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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Os organoides derivados do paciente (PDOs) são uma ferramenta poderosa na pesquisa de câncer translacional, refletindo tanto a heterogeneidade genética e fenotípica da doença quanto a resposta a terapias anticânculas personalizadas. Aqui, um protocolo consolidado para gerar PDOs de câncer de bexiga primário humano em preparação para a avaliação de análises fenotípicas e respostas medicamentosas é detalhado.
As plataformas atuais de testes terapêuticos in vitro carecem de relevância para a fisiopatologia tumoral, tipicamente empregando linhas de células cancerígenas estabelecidas como culturas bidimensionais (2D) no plástico da cultura tecidual. Há uma necessidade crítica de modelos mais representativos de complexidade tumoral que possam prever com precisão a resposta terapêutica e a sensibilidade. O desenvolvimento da cultura ex vivo tridimensional (3D) de organoides derivados do paciente (PDOs), derivados de tecidos tumorais frescos, visa supridamente essas deficiências. Culturas organoides podem ser utilizadas como substitutos tumorais em paralelo ao manejo clínico de rotina para informar decisões terapêuticas, identificando possíveis intervenções eficazes e indicando terapias que podem ser fúteis. Aqui, este procedimento visa descrever estratégias e um protocolo passo a passo detalhado para estabelecer PDOs de câncer de bexiga a partir de tecido clínico fresco e viável. Nossos protocolos bem estabelecidos e otimizados são práticos para configurar culturas 3D para experimentos usando material inicial limitado e diversificado diretamente de pacientes ou material tumorado de xenoenxerto derivado do paciente (PDX). Este procedimento também pode ser empregado pela maioria dos laboratórios equipados com equipamentos de cultura de tecido padrão. Os organoides gerados usando este protocolo podem ser usados como substitutos ex vivo para entender tanto os mecanismos moleculares que sustentam a patologia do câncer urológico quanto para avaliar tratamentos para informar o manejo clínico.
O câncer de bexiga é o câncer do trato urinário mais prevalente e a décima malignidade humana mais comum em todo o mundo1. Engloba um espectro geneticamente diverso e fenotipicamente complexo da doença2. As formas não musculares invasivas de câncer de bexiga (NMIBC) são os diagnósticos mais comuns de câncer de bexiga (70%-80%), e esses cânceres apresentam heterogeneidade biológica considerável e desfechos clínicos variáveis 2,3,4. Pacientes com NMIBC normalmente experimentam um alto risco de recidiva da doença (50-70%) e um terço dos cânceres progredirá e se desenvolverá em câncer de bexiga músculo-invasivo significativamente mais agressivo (MIBC)2. Embora as taxas de sobrevivência de 5 anos para o NMIBC sejam altas (>90%), esses pacientes devem passar por um gerenciamento clínico de longo prazo5. Por outro lado, o MIBC localmente avançado (não ressecável) ou metastático é geralmente considerado incurável6. Consequentemente, o câncer de bexiga tem um dos maiores custos de tratamento ao longo da vida dentro do tratamento do câncer e é um fardo significativo tanto para o indivíduo quanto para o sistema de saúde 3,7. As aberrações genéticas subjacentes em doenças avançadas tornam o manejo terapêutico do câncer de bexiga um desafio clínico, e as opções terapêuticas para tumores uroteliais invasivos só melhoraram recentemente desde a aprovação de imunoterápicos para nmibc 8,9 avançados e de alto risco. Atualmente, a tomada de decisão clínica tem sido guiada por características clínicas e histopatológicas convencionais, apesar dos tumores individuais de câncer de bexiga mostrarem grandes diferenças na agressividade da doença e na resposta à terapia10. É urgente acelerar a pesquisa em modelos clinicamente úteis para melhorar a previsão do prognóstico individual do paciente e a identificação de tratamentos eficazes.
Organoides tridimensionais (3D) mostram grande potencial como modelos tumorais devido à sua capacidade de auto-organizar e recapitular a arquitetura intrínseca in vivo do tumor original e o perfil farmacogenômico, e sua capacidade de espelhar a funcionalidade celular nativa do tecido original do qual foram derivados 11,12,13 . Embora as linhas de células cancerígenas de bexiga estabelecidas estejam prontamente disponíveis, relativamente econômicas, escaláveis e simples de manipular, as linhas celulares in vitro não conseguem imitar em grande parte o espectro de diversas alterações genéticas e epigenéticas observadas em cânceres clínicos de bexiga12,14 e foram todas estabelecidas e mantidas sob condições de cultura 2D e aderentes. Além disso, as linhas celulares derivadas de tumores primários e metastáticos da bexiga abrigam divergência genética significativa do material tumoral original. 8,15.
Uma abordagem alternativa é usar modelos de camundongos geneticamente modificados e induzidos por carcinógenos. No entanto, enquanto esses modelos recapitulam algumas das cascatas oncogênicas naturais envolvidas na neoplasia humana (revisadas em refs 16,17,18), elas não têm heterogeneidade tumoral, são caras, representam mal câncer de bexiga invasivo e metastático, e não são viáveis para testes medicamentos rápidos, pois tumores podem levar muitos meses para desenvolver 14,19 . Modelos derivados do câncer (incluindo organoides, cultura celular primária reprogramada condicionalmente e xenoenxertos) fornecem oportunidades inestimáveis para entender os efeitos do tratamento medicamentoso antes do tratamento clínico20. Apesar disso, poucos grupos usam rotineiramente esses modelos paciente-proximal devido ao acesso limitado ao tecido primário fresco do paciente e à ampla otimização necessária para gerar de forma reproduzivelmente as condições de cultura organoide (PDO) derivadas do paciente. Em um ambiente in vivo, as células oncogênicas podem interagir e se comunicar com várias composições dos constituintes circundantes, incluindo células estromais, células imunes infiltradas em tecidos e matriz12. Da mesma forma, para PDOs cultivados em formato 3D, a complexidade celular/matriz pode ser personalizada para incluir outros componentes relevantes. Os PDOs podem ser rapidamente gerados e muitas vezes são capazes de serem passagens extensivamente ou criopreservadas para uso posterior, apesar de terem uma vida útil finita 21,22,23. A farmacodinâmica (ou seja, resposta a uma droga) pode ser avaliada usando leituras múltiplas, incluindo viabilidade organoide e morfologia, e caracterização de alvos imunohistoquímicos ou alterações transcricionais.
Aqui, são descritos os procedimentos para o estabelecimento de organoides de câncer de bexiga a partir de material de paciente coletado da ressecção transuretral do tumor da bexiga (TURBT) ou remoção cirúrgica da bexiga (cistectomia radical). O método de geração de PDOs é ilustrado, utilizando materiais e ferramentas de laboratório molhadas prontamente disponíveis. Os pontos finais incluem alterações nas características morfológicas celulares e viabilidade. Estes foram medidos por meio de microscopia de fluorescência, viabilidade in vitro (integridade metabólica e integridade da membrana celular) e análise histopatológica. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para o estabelecimento de PDOs de câncer de bexiga humana a partir de material clínico obtido durante a cirurgia eletiva.
Os pacientes consentiram com este estudo após sua internação sob a equipe de Urologia no Hospital Princess Alexandra, brisbane, Austrália. Este estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e dentro das diretrizes éticas e institucionais (número de ética HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
NOTA: Como critérios de elegibilidade, os pacientes tinham idade ≥ 18 anos com câncer, e capazes de entender e fornecer consentimento. Foram excluídos aqueles que não puderam dar consentimento informado. Aqueles que tinham uma língua primária diferente do inglês foram excluídos, pois a provisão de intérpretes não foi possível devido a considerações logísticas e orçamentárias. Também foram excluídos pacientes cujos tumores não estavam acessíveis à biópsia ou improváveis de estarem disponíveis em quantidade adequada após a patologia de rotina.
1. Preparação do Meio Organoide
NOTA: O meio organoide do câncer de bexiga humano requer fatores de crescimento que auxiliam na sobrevivência, crescimento e expansão contínua de organoides derivados de material clínico dissociado (Tabela 1). Para obter detalhes completos de cada suplemento utilizado neste procedimento, consulte a Tabela de Materiais.
2. Um dia antes do procedimento descrito em 3
3. Geração de organoides tumorais da bexiga
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento de PDO a partir de tumores primários do paciente. Este procedimento é adaptado para tecidos de câncer de bexiga a partir de métodos estabelecidos por Gao et al.24.
Organoides 3D foram estabelecidos com sucesso a partir do paciente com câncer de bexiga humana TURBT e tecidos de cistectomia. Resumidamente, esta técnica destaca uma rápida formação de estruturas multicelulares 3D que são viáveis e adequadas para outras análises de ponto final, como avaliação histológica, caracterização molecular (por imunohistoquímica ou PCR quantitativo em tempo real) e triagem de medicamentos. Durante o procedimento (Figura 1), os vários elunatos durante n...
Embora os protocolos organoides 3D derivados do tecido do câncer de bexiga ainda estejam em sua infância, eles são uma área de pesquisa ativa e investigação clínica. Aqui, um protocolo otimizado para estabelecer com sucesso PDOs de câncer de bexiga adequados para amostras de NMIBC e MIBC é detalhado. Este fluxo de trabalho se integra paralelamente a ensaios clínicos hospitalares e considera o acúmulo de amostras de biobancos, incluindo processamento de amostras histológicas e banco de tecidos congelados fresc...
Os autores não têm conflitos de interesse.
Reconhecemos a assistência técnica do núcleo de Histologia do Instituto de Pesquisa Translacional e da Instalação de Recursos Biológicos. Esta pesquisa foi apoiada por financiamento do prêmio Da Fundação de Pesquisa Princesa Alexandra (I.V., E.D.W.), e do Programa de Tradução rápida de pesquisa aplicada do Fundo de Pesquisa Médica (MRFF) (Centre for Personalized Analysis of Cancers( CPAC); E.D.W., I.V.). O Instituto de Pesquisa Translacional recebe apoio do governo australiano.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
37°C incubator | |||
37°C water bath | |||
50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
70% (w/w) ethanol | |||
-80°C freezer | |||
96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
Computer system | |||
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
Dry and wet ice | |||
Esky | |||
Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
Liquid nitrogen | |||
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
Scale | |||
Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
Urine specimen jar | |||
Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
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