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Method Article
* 这些作者具有相同的贡献
患者来源的类器官(PDO)是转化癌症研究的有力工具,反映了疾病的遗传和表型异质性以及对个性化抗癌治疗的反应。在这里,详细描述了生成人类原发性膀胱癌PDO的合并方案,以准备评估表型分析和药物反应。
目前的 体外 治疗测试平台缺乏与肿瘤病理生理学的相关性,通常采用在组织培养塑料上建立为二维(2D)培养物的癌细胞系。迫切需要更具代表性的肿瘤复杂性模型,以准确预测治疗反应和敏感性。开发来自新鲜肿瘤组织的患者源性类器官(PDO)的三维(3D) 离体 培养,旨在解决这些缺点。类器官培养可与常规临床管理并行用作肿瘤替代物,通过确定潜在的有效干预措施并指出可能徒劳的治疗来为治疗决策提供信息。在这里,该程序旨在描述从新鲜,可行的临床组织中建立膀胱癌PDO的策略和详细的分步方案。我们完善的优化方案对于使用直接来自患者或患者来源的异种移植物(PDX)肿瘤材料的有限和多样化的起始材料为实验建立3D培养是实用的。该程序也可以被大多数配备标准组织培养设备的实验室采用。使用该协议生成的类器官可以用作 离体 替代物,以了解支撑泌尿系统癌症病理学的分子机制,并评估治疗以告知临床管理。
膀胱癌是全球最普遍的尿路癌,也是人类第十大常见恶性肿瘤1.它包括遗传多样化和表型复杂的疾病谱2。尿路上皮非肌肉浸润型膀胱癌(NMIBC)是最常见的膀胱癌诊断(70%-80%),这些癌症显示出相当大的生物学异质性和可变的临床结果2,3,4。NMIBC 患者通常具有较高的疾病复发风险 (50-70%),三分之一的癌症会进展并发展成更具侵袭性的肌肉浸润性膀胱癌 (MIBC)2。虽然 NMIBC 的 5 年生存率很高 (>90%),但这些患者必须接受长期临床管理5.另一方面,局部晚期(不可切除)或转移性MIBC通常被认为是无法治愈的6。因此,膀胱癌是癌症护理中终身治疗成本最高的癌症之一,对个人和医疗保健系统来说都是一个巨大的负担3,7。晚期疾病中的潜在遗传畸变使膀胱癌的治疗管理成为一项临床挑战,并且自从批准用于晚期和高风险NMIBC8,9的免疫疗法以来,侵袭性尿路上皮肿瘤的治疗选择最近才有所改善。目前,临床决策一直以传统的临床和组织病理学特征为指导,尽管单个膀胱癌肿瘤在疾病侵袭性和对治疗的反应方面表现出很大差异10。迫切需要加快对临床有用模型的研究,以改善个体患者预后的预测和有效治疗方法的确定。
三维(3D)类器官显示出作为肿瘤模型的巨大潜力,因为它们能够自组织和概括原始肿瘤的内 在体内 结构和药物基因组学特征,以及它们能够反映原始组织的天然细胞功能,它们从中衍生出来11,12,13.尽管已建立的膀胱癌细胞系很容易获得,相对具有成本效益,可扩展且易于操作, 但体外 细胞系在很大程度上无法模仿在临床膀胱癌中观察到的各种遗传和表观遗传改变的谱谱12,14 并且都是在2D,贴壁培养条件下建立和维持的。此外,来自原发性和转移性膀胱肿瘤的细胞系与原始肿瘤物质具有显着的遗传差异。 8,15.
另一种方法是使用基因工程和致癌物诱导的小鼠模型。然而,虽然这些模型概括了一些参与人类肿瘤的天然致癌级联反应(在参考文献16,17,18中回顾),但它们缺乏肿瘤异质性,价格昂贵,侵袭性和转移性膀胱癌的代表性较差,并且不适用于快速足月药物检测,因为肿瘤可能需要数月才能发展14,19.患者衍生的癌症模型(包括类器官、有条件重编程的原代细胞培养物和异种移植物)为在临床治疗前了解药物治疗的效果提供了宝贵的机会20.尽管如此,由于对新鲜原代患者组织的获取有限以及可重复地生成患者源性类器官(PDO)培养条件所需的广泛优化,很少有组常规使用这些患者 - 近端模型。在 体内 环境中,致癌细胞可以与周围成分的各种组合物相互作用和通信,包括基质细胞,浸润免疫细胞和基质12。同样,对于以3D格式生长的PDO,可以自定义细胞/基质复杂性以包括其他相关组件。PDO可以快速生成,并且通常能够广泛传代或冷冻保存以供以后使用,尽管其使用寿命有限为21,22,23。药效学(即对药物的反应)可以使用多次读数来评估,包括类器官活力和形态学,以及免疫组织化学靶标或转录变化的表征。
这里,描述了从膀胱肿瘤经尿道切除术(TURBT)或手术切除膀胱(根治性膀胱切除术)收集的患者材料中建立膀胱癌类器官的程序。图示了使用现成的湿实验室材料和工具生成PDO的方法。终点包括细胞形态特征和活力的变化。这些是使用荧光显微镜, 体外 活力(代谢和细胞膜完整性)测定和组织病理学分析测量的。 图1 显示了从择期手术期间获得的临床材料建立人类膀胱癌PDO的工作流程。
患者在澳大利亚布里斯班亚历山德拉公主医院的泌尿科团队下入院后同意了这项研究。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则以及在伦理和体制准则(伦理学编号HREC/05/QPAH/95,QUT 1000001165)进行的。
注意:作为资格标准,患者年龄≥18岁,患有癌症,并且能够理解并提供同意。那些无法给予知情同意的人被排除在外。那些主要语文不是英语的人被排除在外,因为出于后勤和预算方面的考虑,不可能提供口译员。同样被排除的还有肿瘤无法通过活检或常规病理学后不太可能获得足够量的患者。
1. 类器官培养基制备
注意:人膀胱癌类器官培养基需要生长因子,以帮助从解离的临床材料中提取的类器官的存活,生长和持续扩张(表1)。有关本程序中使用的每种补充剂的完整详细信息,请参阅 材料表。
2. 3中概述的程序前一天
3. 膀胱肿瘤类器官的产生
注意:这是从原发性患者肿瘤建立PDO的第一步。该程序适用于Gao等人建立的方法的膀胱癌组织。
从人膀胱癌患者TURBT和膀胱切除组织中成功建立了3D类器官。简而言之,该技术突出了3D多细胞结构的快速形成,这些结构既可行又适用于其他终点分析,例如组织学评估,分子表征(通过免疫组织化学或定量实时PCR)和药物筛选。在手术过程中(图1),可以利用我们过滤阶段的各种洗脱物(图1,步骤1-6)来冷冻?...
虽然从膀胱癌组织衍生的3D类器官方案仍处于起步阶段,但它们是积极研究和临床研究的一个领域。在这里,详细介绍了成功建立适用于NMIBC和MIBC标本的膀胱癌PDO的优化方案。该工作流程与基于医院的临床试验并行集成,并考虑生物样本库样本累积,包括组织学样本处理和新鲜冷冻组织库,这是临床类器官管道的重要考虑因素。该协议建立在现有方法的基础上,并提供了一种整合的方法,以构建?...
作者没有利益冲突。
我们感谢转化研究所组织学核心和生物资源设施的技术援助。这项研究得到了亚历山德拉公主研究基金会奖(I.V.,E.D.W.)和医学研究未来基金(MRFF)快速应用研究转化计划(癌症个性化分析中心(CPAC;E.D.W., I.V.)。转化研究所得到了澳大利亚政府的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
37°C incubator | |||
37°C water bath | |||
50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
70% (w/w) ethanol | |||
-80°C freezer | |||
96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
Computer system | |||
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
Dry and wet ice | |||
Esky | |||
Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
Liquid nitrogen | |||
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
Scale | |||
Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
Urine specimen jar | |||
Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
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