Preparación biológica y técnica mecánica para determinar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares

Resumen

El protocolo describe un método para el estudio de la viscoelasticidad de la matriz extracelular y su dependencia de la composición proteica o de factores ambientales. El sistema matricial objetivo es la zónula del ratón. El rendimiento del método se demuestra comparando el comportamiento viscoelástico de las fibras zonulares de tipo salvaje con las que carecen de glicoproteína-1 asociada a microfibrillas.

Resumen

La elasticidad es esencial para la función de tejidos como los vasos sanguíneos, los músculos y los pulmones. Esta propiedad se deriva principalmente de la matriz extracelular (ECM), la malla de proteínas que une células y tejidos. Cómo las propiedades elásticas de una red ecm se relacionan con su composición, y si las propiedades de relajación de la ECM juegan un papel fisiológico, son preguntas que aún no se han abordado por completo. Parte del desafío radica en la compleja arquitectura de la mayoría de los sistemas ECM y la dificultad para aislar los componentes ECM sin comprometer su estructura. Una excepción es la zónula, un sistema ecm que se encuentra en el ojo de los vertebrados. La zónula comprende fibras de cientos a miles de micrómetros de longitud que abarcan el espacio libre de células entre el cristalino y la pared del ojo. En este informe, describimos una técnica mecánica que aprovecha la estructura altamente organizada de la zónula para cuantificar sus propiedades viscoelásticas y determinar la contribución de los componentes proteicos individuales. El método consiste en la disección de un ojo fijo para exponer el cristalino y la zónula y emplea una técnica de pull-up que estira las fibras zonulares por igual mientras se controla su tensión. La técnica es relativamente barata pero lo suficientemente sensible como para detectar alteraciones en las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones que carecen de proteínas zonulares específicas o con el envejecimiento. Aunque el método presentado aquí está diseñado principalmente para estudiar el desarrollo ocular y la enfermedad, también podría servir como un modelo experimental para explorar preguntas más amplias sobre las propiedades viscoelásticas de las ECM elásticas y el papel de factores externos como la concentración iónica, la temperatura y las interacciones con las moléculas de señalización.

Introducción

El ojo de un vertebrado contiene una lente óptica viva que ayuda a enfocar las imágenes en la ^retina1. La lente está suspendida en el eje óptico por un sistema de delicadas fibras orientadas radialmente, como se ilustra en la Figura 1A. En un extremo, las fibras se adhieren al ecuador del cristalino y, en el otro, a la superficie del cuerpo ciliar. Sus longitudes abarcan distancias que van desde 150 μm en ratones hasta 1 mm en humanos. Colectivamente, estas fibras se conocen como la zónula de ^Zinn2, la zónula ciliar, o simplemente la zónula. El trauma ocular, la enfermedad y ciertos trastornos genéticos pueden afectar la integridad de las fibras zonulares3, lo que resulta en su eventual falla y la consiguiente pérdida de la visión. En ratones, las fibras tienen un núcleo compuesto principalmente por la proteína fibrilina-2, rodeada por un manto rico en fibrilina-14. Aunque las fibras zonulares son exclusivas del ojo, tienen muchas similitudes con las fibras ECM a base de elastina que se encuentran en otras partes del cuerpo. Estos últimos están cubiertos por un manto de fibrilina-15 y tienen dimensiones similares a las fibras zonulares6. Otras proteínas, como las proteínas de unión al factor de crecimiento β transformante latente (LTBP) y la glicoproteína-1 asociada a microfibrillas (MAGP-1), se encuentran en asociación con ambos tipos de fibras7,8,9,10,11. El módulo elástico de las fibras zonulares está en el rango de 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, comparable al de las fibras a base de elastina (0.3-1.2 MPa)¹⁷. Estas similitudes arquitectónicas y mecánicas nos llevan a creer que cualquier conocimiento de los roles de las proteínas asociadas a las zónulas puede ayudar a dilucidar sus roles en otras fibras elásticas de ECM.

El objetivo principal del desarrollo del método descrito aquí es obtener información sobre el papel de las proteínas zonulares específicas en la progresión de la enfermedad ocular hereditaria. El enfoque general es comparar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones de tipo salvaje con las de ratones portadores de mutaciones dirigidas en genes que codifican proteínas zonulares. Si bien anteriormente se han utilizado varios métodos para medir las propiedades elastomecánicas de las fibras zonulares, todos fueron diseñados para los ojos de animales mucho más grandes12,13,14,15,16. Como tales modelos no son genéticamente tratables; buscamos desarrollar un método experimental que se adaptara mejor a los ojos pequeños y delicados de los ratones.

El método que desarrollamos para evaluar la viscoelasticidad de las fibras zonulares de ratón es una técnica a la que nos referimos como el ensayo pull-up4,18, que se resume visualmente en la Figura 1. A continuación se proporciona una descripción detallada del método pull-up y el análisis de los resultados. Comenzamos describiendo la construcción del aparato, incluidas las piezas impresas en tres dimensiones (3D) utilizadas en el proyecto. A continuación, detallamos el protocolo utilizado para obtener y preparar los ojos para el experimento. Por último, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo obtener datos para la determinación de las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares. En la sección resultados representativos, compartimos datos no publicados obtenidos con nuestro método sobre las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares de ratones que carecen de ^MAGP-119, así como un conjunto de control obtenido de animales de tipo salvaje de la misma edad. Finalmente, concluimos con observaciones generales sobre las ventajas y limitaciones del método, y sugerencias para posibles experimentos que pueden dilucidar cómo los factores ambientales y bioquímicos afectan las propiedades viscoelásticas de las fibras ECM.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Estudios Animales de la Universidad de Washington y se adhirieron a la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Fabricación de piezas especializadas y construcción de aparatos

1. Fabricación de piezas especializadas
   1. Fabricación de sondas. Sostenga un capilar de vidrio en ángulo como se muestra en el panel izquierdo de la Figura 2A. Coloque una llama de un encendedor de cigarrillos a unos 2 cm de un extremo y manténgala allí hasta que el extremo se doble 90 °, como se muestra en el panel derecho de la Figura 2A.
   2. Fabricación de plataformas de muestra. Utilizando software de dibujo 3D, diseñe una plataforma que mida 30 x 30 x 5 mm y que contenga hedentaciones hemisféricas de 2.0, 2.5 y 3.0 mm de diámetro, como se muestra en la Figura 2B.
   3. Fabricación del soporte de la sonda. Utilizando el software de dibujo 3D, diseñe un soporte que sostenga la sonda capilar y conéctelo a un micromanipulador (consulte la Figura 2C).
      NOTA: Un archivo 3D de muestra para la fabricación de plataformas y la fabricación de soportes de sonda en formato STL está disponible a petición del autor correspondiente.
   4. Montaje negativo de la lente. Coloque una lente cilíndrica negativa (-75 mm en distancia focal y aproximadamente 50 mm en altura y longitud) como se muestra en la Figura 1C y la Figura 1D para corregir la distorsión causada por la adición de líquido a la placa de Petri (la adición de líquido distorsiona la vista del ojo diseccionado cuando se toma una imagen desde un lado).
   5. Pegue la lente negativa a una de las bases de 2 ranuras (consulte la Figura 2D para el posicionamiento de la lente en la base).
   6. Ensamble las piezas restantes como se muestra en la Figura 2D.
   7. Ajuste la altura del poste para que la lente apenas se cierne sobre la báscula y apriete el tornillo en el soporte del poste.
2. Construcción de aparatos
   1. Instale en una computadora el programa de registro suministrado con la báscula, el software de la cámara del microscopio y la aplicación del controlador de micrómetro motorizado.
   2. Conecte el micrómetro motorizado al controlador del servomotor y este último a la computadora. Inicie la aplicación del controlador del motor y edite la configuración del motor.
      NOTA: Los ajustes del motor, que se enumeran a continuación, se eligieron después de experimentos preliminares que revelaron que las tensiones se relajaron en una escala de tiempo de 10-20 s. En base a esta determinación, seleccionamos una velocidad y aceleración que permitiera al motor completar un desplazamiento de 50 μm en un tiempo menor que el tiempo de relajación, pero no demasiado corto para evitar sacudir la muestra. Aquí elegimos un tiempo de desplazamiento de unos 5-10 s.
   3. Establezca la velocidad máxima en 0,01 mm/s y la aceleración en 0,005 mm/^s2.
   4. Instale la cámara en el microscopio de inspección y pruebe el software de imágenes de la cámara.
   5. Coloque la báscula en el espacio del banco dedicado al aparato.
   6. Pegue una plataforma impresa en 3D (del paso 1.1.2) a una placa de Petri y agregue una cuenta de vidrio de 2-3 mm a uno de los pozos. Coloque la placa de Petri en la báscula para que la cuenta se encuentre cerca del centro de la sartén.
   7. Reemplace el micrómetro manual del micromanipulador por el motorizado.
   8. Atornille los dos tornillos 4-40 en el soporte de la sonda. Conecte el soporte de la sonda al manipulador como se muestra en la Figura 1C.
   9. Prepare una sonda como se ilustra en la Figura 2A, colóquela dentro del soporte de la sonda con la parte doblada hacia abajo y apriete los tornillos.
   10. Coloque el micromanipulador sobre la mesa de modo que la punta de la sonda esté sobre la cuenta en la plataforma. Coloque el micromanipulador en la mesa para evitar movimientos accidentales durante el experimento.
   11. Coloque el microscopio lateral sobre la mesa de modo que la cuenta esté en el centro de su campo de visión y enfocada.

2. Preparación de muestras y adquisición de datos

1. Fijación y disección ocular
   1. Mantenga ratones de tipo salvaje y animales nulos Magp1 en un fondo C57 / BL6J idéntico. Sacrificar ratones de 1 mes o 1 año de edad por inhalación de _CO2 .
   2. Retire los ojos con fórceps finos y fije los globos enucleados a 4 °C durante la noche en solución salina tamponada con paraformaldehído/fosfato al 4% (PBS, pH 7.4). Mantener una presión positiva de 15-20 mmHg en el ojo durante el proceso de fijación, como se ^describe6.
      NOTA: Los experimentos se llevan a cabo en ratones machos, para controlar las posibles diferencias relacionadas con el sexo en el tamaño del globo ocular. La presión positiva asegura que el globo permanezca inflado, preservando el espacio entre la lente y la pared del ojo atravesada por las fibras zonulares.
   3. Lavar los ojos durante 10 min en PBS. Usando tijeras quirúrgicas oftálmicas y trabajando bajo un estereomicroscopio, haga una incisión de espesor completo en la pared del ojo cerca de la cabeza del nervio óptico.
   4. Extienda el corte hacia adelante hasta el ecuador y luego alrededor de la circunferencia ecuatorial del ojo. Tenga cuidado de evitar los delicados procesos ciliares y las fibras zonulares asociadas.
   5. Retire la parte posterior del globo terráqueo, exponiendo la superficie posterior de la lente.
   6. Use los fórceps para extraer un ojo disecado de la solución tampón y colóquelo en una toallita seca con la córnea hacia abajo. Arrastre suavemente la córnea sobre la superficie de la toallita para secarla.
   7. Agregue 3 μL de pegamento instantáneo a los pocillos de la plataforma que acomodarán el ojo en la placa de Petri.
   8. Coloque el plato en la placa del escenario del estereomicroscopio para que el pozo con el pegamento esté a la vista.
   9. Transfiera el ojo de la toallita al borde del pozo que contiene pegamento. Luego, arrastre cuidadosamente el ojo hacia el pozo y ajuste rápidamente su orientación para que la parte posterior de la lente esté más arriba.
   10. Seque el lado expuesto de la lente secándola suavemente con la esquina de una toallita seca.
   11. Aplique un poco de pegamento instantáneo en la parte inferior de una placa de Petri de 50 mm y cemente la plataforma.
2. Medición de la respuesta viscoelástica zonular
   1. Encienda la báscula, inicie el programa de registro de incrustaciones y el software de la cámara. Asegúrese de que el programa de registro pueda adquirir datos durante 30 minutos, ya que algunos ensayos pueden durar tanto tiempo.
   2. Encienda el controlador del servomotor e inicie la aplicación del controlador en la computadora. Asegúrese de que el controlador esté configurado para moverse en incrementos de 50 μm utilizando parámetros de movimiento similares a los descritos en la NOTA en el paso 1.2.2.
   3. Cree una curvatura de 90° en una varilla capilar como se describe en el paso 1.1.1.
   4. Deslice el capilar doblado en el soporte de la sonda capilar y apriete los tornillos de sujeción.
      NOTA: Para minimizar la deshidratación de la muestra, recomendamos que los pasos 1-4 se completen antes o durante la disección ocular.
   5. Agregue una pequeña cuenta (~ 1 mm) de pegamento de curado UV a la punta del capilar.
   6. Usando los ajustes manuales en el manipulador, mueva la punta de la sonda capilar para que esté directamente sobre el centro de la lente. Compruebe si la parte inferior del pegamento UV aparece centrada sobre la parte superior de la lente cuando se ve desde el frente (mediante inspección visual) y el lateral (a través de la cámara del microscopio).
   7. Mientras mira a través de la cámara, baje la punta de la sonda hasta que el pegamento UV haga contacto con la lente y cubra de un tercio a la mitad de su superficie superior.
   8. Use una fuente de luz UV (380-400 nm) de baja intensidad (~ 1 mW), direccional y casi visible para curar el pegamento.
      NOTA: Estas especificaciones son suficientes para curar el pegamento en unos pocos segundos al tiempo que minimizan el potencial de inducir la reticulación de proteínas. Las fuentes de luz UV suministradas con plumas de pegamento UV comerciales cumplen con estas especificaciones.
   9. Agregue la solución de PBS al plato hasta que el ojo esté cubierto por líquido a una profundidad de al menos 2 mm.
   10. Coloque la lente cilíndrica frente al microscopio de inspección y lo más cerca posible de la placa de Petri sin tocarla.
   11. Inicie simultáneamente el programa de registro y un programa de temporizador. Tome una foto del ojo/sonda con la cámara.
   12. Después de 60 s, inicie otro desplazamiento de 50 μm, y a partir de entonces cada 60 s hasta que se complete el experimento, es decir, hasta que se hayan roto todas las fibras. Tenga en cuenta que la señal no volverá a los niveles basales debido a la evaporación del búfer durante el experimento. Corrija la deriva resultante en las lecturas durante el análisis de datos, como se ejemplifica en el paso 2.2.14.
   13. Al finalizar una ejecución, guarde los datos de registro de escala y expórtelos a un formato compatible con la hoja de cálculo, por ejemplo, un formato de .csv. Guarde las imágenes de la lente que se recopilaron durante la carrera.
   14. Importar datos a una hoja de cálculo. Utilice la primera y la última lectura de escala para interpolar la deriva en la lectura de fondo a lo largo del tiempo debido a la evaporación (ver Figura 3). Reste la lectura interpolada de la lectura en cada punto de tiempo.
       NOTA: Si se utiliza una hoja de cálculo, la interpolación se puede realizar automáticamente introduciendo la fórmula = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 en la celda a la derecha de la primera lectura de escala, luego moviendo el cursor a la esquina inferior derecha de la celda y arrastrándolo hacia abajo hasta el último valor de datos. La fórmula supone que los datos están organizados en una columna con el primer punto de datos que aparece en la celda B2. Si se desea, los datos procesados en el paso 2.2.14 pueden analizarse con el modelo viscoelástico cuasi elástico desarrollado por uno de los coautores, el Dr. Matthew ^Riley4.

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Resultados

La técnica pull-up descrita aquí proporciona un enfoque sencillo para determinar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones. En resumen, el ojo de ratón se conserva primero mediante la inyección de un fijador a presión intraocular fisiológica. Este enfoque mantiene la inflación natural del ojo y mantiene las fibras adecuadamente pretensadas (la fijación se consideró aceptable después de que los experimentos preliminares demostraron que no alteraba significativamente la elasticidad o la r...

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Discusión

La zónula es un sistema ECM inusual donde las fibras están dispuestas simétricamente y pueden manipularse de manera idéntica desplazando la lente del ojo a lo largo del eje óptico. También se puede acceder fácilmente al espacio sin interrupción celular, lo que permite estudiar las fibras en un entorno cercano a su estado nativo. La técnica pull-up aprovecha esta presentación ECM para manipular las delicadas fibras de ratones, un sistema genéticamente tratable, y cuantificar con precisión sus propiedades mecá...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon