תרבית של אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן ככלי רפואה מדויקת

Summary

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם כלי רב עוצמה בחקר הסרטן התרגומי, המשקף הן את ההטרוגניות הגנטית והן את ההטרוגניות הפנוטיפית של המחלה ואת התגובה לטיפולים אנטי-סרטניים מותאמים אישית. כאן מפורט פרוטוקול מאוחד ליצירת PDOs ראשוניים של סרטן שלפוחית השתן האנושית כהכנה להערכת ניתוחים פנוטיפיים ותגובות לתרופות.

Abstract

פלטפורמות הבדיקה הטיפוליות הנוכחיות במבחנה חסרות רלוונטיות לפתופיזיולוגיה של הגידול, ובדרך כלל משתמשות בקווי תאים סרטניים המבוססים כתרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) על פלסטיק תרבית רקמה. יש צורך קריטי במודלים מייצגים יותר של מורכבות הגידול שיכולים לחזות במדויק את התגובה והרגישות הטיפולית. הפיתוח של תרבית ex vivo תלת-ממדית (3D) של אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs), הנגזרים מרקמות גידול טריות, נועד לטפל בחסרונות אלה. תרביות אורגנואידיות יכולות לשמש כפונדקאיות גידול במקביל לניהול קליני שגרתי כדי לקבל החלטות טיפוליות מושכלות על ידי זיהוי התערבויות יעילות פוטנציאליות וציון טיפולים שעשויים להיות חסרי תוחלת. כאן, הליך זה נועד לתאר אסטרטגיות ופרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביסוס PDOs של סרטן שלפוחית השתן מרקמה קלינית טרייה ובת קיימא. הפרוטוקולים המבוססים והממוטבים שלנו הם מעשיים כדי להגדיר תרביות תלת-ממדיות לניסויים תוך שימוש בחומרי התחלה מוגבלים ומגוונים ישירות ממטופלים או מחומר גידולי קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה. הליך זה יכול להיות מופעל גם על ידי רוב המעבדות מצוידות בציוד תרבית רקמה סטנדרטי. האורגנואידים הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש כפונדקאיות ex vivo כדי להבין הן את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיה של סרטן אורולוגי והן כדי להעריך טיפולים לניהול קליני מושכל.

Introduction

סרטן שלפוחית השתן הוא סרטן דרכי השתן הנפוץ ביותר והממאירות האנושית העשירית בשכיחותה בעולם¹. הוא מקיף ספקטרום מגוון מבחינה גנטית ומורכב פנוטיפית של מחלה². צורות לא פולשניות של סרטן שלפוחית השתן (NMIBC) הן האבחנות הנפוצות ביותר של סרטן שלפוחית השתן (70%-80%), וסוגי סרטן אלה מפגינים הטרוגניות ביולוגית ניכרת ותוצאות קליניות משתנות ^2,3,4. חולים עם NMIBC חווים בדרך כלל סיכון גבוה להישנות המחלה (50-70%) ושליש ממקרי הסרטן יתקדמו ויתפתחו לסרטן שלפוחית השתן הפולשני השרירים (MIBC)² אגרסיבי יותר באופן משמעותי. למרות ששיעורי ההישרדות של NMIBC ל-5 שנים גבוהים (>90%), חולים אלה חייבים לעבור ניהול קליני ארוך טווח⁵. מצד שני, MIBC מתקדם מקומי (לא ניתן לניתוח) או גרורתי נחשב בדרך כלל לחשיפת מרפא⁶. כתוצאה מכך, לסרטן שלפוחית השתן יש את אחת מעלויות הטיפול הגבוהות ביותר לכל החיים בטיפול בסרטן והוא מהווה נטל משמעותי הן על הפרט והן על מערכת הבריאות ^3,7. הסטיות הגנטיות הבסיסיות במחלות מתקדמות הופכות את הניהול הטיפולי של סרטן שלפוחית השתן לאתגר קליני, ואפשרויות טיפוליות לגידולי אורותל פולשניים השתפרו רק לאחרונה מאז אישור אימונותרפיות עבור NMIBC ^8,9 מתקדם ובסיכון גבוה כאחד. נכון לעכשיו, קבלת ההחלטות הקליניות הונחתה על ידי מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים קונבנציונליים, למרות שגידולים בודדים בסרטן שלפוחית השתן מראים הבדלים גדולים באגרסיביות המחלה ובתגובה לטיפול¹⁰. יש צורך דחוף להאיץ את המחקר למודלים שימושיים מבחינה קלינית כדי לשפר את החיזוי של פרוגנוזה של מטופלים בודדים וזיהוי של טיפולים יעילים.

אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מראים פוטנציאל רב כמודלים של גידולים בשל יכולתם לארגן את עצמם ולשחזר את הארכיטקטורה הפנימית של הגידול המקורי in vivo ואת הפרופיל הפרמקוגנומי, ואת יכולתם לשקף את הפונקציונליות התאית הטבעית של הרקמה המקורית שממנה נגזרו 11,12,13 . אף על פי שקווי תאים מבוססים של סרטן שלפוחית השתן זמינים בקלות, חסכוניים יחסית, מדרגיים ופשוטים למניפולציה, קווי התאים במבחנה אינם מצליחים במידה רבה לחקות את הספקטרום של שינויים גנטיים ואפיגנטיים מגוונים שנצפו בסרטן קליני של שלפוחית השתן ^12,14 וכולם הוקמו ונשמרו בתנאי תרבית דו-ממדיים ודבקים. בנוסף, קווי תאים שמקורם בגידולים ראשוניים וגרורתיים בשלפוחית השתן הם בעלי סטייה גנטית משמעותית מהחומר הגידולי המקורי. ^8,15.

גישה חלופית היא להשתמש במודלים של עכברים מהונדסים גנטית ומושרים על ידי מסרטנים. עם זאת, בעוד שמודלים אלה משחזרים חלק מהמפלים האונקוגניים הטבעיים המעורבים בניאופלזיה אנושית (שנסקרו ב- refs 16,17,18), הם חסרים הטרוגניות של הגידול, הם יקרים, מייצגים בצורה גרועה סרטן שלפוחית שתן פולשני וגרורתי, ואינם ברי קיימא לבדיקות תרופות מהירות מכיוון שגידולים יכולים לקחת חודשים רבים לפתח ^14,19 . מודלים שמקורם בחולה של סרטן (כולל אורגנואידים, תרבית תאים ראשונית שתוכנתה מחדש באופן מותנה ושנאת זרים) מספקים הזדמנויות שלא יסולא בפז להבין את ההשפעות של טיפול תרופתי לפני טיפול קליני²⁰. למרות זאת, מעטות הקבוצות שמשתמשות באופן שגרתי במודלים פרוקסימליים אלה של המטופלים בשל גישה מוגבלת לרקמות חדשות של מטופלים ראשוניים והאופטימיזציה הנרחבת הנדרשת כדי ליצור באופן משוחזר תנאי תרבית אורגנואידיים שמקורם בחולה (PDO). בסביבה in vivo, תאים אונקוגניים יכולים לקיים אינטראקציה ולתקשר עם הרכבים שונים של המרכיבים הסובבים אותם, כולל תאים סטרומליים, רקמה החודרת לתאי מערכת החיסון ומטריצה¹². באופן דומה, עבור מחשבי כף יד הגדלים בתבנית תלת-ממדית, ניתן להתאים אישית את המורכבות התאית/מטריצה כך שתכלול רכיבים רלוונטיים אחרים. ניתן ליצור PDOs במהירות ולעתים קרובות הם יכולים לעבור באופן נרחב או להקפאה לשימוש מאוחר יותר, למרות שתוחלת החיים שלהם היא ^21,22,23. ניתן להעריך פרמקודינמיקה (כלומר, תגובה לתרופה) באמצעות קריאות מרובות, כולל כדאיות ומורפולוגיה של אורגנואידים, ואפיון של מטרות אימונוהיסטוכימיה או שינויי שעתוק.

כאן מתוארים ההליכים להקמת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן מחומר החולה שנאסף מכריתה טרנס-אורתרלית של גידול בשלפוחית השתן (TURBT) או הסרה כירורגית של שלפוחית השתן (כריתת ציסטה רדיקלית). השיטה ליצירת PDOs מומחשת, תוך שימוש בחומרי מעבדה וכלים רטובים הזמינים בקלות. נקודות הקצה כוללות שינויים במאפיינים המורפולוגיים של התאים ובכדאיות. אלה נמדדו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מבחנים של יכולת הכדאיות החוץ גופית (שלמות ממברנת המטבולית והתא) וניתוח היסטופתולוגי. איור 1 מראה את זרימת העבודה לביסוס PDOs של סרטן שלפוחית השתן האנושית מחומר קליני המתקבל במהלך ניתוח אלקטיבי.

Protocol

המטופלים הסכימו למחקר זה בעקבות אשפוזם תחת צוות אורולוגיה בבית החולים הנסיכה אלכסנדרה, בריסביין, אוסטרליה. מחקר זה בוצע בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ובמסגרת הקווים המנחים האתיים והמוסדיים (מספר האתיקה HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).

הערה: כקריטריונים לזכאות, המטופלים היו בני ≥ 18 עם סרטן, והיו מסוגלים להבין ולספק הסכמה. אלה שלא הצליחו לתת הסכמה מדעת לא נכללו. אלה שהיו בעלי שפה עיקרית שאינה אנגלית לא נכללו מכיוון שהתקנת מתורגמנים לא התאפשרה בשל שיקולים לוגיסטיים ותקציביים. כמו כן לא נכללו חולים שהגידולים שלהם לא היו נגישים לביופסיה או לא סביר שיהיו זמינים בכמות מספקת לאחר הפתולוגיה השגרתית.

1. הכנה בינונית אורגנואידית

הערה: מדיום האורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן האנושית דורש גורמי גדילה המסייעים בהישרדות, גדילה והתפשטות מתמשכת של אורגנואידים שמקורם בחומר קליני מנותק (טבלה 1). לקבלת פרטים מלאים על כל תוסף המשמש בהליך זה, עיין בטבלת החומרים.

1. להפשיר מרכיבים קפואים על קרח או במקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. הימנעו ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים ועבדו מאליקוטים קפואים (המאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס).
2. בינוני בסיסי: מכינים את המדיום הבסיסי על ידי תוסף ל-F-12 מתקדם של Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham (adDMEM/F12) עם HEPES (10 mM) וגלוטמין (2 mM). זה משמש גם כאמצעי הובלה, ובמהלך צעדי שטיפה אורגנואידים.
   הערה: DMEM/F-12 מתקדם משמש כמדיום הבסיסי כדי לסייע בהרחבת האורגנואידים בנוכחות סרום מוגבל; עם זאת, הוא דורש תוספת עם HEPES ו-L-גלוטמין.
3. לזמן קצר צנטריפולוגה פיברובלסט גורם גדילה 10 (FGF-10), גורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF-2), גורם גדילה אפיתליאלי (EGF), SB202190, פרוסטגלנדין E2 (PGE2) ו- A 83-01 לפני הפתיחה כדי להבטיח שהרכיבים נמצאים בתחתית הבקבוקון.
4. תווך אורגנואידי שלם: תוספת למדיום בסיסי עם נוג'ין אנושי ו-R-ספונדין 1-מותנה מדיה בריכוז סופי של 5% v/v, EGF אנושי (50 ננוגרם/מ"ל), FGF-2 אנושי (5 ננוגרם/מ"ל), FGF-10 אנושי (20 ננוגרם/מ"ל), A 83-01 (500 ננומטר), SB202190 (10 מיקרומטר), B27 (1x), ניקוטינמיד (10 ננומטר), N-אצטילציסטאין (1.25 מ"מ), Y-27632 (10 מיקרומטר), PGE2 (1 מיקרומטר) והיווצרות אנטיביוטית רחבת טווח בריכוז המציין היצרן.
5. יש לאחסן מדיה אורגנואידית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך ולהשתמש בה תוך שבועיים (חודש לכל היותר). אין לקפוא. הימנעו מחשיפה ממושכת למקורות אור.
   הערה: המדיום האורגנואידי מוכן ללא סרום; עם זאת, ניתן להוסיף סרום ופניצילין/סטרפטומיצין על בסיס משתמש למשתמש לפי הצורך.

2. יום לפני הנוהל המתואר ב-3

1. הפשרת גורם גדילה הפחיתה את קרום המרתף (BME; ראה טבלת חומרים) למשך הלילה למשך 12 שעות לפחות לפני השימוש במקרר של 4 מעלות צלזיוס או בחדר קר. במידת הצורך, מחלקים BME לתוך 1 מ"ל aliquots בצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חד פעמי כדי למנוע מחזורי הפשרה בהקפאה.
2. הניחו טיפים מסוננים של פיפטה למקרר של 4 מעלות צלזיוס או לחדר קר.
   הערה: סעיף זה מתייחס לעצות פיפטה שישמשו בעת טיפול ב- BME כדי למנוע פילמור מוקדם ולהפחית את הציפוי של BME על פני השטח של הטיפים.
3. לעקר את כל הציוד הכירורגי הנדרש להליך.

3. יצירת אורגנואידים של גידולים בשלפוחית השתן

הערה: זהו צעד ראשוני להקמת PDO מגידולים ראשוניים בחולים. הליך זה מותאם לרקמות סרטן שלפוחית השתן משיטות שנקבעו על ידי Gao et ^al.24.

1. השתמש במכסה מנוע ביו-האזרד מדרגה II כדי להכין את הדגימה. אחזור קרח יבש ורטוב והדפסת גיליון עיבוד דגימות מטופלים (קובץ משלים).
2. התקשרו לאנשי המחקר לחדר הניתוח כאשר הכריתה הכירורגית קרובה לסיום.
   הערה: ודא שהמטופל עומד בקריטריוני הזכאות וחתם על טופס הסכמת המשתתף. רקמות מסופקות למחקר רק אם עודף לדרישות להערכה היסטופתולוגית קלינית.
3. לאסוף דגימת גידול חדשה בת קיימא מבחינה מקרוסקופית מניתוח. ודא שהדגימה שקועה בתווך הובלה (1x adDMEM/F12 או 1x Dulbecco's תמיסת מלח עם מאגר פוספט (DPBS)) בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל או בצנצנת דגימת שתן במהלך המעבר.
   הערה: במרכזים קליניים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להעביר רקמות למעבדה פתולוגית כדי שיוקצו למחקר. בנסיבות אלה, מומלץ להוסיף אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-מיקוטיות למדיום ההובלה. ניתן לאחסן רקמה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתווך בסיסי למשך עד 24 שעות לאחר הניתוח ועדיין ליצור תרביות אורגנואידיות בנות קיימא.
4. רשמו פרטי דגימה, כולל משקל הרקמה (g או mg), תיאור הדגימה ופרטים לגבי דגימות דם ושתן כלשהן בגיליון עיבוד הדגימות של המטופל (קובץ משלים).
5. בזהירות להסיר את מדיום ההובלה ולהחליף אותו עם 10 מ"ל של מדיה בסיסית. אפשרו לרקמת הגידול להתיישב בכוח הכבידה.
   הערה: מדיום הובלה נחשב לפסולת קלינית ויש לאסוף אותו במיכל פסולת המסומן כראוי בכמות מתאימה של תמיסת טיהור. לאחר שהנוזל עבר טיהור כימי, ניתן להיפטר ממנו בהתאם להנחיות המוסדיות לפסולת מסוכנת.
6. הסירו את רקמת הגידול בעזרת מלקחיים והניחו אותה בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 90 מ"מ (איור 2A). רשמו את משקל הרקמה במ"ג או ב-g על גיליון עיבוד הדגימות הקליניות ורשת הנתיחה (איור 2B).
7. הסר רקמה שאינה סרטנית (כולל רקמת שומן) ואזורים נמקיים הנראים לעין מקרוסקופית באמצעות מלקחיים סטריליים ולהב אזמל חד פעמי המורכב על ידית האזמל (איור 2C). לשטוף חתיכות הגידול 1-2 פעמים עם קר 1x DPBS. לאסוף את חתיכות הגידול ולהעביר אותם לצלחת פטרי סטרילית חדשה 90 מ"מ.
   הערה: מכיוון שהלהבים של האזמל חדים, יש להיזהר בעת חיתוך ידני. ניתן לזהות רקמת שומן סמוכה לגידול על ידי אזורים רכים, ג'לטיניים וחיוורים מובהקים הסמוכים להיקף הגידול החזותי. רקמת שומן מקרוסקופית, ואזורים כהים במוקד המייצגים אזורים של נמק ידרשו שיקול דעת אישי בעת ניתוח מביופסיה של גידול בשלפוחית השתן.
8. צלמו תמונה, ציירו דיאגרמה של רקמה ותכננו כריתת רקמות על רשת עיבוד קלינית (איור 2B ואיור 2C).
   הערה: חשוב לשמור על תיעוד חזותי ושרטוט גס של מאפייני הגידול המקרוסקופי האינדיבידואלי ונתיחה עבור כל מקרה ספציפי.
9. נתחו פיסות רקמת גידולים והקצו לניתוחים היסטופתולוגיים (איור 2D) ולניתוחים מולקולריים (איור 2E).
   1. לצורך ניתוחים היסטולוגיים: הכניסו כ-50 מ"ג של רקמת גידול לתוך קלטת היסטולוגיה פלסטית חד-פעמית (איור 2D). טבלו קלטת היסטולוגיה במיכל עם נפח של פי 5 עד פי 10 של 10% פורמלין נייטרלי (NBF). דגירה למשך הלילה ב-RT.
   2. הסר 10% NBF והחלף ב-70% (w/w) אתנול למחרת לאחסון בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) עד שניתן יהיה לעבד את הרקמה באמצעות פרוטוקול עיבוד רקמות שגרתי
   3. לצורך ניתוחים מולקולריים: הצמדה מקפיאה לפחות חתיכת גידול אחת של 1-3 מ"מ³ ב-RNase/DNase ללא קריוביאל 1.5 מ"ל ללא RNase באמצעות חנקן נוזלי ומאחסנת בטמפרטורה של -80°C (איור 2E).
10. מחלקים 5 מ"ל של מדיום אורגנואידי (טבלה 1) בצלחת פטרי 90 מ"מ המכילה את שאר חלקי הגידול.
11. באופן מכני טחנו את הרקמה בצורה עדינה ככל האפשר (0.5-1 מ"מ³ חתיכות או יותר) עם להב אזמל סטרילי #10.
    הערה: לשברים גדולים יותר או לגושי רקמות שלמים (>3 מ"מ³) ייקח הרבה יותר זמן לעכל ויפחיתו את הכדאיות של הדגימה. השמט את השלב הנ"ל אם הרקמה מפורקת והשברים קטנים מספיק כדי לקטר עם קצה פיפטה סרולוגי 5 מ"ל.
12. מעבירים רקמה טחונה דק לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום אורגנואידי, 1 מ"ל של 10x קולגן/היאלורונידאז, ו-0.1 מ"ג/מ"ל דאוקסיריבונוקלאז 1 (DNase 1) כדי למנוע גוש תאים.
    הערה: יש להכין תמיסת אנזימים טרייה בכל פעם. הגדל את נפח המדיום להיות בערך פי 10 מהכמות הנראית לעין של שברי הגידול עבור דגימות גדולות.
13. דגירה של רקמת הגידול הטחונה ותמיסת האנזים למשך 1-2 שעות על שייקר או סיבוב מסלולי (150 סל"ד) באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) כדי לנתק שברי תרחיף של תאים ולפרק קולגן. ניתן לבדוק זאת באמצעות ניתוח היסטולוגי (איור 3A).
    הערה: אם כמות הרקמה גדולה או לא נצפתה דיסוציאציה ברורה לאחר 1-1.5 שעות, הגדל את זמן הדגירה בבדיקת רמת הדיסוציאציה כל 30 דקות. התזמון לשלב זה תלוי במדגם ויש לקבוע אותו באופן אמפירי בכל פעם. תמיסה ברורה יותר באופן ניכר עם שברי רקמות שאינם ברורים לעין (או מעט מאוד שברים) מצביעה על עיכול מוצלח.
14. לסיים את העיכול עם תוספת של נפח 2x (20 מ"ל) של מדיום בסיסי למדגם.
15. צנטריפוגה הדגימה ב 261 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT), לשאוף, ולהשליך את supernatant.
16. כדי לזהות תאי דם אדומים מזהמים (RBCs), יש להחיות את הכדור המתקבל מהשלב הנ"ל ב-5 מ"ל של חיץ אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK). דגירה של הצינור ב- RT למשך 3 דקות או עד שתראה את התזה המלאה של ה- RBCs (ההשעיה מתבהרת).
    הערה: אם RBCs אינם נצפים כגוש אדום קטן בכדור, ניתן להשמיט שלב זה.
17. הוסף 20 מ"ל של התווך הבסיסי לתוך הצינור. צנטריפוגה את הצינור ב 261 x g במשך 5 דקות ב- RT ושואף את supernatant.
18. בשלב זה, הניחו 10 מ"ל אליקווט של 2x ו-1x אורגנואידים בינוני באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להתחמם.
19. סנן את הדגימה דרך מסננת 100 מיקרומטר הפיכה רטובה מראש לתוך צינור חדש של 50 מ"ל כדי להסיר חומר גדול ובלתי מסיס.
    הערה: חומר גדול ולא מעוכל (>100 מיקרומטר) שנאסף על ידי המסנן עשוי להכיל תאים בעלי עניין וניתן לתרבית אותו בצלחת פטרי 90 מ"מ או בצלחת תרבית תאים של 6 בארות בתווך אורגנואידי כדי להפיק תרביות דו-ממדיות (איור 1 (שלב 5) ואיור 3B).
20. סנן את ה-eluate דרך מסננת 37 מיקרומטר הפיכה טרום-רטובה כדי לאסוף תאים בודדים ואשכולות קטנים לבידוד של תאים בודדים ותאים חיסוניים (Tube 37-1; איור 1 (שלב 6) ואיור 3B).
    הערה: ניתן להגדיל את התשואה של תאי הגידול במהלך שלב זה על ידי העברת תרחיף התא המסונן דרך המסננת שוב.
21. הפוך את מסננת 37 מיקרומטר והשתמש ב-10 מ"ל של מדיה בסיסית כדי לאסוף אשכולות קטנים ובינוניים (37-100 מיקרומטר) (צינור 70-1; איור 3B).
22. מלאו כל אחד מצינורות ה-50 מ"ל החדשים (צינורות 70-1 ו-37-1) עם DPBS ל-40 מ"ל. צנטריפוגה את המתלים ב 261 x g במשך 5 דקות ב RT. לשאוף ולהשליך את supernatant.
23. הוסף 10 מ"ל של מדיה בסיסית לצינור 37-1 וספור את התאים באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן ומונה תאים אוטומטי (לפי מפרט היצרן). קבע את מספר התא ואת הכדאיות של התאים.
24. צנטריפוגה את שארית הדגימה ב-261 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את המדיום והחליפו אותו בתמיסת הקפאת תאים או במדיה בסיסית המכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
25. מניחים דגימות בקריוביאלים של 1.5 מ"ל ומאחסנים אותן במיכל הקפאת תאים. מעבירים מיד את המיכל למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לקצב קירור אופטימלי. לאחר אחסון מקפיא לילי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, העבירו את הקריוביציאלים לנוזל קריוגני או לאחסון פאזת אוויר (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.
26. תאי החייאה מצינור 70-1 עם 500 μL של תווך אורגנואידי מחומם מראש 2x.
    הערה: צפיפות הזריעה חייבת להיות גבוהה לצורך התפשטות אורגנואידית מוצלחת. נפח המדיום האורגנואידי, ולאחר מכן, BME צריך להיות שונה באופן אמפירי על מספר התאים שבודדו משלב הסינון. שלב זה מספק נקודת התחלה רלוונטית המבוססת על מחקרים במעבדה שלנו.
27. הוסיפו BME לתאים (ביחס של 1:1 עם תווך אורגנואידי פי 2x) עם קצוות פיפטה סטריליים של P1000 עם מסנן קר כקרח וערבבו בעדינות כדי להשעות תאים. פיפטה במהירות ובזהירות 100 μL של תאים משוחזרים / תערובת BME לבארות של צלחת חיבור שטוחה בעלת תחתית נמוכה במיוחד של 96 בארות. מקם את צלחת 96 הבאר באינקובטור (37 °C (37 °C ,5% CO₂) למשך 20-30 דקות כדי להתמצק.
28. הוסף יחס של 1:2 של 1x תווך אורגנואידי על גבי תרחיף תאי BME בהתאם לנפח המוערך אמפירית. בנקודת ההתחלה הרלוונטית, הוסף 50 μL של 1x מדיית תווים אורגנואידית על גבי 100 μL של תאים משוחזרים / תערובת BME.
29. הניחו את צלחת 96 הבאר באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) למשך 20 דקות כדי להתאימם.
30. הוציאו את צלחת תרבית התאים מהחממה והרכיבו אותה על מחזיק דגימה על במה של מיקרוסקופ. הערך אורגנואידים באופן חזותי תחת ניגודיות פאזה או הגדרות שדה בהיר.
    הערה: התמונות נרכשות בצורה הטובה ביותר על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך המצויד באופטיקה של הפרעות דיפרנציאליות (DIC), מצלמה דיגיטלית ותוכנה נלווית כדי לצפות בהיווצרותם של מחשבי כף יד כדוריים כהכנה לניתוח נקודות קצה.
    1. אם ניתן לראות צבירים נפרדים, מקם את לוחית תרבית התאים בתא מיקרוסקופ מחומם אלקטרונית על הבמה (37 °C, 5% CO₂) להדמיית תאים חיים במהלך 24-72 השעות הראשונות.
    2. ודא שהקולר המחומם הגמיש מחובר לעדשה כדי להפחית את הסחף התרמי ואת מכשיר האדים מלא ב- dH₂O.
    3. בצע את ההדמיה הראשונית באמצעות עדשת מטרה 4x או 10x (N.A. 0.30, W.D. 15.2 מ"מ). הקפות זמן כל 5-10 דקות בהגדרת ניגודיות הפאזה.
    4. בדוק את הבידוד המוצלח כפי שמאופיין בהופעת >10 אורגנואידים המארגנים את עצמם לכל זמן רב לאחר תקופה של 24-72 שעות.
    5. אפשרו לתרביות להימשך עד שבועיים אם מספר האורגנואידים נמוך (איור 3C).
31. מלאו את המדיום כל 2-3 ימים באמצעות 50 μL של מדיום אורגנואידי שחומם מראש כדי לחדש את גורמי הגדילה המדולדלים ואת הנפח הכולל.
32. רכוש תמונות (כמתואר בשלב 3.30) בימים 1, 2 ו-3 (סדרת קיטועי זמן), ובימים 5, 7 ו-10 לפני המעבר (אם רלוונטי).
    הערה: אורגנואידים (הנצפים כמבנים עגולים בדרך כלל שבהם לא ניתן לראות את הקצוות של תאים בודדים) מועברים בדרך כלל 7-10 ימים לאחר ההתקנה, בהתאם להצלחת הבידוד. לפני או אחרי המעבר, ניתן לטפל באורגנואידים באמצעות ציטוטוקסים או חומרים טיפוליים למשך עד 6 ימים ותגובה תרופתית נמדדת באמצעות מבחני כדאיות תאים וציטוטוקסיות. לחלופין, ניתן לאחזר אורגנואידים מ-BME (באמצעות 1 מ"ג/מ"ל דיספוזה) ולהקפאה (bio banked), להכין אותם לבדיקה מולקולרית, או להטמיע ולהעריך אותם באופן היסטולוגי (איור 4).

תוצאות

אורגנואידים תלת-ממדיים הוקמו בהצלחה מסרטן שלפוחית השתן האנושית חולה TURBT ורקמות כריתת ציסטה. בקצרה, טכניקה זו מדגישה היווצרות מהירה של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים שהם גם ברי קיימא וגם מתאימים לניתוחים אחרים של נקודות קצה כגון הערכה היסטולוגית, אפיון מולקולרי (על ידי אימונוהיסטוכימיה או PCR כמ?...

Discussion

בעוד שפרוטוקולים אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם ברקמת סרטן שלפוחית השתן עדיין בחיתוליהם, הם תחום של מחקר פעיל ומחקר קליני. כאן מפורט פרוטוקול מותאם לביסוס מוצלח של PDOs של סרטן שלפוחית השתן המתאימים הן לדגימות NMIBC והן לדגימות MIBC. זרימת עבודה זו משתלבת במקביל בניסויים קליניים מבוססי בית חולי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL cryogenic vial	Corning	430487
1.5 mL Eppendorf tubes	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	polypropylene single-use tube
100 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27270
100 mm Petri dish	Corning	430167
10x Collagenase/ Hyaluronidase	STEMCELL Technologies	#07912
37 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tube	Corning	CLS430829-500EA
6-well plate	Corning	CLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)	Sigma-Aldrich	CLS3474-24EA
A 83-01	BioScientific	2939	Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis buffer	STEMCELL Technologies	#07850
adDMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Base medium
Animal-free recombinant EGF	Sigma-Aldrich	518179	Growth factor
Automated cell counter (TC20)	Bio-rad	1450102
B27 additive	Gibco	17504044	Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450015
Centrifuge	Eppendorf	EP022628188
Computer system
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	#07930	Cell freezing solution
Dispase II, powder	Thermofisher	17105041	To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1	STEMCELL Technologies	#07900
DPBS	Thermofisher	14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)	Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128	Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)	Invitrogen	35050061	Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPES	Gibco	15630-080	All-purpose buffer
Histology cassette	ProSciTech	RCH44-W
Human FGF-10	Peprotech	100-26-25	Growth factor
Human FGF-2	Peprotech	100-18B-50	Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)	In Vitro Technologies	356231	Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing container	ThermoFisher	5100-0001	cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma	A7250	Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	SIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscope	Nikon	MFA510BB
NIS-Elements Advanced Research	Nikon	MQS31000
Noggin conditioned media	In-house		BMP inhibitor
Pipetboy acu 2	Integra	155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
Primocin	Jomar Bioscience	ant-pm2	Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	support proliferation of cells
Rotary tube mixer	Ratek	RSM7DC
R-spondin 1 conditioned media	In-house		WNT signalling regulator
SB202190	Jomar Bioscience	s1077-25mg	Selective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handle	Livingstone	WBLDHDL03
Scalpels, #11 blade	Medical and Surgical Requisites	EU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste Bags	Medical Search	SU09125X16
Urine specimen jar
Y27632	Jomar Bioscience	s1049-10mg	Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells