膀胱癌类器官作为精准医疗工具的文化

摘要

患者来源的类器官（PDO）是转化癌症研究的有力工具，反映了疾病的遗传和表型异质性以及对个性化抗癌治疗的反应。在这里，详细描述了生成人类原发性膀胱癌PDO的合并方案，以准备评估表型分析和药物反应。

摘要

目前的 体外 治疗测试平台缺乏与肿瘤病理生理学的相关性，通常采用在组织培养塑料上建立为二维（2D）培养物的癌细胞系。迫切需要更具代表性的肿瘤复杂性模型，以准确预测治疗反应和敏感性。开发来自新鲜肿瘤组织的患者源性类器官（PDO）的三维（3D） 离体 培养，旨在解决这些缺点。类器官培养可与常规临床管理并行用作肿瘤替代物，通过确定潜在的有效干预措施并指出可能徒劳的治疗来为治疗决策提供信息。在这里，该程序旨在描述从新鲜，可行的临床组织中建立膀胱癌PDO的策略和详细的分步方案。我们完善的优化方案对于使用直接来自患者或患者来源的异种移植物（PDX）肿瘤材料的有限和多样化的起始材料为实验建立3D培养是实用的。该程序也可以被大多数配备标准组织培养设备的实验室采用。使用该协议生成的类器官可以用作 离体 替代物，以了解支撑泌尿系统癌症病理学的分子机制，并评估治疗以告知临床管理。

引言

膀胱癌是全球最普遍的尿路癌，也是人类第十大常见恶性肿瘤¹.它包括遗传多样化和表型复杂的疾病^谱2。尿路上皮非肌肉浸润型膀胱癌（NMIBC）是最常见的膀胱癌诊断（70%-80%），这些癌症显示出相当大的生物学异质性和可变的临床结果^2，3，4。NMIBC 患者通常具有较高的疾病复发风险 （50-70%），三分之一的癌症会进展并发展成更具侵袭性的肌肉浸润性膀胱癌 （MIBC）²。虽然 NMIBC 的 5 年生存率很高 （>90%），但这些患者必须接受长期临床管理⁵.另一方面，局部晚期（不可切除）或转移性MIBC通常被认为是无法治愈的⁶。因此，膀胱癌是癌症护理中终身治疗成本最高的癌症之一，对个人和医疗保健系统来说都是一个巨大的负担^3，7。晚期疾病中的潜在遗传畸变使膀胱癌的治疗管理成为一项临床挑战，并且自从批准用于晚期和高风险NMIBC^8，9的免疫疗法以来，侵袭性尿路上皮肿瘤的治疗选择最近才有所改善。目前，临床决策一直以传统的临床和组织病理学特征为指导，尽管单个膀胱癌肿瘤在疾病侵袭性和对治疗的反应方面表现出很大差异¹⁰。迫切需要加快对临床有用模型的研究，以改善个体患者预后的预测和有效治疗方法的确定。

三维（3D）类器官显示出作为肿瘤模型的巨大潜力，因为它们能够自组织和概括原始肿瘤的内 在体内 结构和药物基因组学特征，以及它们能够反映原始组织的天然细胞功能，它们从中衍生出来^11，12，13.尽管已建立的膀胱癌细胞系很容易获得，相对具有成本效益，可扩展且易于操作， 但体外 细胞系在很大程度上无法模仿在临床膀胱癌中观察到的各种遗传和表观遗传改变的谱谱^12，14 并且都是在2D，贴壁培养条件下建立和维持的。此外，来自原发性和转移性膀胱肿瘤的细胞系与原始肿瘤物质具有显着的遗传差异。 ^8，15.

另一种方法是使用基因工程和致癌物诱导的小鼠模型。然而，虽然这些模型概括了一些参与人类肿瘤的天然致癌级联反应（在参考文献^16，17，18中回顾），但它们缺乏肿瘤异质性，价格昂贵，侵袭性和转移性膀胱癌的代表性较差，并且不适用于快速足月药物检测，因为肿瘤可能需要数月才能发展^14，19.患者衍生的癌症模型（包括类器官、有条件重编程的原代细胞培养物和异种移植物）为在临床治疗前了解药物治疗的效果提供了宝贵的机会²⁰.尽管如此，由于对新鲜原代患者组织的获取有限以及可重复地生成患者源性类器官（PDO）培养条件所需的广泛优化，很少有组常规使用这些患者 - 近端模型。在 体内 环境中，致癌细胞可以与周围成分的各种组合物相互作用和通信，包括基质细胞，浸润免疫细胞和基质¹²。同样，对于以3D格式生长的PDO，可以自定义细胞/基质复杂性以包括其他相关组件。PDO可以快速生成，并且通常能够广泛传代或冷冻保存以供以后使用，尽管其使用寿命有限^{为21，22，23}。药效学（即对药物的反应）可以使用多次读数来评估，包括类器官活力和形态学，以及免疫组织化学靶标或转录变化的表征。

这里，描述了从膀胱肿瘤经尿道切除术（TURBT）或手术切除膀胱（根治性膀胱切除术）收集的患者材料中建立膀胱癌类器官的程序。图示了使用现成的湿实验室材料和工具生成PDO的方法。终点包括细胞形态特征和活力的变化。这些是使用荧光显微镜， 体外 活力（代谢和细胞膜完整性）测定和组织病理学分析测量的。 图1 显示了从择期手术期间获得的临床材料建立人类膀胱癌PDO的工作流程。

研究方案

患者在澳大利亚布里斯班亚历山德拉公主医院的泌尿科团队下入院后同意了这项研究。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则以及在伦理和体制准则（伦理学编号HREC/05/QPAH/95，QUT 1000001165）进行的。

注意:作为资格标准，患者年龄≥18岁，患有癌症，并且能够理解并提供同意。那些无法给予知情同意的人被排除在外。那些主要语文不是英语的人被排除在外，因为出于后勤和预算方面的考虑，不可能提供口译员。同样被排除的还有肿瘤无法通过活检或常规病理学后不太可能获得足够量的患者。

1. 类器官培养基制备

注意:人膀胱癌类器官培养基需要生长因子，以帮助从解离的临床材料中提取的类器官的存活，生长和持续扩张（表1）。有关本程序中使用的每种补充剂的完整详细信息，请参阅 材料表。

1. 在冰上或在2-8°C的冰箱中解冻冷冻的成分。 避免重复的冷冻/解冻循环，并使用冷冻等分试样（储存在-20°C）中工作。
2. 基础培养基:通过补充先进的Dulbecco的改良鹰培养基/火腿的F-12（adDMEM / F12）与HEPES（10 mM）和谷氨酰胺（2 mM）来制备基础培养基。这也被用作运输介质，并在类器官洗涤步骤中。
   注意:高级DMEM / F-12用作基础培养基，以帮助在有限血清存在下类器官的扩张;然而，它需要补充HEPES和L-谷氨酰胺。
3. 在打开前短暂离心成纤维细胞生长因子10（FGF-10），成纤维细胞生长因子2（FGF-2），上皮生长因子（EGF），SB202190，前列腺素E2（PGE2）和A 83-01，以确保组分位于小瓶底部。
4. 完全类器官培养基:用终浓度为5%v / v，人EGF（50ng / mL），人FGF-2（5ng / mL），人FGF-10（20ng / mL），人FGF-10（20 ng / mL），A 83-01（500 nM），SB202190（10μM），B27（1x），烟酰胺（10mM），N-乙酰半胱氨酸（1.25mM），Y-27632（10μM），PGE2（1μM）和制造商指示的浓度的广谱抗生素形成补充基础培养基。
5. 在黑暗中将类器官培养基储存在4°C，并在2周内（最多1个月）使用。不要冷冻。避免长时间暴露在光源下。
   注意:类器官培养基是无血清制备的;然而，血清和青霉素/链霉素可以根据需要在用户对用户的基础上进行补充。

2. 3中概述的程序前一天

1. 解冻生长因子降低基底膜（BME;见 材料表）过夜至少12小时，然后在4°C冰箱或冷藏室中使用。如果需要，将 BME 分配到 1.5 mL 聚丙烯一次性试管中，放入 1 mL 等分试样中，以避免冻融循环。
2. 将过滤的移液器吸头放入4°C冰箱或冷藏室中。
   注意:本节涉及在处理BME时将使用的移液器吸头，以防止过早聚合并减少BME在吸头表面的涂层。
3. 对手术所需的所有手术设备进行消毒。

3. 膀胱肿瘤类器官的产生

注意:这是从原发性患者肿瘤建立PDO的第一步。该程序适用于Gao等人^建立的方法的膀胱癌组织。

1. 使用II类生物危害罩来制备标本。检索干冰和湿冰并打印 患者标本处理表 （补充文件）。
2. 当手术切除接近完成时，将研究人员叫到手术室。
   注意:确认患者符合资格标准并已签署参与者同意书。仅当超出临床组织病理学评估要求时，才提供组织用于研究。
3. 从手术中收集新鲜的宏观上可行的肿瘤标本。确保在运输过程中将样品浸没在运输介质（1x adDMEM/ F12或1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS））中，放入无菌的50 mL锥形管或尿液样本罐中。
   注意:在一些临床中心，组织可能需要运送到病理学实验室进行分配以进行研究。在这些情况下，建议在运输培养基中添加抗生素和抗真菌药。组织可以在手术后以4°C在基础培养基中储存长达24小时，并且仍然产生可行的类器官培养物。
4. 在 患者标本处理表 （补充文件）上记录样本详细信息，包括组织重量（g或mg），样本描述以及有关任何血液和尿液样本的详细信息。
5. 小心地取出运输培养基，并用10 mL基础培养基代替。让肿瘤组织通过重力沉降。
   注意:运输介质被视为临床废物，必须收集在适当数量的去污溶液中适当标记的废物容器中。一旦液体经过化学净化，就可以根据危险废物的制度准则进行处置。
6. 用镊子取出肿瘤组织并将其置于无菌的90mm培养皿中（图2A）。在临床标本处理片和解剖网格上记录组织的重量（以mg或g为单位）（图2B）。
7. 使用无菌镊子和安装在手术刀手柄上的一次性手术刀刀片去除非癌组织（包括脂肪组织）和宏观可见的坏死区域（图2C）。用冷的1x DPBS清洗肿瘤块1-2次。收集肿瘤碎片并将其转移到新的无菌90mm培养皿中。
   注意:由于手术刀刀片锋利，因此在手动切片时要小心。肿瘤邻近的脂肪组织可以通过紧邻可见肿瘤周边的明显柔软，凝胶状，苍白的区域来识别。在剖除膀胱切除肿瘤活检时，宏观脂肪组织和代表坏死区域的局灶性黑暗区域需要个人判断。
8. 拍摄照片，绘制组织图，并在临床处理网格上计划组织解剖（图2B 和 图2C）。
   注意:重要的是要保留每个特定病例的单个宏观肿瘤特征和解剖的视觉记录和粗略草图。
9. 解剖肿瘤组织切片并分配用于组织病理学（图2D）和分子分析（图2E）。
   1. 用于组织学分析:将约50mg肿瘤组织放入标记的一次性塑料组织学盒中（图2D）。将组织学盒浸入具有5x至10x体积的10%中性缓冲福尔马林（NBF）的容器中。在室温下孵育过夜。
   2. 除去10%NBF，第二天用70%（w / w）乙醇储存在4°C下，直到可以使用常规组织处理方案处理组织
   3. 用于分子分析:使用液氮在RNase / DNase-free 1.5 mL冷冻管中快速冷冻至少一个^{1-3mm 3} 的肿瘤片段，并储存在-80°C（图2E）。
10. 将5mL类器官培养基（表1）分配在含有剩余肿瘤块的90mm培养皿中。
11. 用无菌的#10手术刀刀片尽可能精细地切碎组织（0.5-1 mm³ 件或更小）。
    注意:较大的碎片或整块组织（>3 mm³）将需要相当长的时间来消化，并且会降低标本的活力。如果组织分解并且片段足够小，可以用5 mL血清学移液器吸头移液，则省略上述步骤。
12. 将切碎的组织转移到 50 mL 锥形管中，加入 4 mL 类器官培养基、1 mL 10x 胶原酶/透明质酸酶和 0.1 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 1（DNase 1），以避免细胞结块。
    注意:每次都应新鲜制备酶溶液。增加培养基的体积，使其约为大样本肿瘤片段可见量的10倍。
13. 将切碎的肿瘤组织和酶溶液在培养箱（37°C，5%CO 2）中的轨道振荡器或旋转器（150rpm）上孵育_1-2小时，以解离片段成细胞悬浮液并分解胶原蛋白。这可以通过组织学分析进行检查（图3A）。
    注意:如果组织量大或在1-1.5小时后观察到明显的解离，则增加孵育时间，每30分钟检查一次解离水平。此步骤的时间取决于样本，每次都必须根据经验确定。具有肉眼无法辨别的组织片段（或极少数片段）的明显更清晰的溶液表明消化成功。
14. 通过向样品中加入2倍体积（20 mL）的基础培养基来终止消解。
15. 在室温（RT）下以261× g 离心样品5分钟，吸出物，并丢弃上清液。
16. 为了裂解污染的红细胞（RBC），将上述步骤获得的沉淀重悬于5mL氯化铵钾（ACK）缓冲液中。将试管在室温下孵育3分钟或直到看到红细胞的完全裂解（悬浮液变得清晰）。
    注意:如果未观察到红细胞在颗粒中呈小红色团块，则可省略此步骤。
17. 将20mL基础培养基加入管中。在室温下以261× g 离心管5分钟并吸出上清液。
18. 在此步骤中，将10mL等分试样2x和1x类器官培养基置于37°C水浴中以加热。
19. 通过预湿式可逆 100 μm 过滤器将样品过滤到新的 50 mL 管中，以除去大的不溶性材料。
    注意:过滤器收集的大型未消化材料（>100μm）可能含有感兴趣的细胞，并且可以在类器官培养基中的90mm培养皿或6孔细胞培养板中培养以获得2D培养物（图1（步骤5）和图3B）。
20. 通过预湿可逆37μm过滤器过滤洗脱液，以收集单细胞和小簇，用于单细胞和免疫细胞分离（管37-1;图1（步骤6）和图3B）。
    注意:通过再次通过过滤的细胞悬浮液再次通过过滤器，可以增加该步骤中肿瘤细胞的产量。
21. 反转37μm过滤器并使用10mL基础培养基收集小而中等大小的簇（37-100μm）（管70-1;图 3B）。
22. 将新的 50 mL 试管（ 试管 70-1 和 37-1）中的每支用 DPBS 加满至 40 mL。在室温下以261× g 离心悬浮液5分钟，抽吸并丢弃上清液。
23. 向 37-1 试管中加入10 mL基础培养基，并使用台盼蓝排除染料和自动细胞计数器（根据制造商的规格）对细胞进行计数。确定细胞的细胞数量和活力。
24. 在室温下以261× g 离心样品的其余部分5分钟，吸出培养基并用含有10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素和10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞冷冻溶液或基础培养基代替。
25. 将样品放入1.5 mL冷冻管中，并将其储存在细胞冷冻容器中。立即将容器转移到-80°C冰箱中，以获得最佳冷却速度。在-80°C下冷冻过夜后，将冷冻管转移到低温液相或气相储存（-196°C）中进行长期储存。
26. 用500μL预热的2x类器官培养基重悬于管 70-1 中的细胞。
    注意:播种密度必须高才能成功繁殖类器官。类器官培养基的体积以及随后的BME应根据从过滤步骤中分离的细胞数量进行经验性改变。此步骤提供了基于我们实验室研究的相关起点。
27. 用冰冷的P1000无菌过滤移液器吸头将BME添加到细胞中（与2x类器官培养基的比例为1:1），并轻轻混合以悬浮细胞。快速小心地将100μL重组细胞/ BME混合物移液到超低附着平底96孔板的孔中。将96孔板置于培养箱（37°C，5%CO₂）中20-30分钟以固化。
28. 根据经验评估的体积，在BME细胞悬浮液上添加1:2比例的1x类器官培养基。在相关起点中，在100μL重组细胞/ BME混合物之上加入50μL1x类器官培养基。
29. 将96孔板置于培养箱（37°C，5%CO₂）中20分钟以平衡。
30. 将细胞培养板从培养箱中取出，并将其组装在显微镜载物台上的标本架上。在相差或明场设置下直观地评估类器官。
    注意:图像最好通过配备差分干涉（DIC）光学元件，数码相机和相关软件的倒置相差显微镜采集，以观察球形PDO的形成，为终点分析做准备。
    1. 如果可见不同的簇，将细胞培养板放入台上电子加热的显微镜室（37°C，5%CO₂）中，以便在前24-72小时内进行活细胞成像。
    2. 确保将柔性加热环连接到镜头上以减少热漂移，并且加湿器充满dH₂O。
    3. 使用4倍或10倍物镜（N.A. 0.30，宽15.2 mm）进行初始成像。在相差设置上每5-10分钟延时。
    4. 检查成功分离，其特征在于在24-72小时后每孔出现>10个自组织类器官。
    5. 如果类器官数量低，允许培养持续长达两周（图3C）。
31. 每2-3天使用50μL预热的类器官培养基补充培养基，以补充耗尽的生长因子和总体积。
32. 在第 1、2 和 3 天（延时系列）以及传代前的第 5、7 和 10 天（如果适用）采集图像（如步骤 3.30 中所述）。
    注意:类器官（通常观察到圆形结构，您看不到单个细胞的边缘）通常在设置后7-10天传代，具体取决于分离的成功。在传代之前或之后，类器官可以用细胞毒性或治疗剂治疗长达6天，并使用细胞活力和细胞毒性测定法测量药物反应。或者，可以从BME（使用1mg / mL分散酶）和冷冻保存（生物储备）中检索类器官，用于分子测试，或包埋和组织学评估（图4）。

结果

从人膀胱癌患者TURBT和膀胱切除组织中成功建立了3D类器官。简而言之，该技术突出了3D多细胞结构的快速形成，这些结构既可行又适用于其他终点分析，例如组织学评估，分子表征（通过免疫组织化学或定量实时PCR）和药物筛选。在手术过程中（图1），可以利用我们过滤阶段的各种洗脱物（图1，步骤1-6）来冷冻?...

讨论

虽然从膀胱癌组织衍生的3D类器官方案仍处于起步阶段，但它们是积极研究和临床研究的一个领域。在这里，详细介绍了成功建立适用于NMIBC和MIBC标本的膀胱癌PDO的优化方案。该工作流程与基于医院的临床试验并行集成，并考虑生物样本库样本累积，包括组织学样本处理和新鲜冷冻组织库，这是临床类器官管道的重要考虑因素。该协议建立在现有方法的基础上，并提供了一种整合的方法，以构建?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL cryogenic vial	Corning	430487
1.5 mL Eppendorf tubes	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	polypropylene single-use tube
100 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27270
100 mm Petri dish	Corning	430167
10x Collagenase/ Hyaluronidase	STEMCELL Technologies	#07912
37 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tube	Corning	CLS430829-500EA
6-well plate	Corning	CLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)	Sigma-Aldrich	CLS3474-24EA
A 83-01	BioScientific	2939	Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis buffer	STEMCELL Technologies	#07850
adDMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Base medium
Animal-free recombinant EGF	Sigma-Aldrich	518179	Growth factor
Automated cell counter (TC20)	Bio-rad	1450102
B27 additive	Gibco	17504044	Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450015
Centrifuge	Eppendorf	EP022628188
Computer system
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	#07930	Cell freezing solution
Dispase II, powder	Thermofisher	17105041	To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1	STEMCELL Technologies	#07900
DPBS	Thermofisher	14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)	Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128	Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)	Invitrogen	35050061	Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPES	Gibco	15630-080	All-purpose buffer
Histology cassette	ProSciTech	RCH44-W
Human FGF-10	Peprotech	100-26-25	Growth factor
Human FGF-2	Peprotech	100-18B-50	Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)	In Vitro Technologies	356231	Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing container	ThermoFisher	5100-0001	cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma	A7250	Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	SIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscope	Nikon	MFA510BB
NIS-Elements Advanced Research	Nikon	MQS31000
Noggin conditioned media	In-house		BMP inhibitor
Pipetboy acu 2	Integra	155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
Primocin	Jomar Bioscience	ant-pm2	Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	support proliferation of cells
Rotary tube mixer	Ratek	RSM7DC
R-spondin 1 conditioned media	In-house		WNT signalling regulator
SB202190	Jomar Bioscience	s1077-25mg	Selective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handle	Livingstone	WBLDHDL03
Scalpels, #11 blade	Medical and Surgical Requisites	EU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste Bags	Medical Search	SU09125X16
Urine specimen jar
Y27632	Jomar Bioscience	s1049-10mg	Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells