪽 끝에서 약 2cm 의 담배 라이터에서 불꽃을 놓고 그림 2A의 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 끝이 90 °까지 구부러질 때까지 거기에 보관하십시오.
   2. 샘플 플랫폼 제작. 3D 드로잉 소프트웨어를 사용하여 도 2B와 같이 30 x 30 x 5mm의 반구형 들여쓰기를 포함하는 플랫폼을 설계합니다.
   3. 프로브 홀더 제작. 3D 도면 소프트웨어를 사용하여 모세관 프로브를 보유하는 마운트를 설계하여 미세 조작기에 부착합니다( 그림 2C 참조).
      참고: STL 형식으로 플랫폼 제작 및 프로브 홀더 제작을 위한 샘플 3D 파일을 해당 작성자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
   4. 네거티브 렌즈 조립. 피규어 접시에 유체를 첨가하여 발생하는 왜곡을 보정하기 위해 도 1C 및 도 1D 에 도시된 바와 같이 음의 원통형 렌즈(-75mm 의 초점 길이 및 높이 및 길이약 50mm)를 배치하여 페트리 접시에 유체를 첨가하여 발생하는 왜곡을 교정합니다(유체 첨가는 측면에서 이미지화될 때 해부된 눈의 시야를 왜곡합니다).
   5. 음의 렌즈를 2슬롯베이스 중 하나에 접착합니다(베이스에 렌즈를 배치하기 위한 그림 2D 참조).
   6. 그림 2D와 같이 나머지 부품을 어셈블합니다.
   7. 포스트의 높이를 조정하여 렌즈가 겨우 스케일 위로 마우스를 가져가서 포스트 홀더의 나사를 조입니다.
2. 장치 건설
   1. 컴퓨터에 설치스케일, 현미경 카메라 소프트웨어 및 전동 마이크로미터 컨트롤러 응용 프로그램과 함께 제공되는 로깅 프로그램이 제공됩니다.
   2. 전동 마이크로미터를 서보 모터 컨트롤러와 후자를 컴퓨터에 연결합니다. 모터 컨트롤러 응용 프로그램을 시작하고 모터 설정을 편집합니다.
      참고: 아래에 나열된 모터 설정은 10-20s의 시간 척도에서 완화된 스트레스를 나타내는 예비 실험에 따라 선택되었습니다. 이러한 결정에 따라 모터가 릴렉스 타임보다 작은 시간에 50 μm 변위를 완료할 수 있지만 시료를 충격하지 않도록 너무 짧지 않은 속도와 가속을 선택했습니다. 여기에서 우리는 약 5-10 s의 변위 시간을 선택했습니다.
   3. 최대 속도를 0.01mm/s로 설정하고 가속을 0.005 mm/^s2로 설정합니다.
   4. 검사 현미경에 카메라를 설치하고 카메라 이미징 소프트웨어를 테스트합니다.
   5. 장치에 전념 벤치 공간에 규모를 배치합니다.
   6. 3D 프린팅 플랫폼(1.1.2단계부터 페트리 접시)에 접착제를 붙이고 우물 중 하나에 2-3mm 유리 구슬을 추가합니다. 페트리 접시를 축척으로 배치하여 비드가 팬 중앙 근처에 위치합니다.
   7. 마이크로 조작기에서 수동 마이크로미터를 전동 마이크로미터로 바꿉시다.
   8. 두 개의 4-40 나사를 프로브 홀더에 나사로 고정합니다. 도 1C에 표시된 대로 프로브 홀더를 조작기에 부착합니다.
   9. 도 2A에 도시된 바와 같이 프로브를 준비하고 구부러진 부분을 아래쪽으로 프로브 홀더 내부에 놓고 나사를 조입니다.
   10. 프로브의 끝이 플랫폼의 비드 위에 있도록 마이크로 조작기를 테이블에 배치합니다. 실험 중 우발적인 움직임을 방지하기 위해 미세 조작기를 테이블에 부착합니다.
   11. 비드가 시야의 중심에 있고 초점을 맞출 수 있도록 측면 현미경을 테이블에 배치합니다.

2. 샘플 준비 및 데이터 수집

1. 눈 고정 및 해부
   1. 동일한 C57/BL6J 배경에서 야생형 마우스와 Magp1-null 동물을 유지관리합니다. CO2 흡입에 의하여 1 개월 또는 1 세 마우스를 안락사시.
   2. 미세한 집게로 눈을 제거하고 4% 파라포름알데히드/인산염 완충식식염(PBS, pH 7.4)에서 하룻밤 사이에 4°C에서 에클레아드 글로브를 고정한다. 설명된 바와 같이 고정 과정에서 눈에 15-20 mmHg의 양압을 유지한다⁶.
      참고: 실험은 안구 지구의 크기에 있는 가능한 성 관련 다름을 통제하기 위하여, 남성 마우스에 실시됩니다. 양압은 전 세계가 팽창하여 렌즈와 눈벽 사이의 간격을 보존하여 구역 섬유에 의해 간 틈새를 유지합니다.
   3. PBS에서 10 분 동안 눈을 씻으시면 됩니다. 안과 외과 가위를 사용하고 스테레오 현미경으로 작업하면 시신경 헤드 근처의 눈 벽에 전체 두께 절개를합니다.
   4. 적도에 앞으로 절단을 확장 한 다음 눈의 적도 둘레 주위에. 섬세한 섬광 공정과 관련 구역 섬유를 절약하십시오.
   5. 렌즈의 후방 표면을 노출하여 지구 뒷면을 제거합니다.
   6. 집게를 사용하여 버퍼 용액에서 해부된 눈을 제거하고 각막이 아래로 향하도록 닦아 건조 작업 닦아 놓습니다. 각막을 닦은 표면 위로 부드럽게 드래그하여 건조시합니다.
   7. 페트리 접시의 눈을 수용할 수 있는 플랫폼 웰에 인스턴트 접착제 3μL을 추가합니다.
   8. 접착제와 잘 볼 수 있도록 스테레오 현미경의 무대 접시에 접시를 배치합니다.
   9. 접착제가 들어 있는 우물 의 가장자리로 닦아 눈을 옮기. 그런 다음 조심스럽게 눈을 우물로 드래그하고 렌즈 뒷면이 가장 위쪽이되도록 방향을 빠르게 조정합니다.
   10. 렌즈의 노출된 면을 마른 물티슈의 모서리로 부드럽게 블롯하여 건조시.
   11. 50mm 페트리 접시 의 바닥에 인스턴트 접착제의 dab을 적용하고 그것에 플랫폼을 시멘트.
2. 구역 점탄성 반응 측정
   1. 스케일을 켜고 스케일 로깅 프로그램 및 카메라 소프트웨어를 시작합니다. 일부 시험이 오래 지속될 수 있기 때문에 로깅 프로그램이 30분 동안 데이터를 수집할 수 있는지 확인합니다.
   2. 서보 모터 컨트롤러를 켜고 컴퓨터에서 컨트롤러 응용 프로그램을 시작합니다. 컨트롤러가 1.2.2 단계에서 NOTE에 설명된 것과 유사한 모션 매개 변수를 사용하여 50 μm 단위로 이동하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
   3. 1.1.1 단계에서 설명한 대로 모세관 막대에 90° 굽힘을 만듭니다.
   4. 구부러진 모세관을 모세관 프로브 홀더에 넣고 고정 나사를 조입니다.
      참고: 시료 탈수를 최소화하려면 눈 해부 전 또는 도중 1-4단계를 완료하는 것이 좋습니다.
   5. 모세관 끝에 UV 경화 접착제의 작은 (~ 1mm) 구슬을 추가합니다.
   6. 조작기의 수동 조정을 사용하여 모세관 프로브의 끝을 움직여 렌즈 중앙에 직접 있습니다. 전면(육안 검사)과 측면(현미경 카메라를 통해)에서 볼 때 UV 접착제의 바닥 부분이 렌즈 상단을 중심으로 나타나는지 확인합니다.
   7. 카메라를 들여다보는 동안 UV 접착제가 렌즈와 접촉하고 상부 표면의 3분의 1에서 1/절반을 커버할 때까지 프로브 팁을 낮춥춥다.
   8. 저강도(~1mW), 방향성, 가시형 UV(380-400 nm) 광원을 사용하여 접착제를 치료한다.
      참고: 이러한 사양은 단백질 교차 연결을 유도하는 가능성을 최소화하면서 몇 초 만에 접착제를 치료하는 것으로 충분합니다. 상업용 UV 접착제 펜과 함께 제공되는 UV 광원은 이러한 사양을 충족합니다.
   9. 눈이 적어도 2mm의 깊이에 액체에 의해 덮여 될 때까지 접시에 PBS 솔루션을 추가합니다.
   10. 원통형 렌즈를 검사 현미경 앞에 놓고 페트리 접시에 가능한 한 가깝게 만지지 않습니다.
   11. 동시에 로깅 프로그램과 타이머 프로그램을 시작합니다. 카메라를 사용하여 눈 /프로브의 사진을 찍습니다.
   12. 60s 후, 또 다른 50 μm 변위를 시작하고, 그 후 모든 섬유가 파손 될 때까지, 즉 실험이 완료 될 때까지 60 s마다 시작하십시오. 실험 중 버퍼 증발로 인해 신호가 기준선 수준으로 돌아오지 않습니다. 2.2.14 단계에서 예시된 대로 데이터 분석 중 판독값의 후속 드리프트를 수정합니다.
   13. 실행이 완료되면 스케일 로깅 데이터를 저장하고 스프레드시트(예: .csv 형식)와 호환되는 형식으로 내보냅니다. 실행 중에 수집 된 렌즈 사진을 저장합니다.
   14. 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다. 증발로 인해 시간이 지남에 따라 판독된 백그라운드에서 드리프트를 보간하려면 첫 번째 및 마지막 축척 판독값을 사용합니다( 그림 3 참조). 각 시점에서 판독값에서 보간 된 판독값을 뺍니다.
       참고: 스프레드시트를 사용하는 경우, 보간은 수식 = B2 - $B $2 + ($B $2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA (B:B))/(COUNTA(B:B)-2) * 셀의 A2를 첫 번째 스케일 판독의 오른쪽에 입력한 다음 커서를 마지막 데이터 로 이동하여 자동으로 수행 할 수 있습니다. 수식은 데이터가 셀 B2에 나타나는 첫 번째 데이터 포인트가 있는 열에서 구성된다고 가정합니다. 원하는 경우, 2.2.14 단계에서 처리된 데이터는 공동 저자 인 매튜 라일리⁴ 박사가 개발한 준 탄성 점탄성 모델로 분석될 수 있다.

결과

여기에 설명된 풀업 기술은 마우스에서 구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 간단한 접근법을 제공한다. 간단히 말해서, 마우스 눈은 먼저 생리 내혈압에 고정의 주입에 의해 보존된다. 이러한 접근법은 눈의 자연적인 인플레이션을 유지하고 섬유를 적절하게 미리 장력하게 유지합니다(예비 실험 후 고정이 섬유의 탄력이나 강도를 크게 변경하지 않았다는 것을 입증한 후에 허용된다고 간?...

토론

구역은 섬유가 대칭으로 배열되고 광학 축을 따라 눈 렌즈를 대체하여 동일하게 조작 할 수있는 특이한 ECM 시스템입니다. 공간은 또한 세포 중단 없이 쉽게 접근할 수 있고, 섬유는 그들의 네이티브 상태에 가까운 환경에서 공부될 수 있습니다. 풀업 기법은 이 ECM 프레젠테이션을 활용하여 유전적으로 방인하는 마우스의 섬세한 섬유를 조작하고 기계적 특성을 정확하게 정량화합니다. 이를 통해 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon