Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü

Özet

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.

Özet

Mevcut in vitro terapötik test platformları, tipik olarak doku kültürü plastiği üzerinde iki boyutlu (2D) kültürler olarak kurulan kanser hücre hatlarını kullanan tümör patofizyolojisi ile ilgisizdir. Terapötik yanıtı ve duyarlılığı doğru bir şekilde tahmin edebilen daha temsili tümör karmaşıklığı modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Taze tümör dokularından türetilen hasta kaynaklı organoidlerin (PDO'lar) üç boyutlu (3D) ex vivo kültürünün geliştirilmesi, bu eksiklikleri gidermeyi amaçlamaktadır. Organoid kültürler, potansiyel etkili müdahaleleri tanımlayarak ve yararsız olabilecek tedavileri belirterek terapötik kararları bilgilendirmek için rutin klinik yönetime paralel olarak tümör vekilleri olarak kullanılabilir. Burada, bu prosedür, taze, canlı klinik dokudan mesane kanseri PDO'larını oluşturmak için stratejileri ve ayrıntılı bir adım adım protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. İyi kurulmuş, optimize edilmiş protokollerimiz, doğrudan hastalardan veya hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör materyalinden sınırlı ve çeşitli başlangıç materyali kullanarak deneyler için 3D kültürler oluşturmak için pratiktir. Bu prosedür, standart doku kültürü ekipmanı ile donatılmış çoğu laboratuvar tarafından da kullanılabilir. Bu protokol kullanılarak üretilen organoidler, hem ürolojik kanser patolojisini destekleyen moleküler mekanizmaları anlamak hem de klinik yönetimi bilgilendirmek için tedavileri değerlendirmek için ex vivo vekiller olarak kullanılabilir.

Giriş

Mesane kanseri tüm dünyada en sık görülen üriner sistem kanseri ve onuncu en sık görülen insan malignitesidir¹. Genetik olarak çeşitli ve fenotipik olarak karmaşık bir hastalık spektrumunu kapsar². Mesane kanserinin ürotelyal non-kas invaziv formları (NMIBC) en sık görülen mesane kanseri tanılarıdır (%70-%80) ve bu kanserler önemli biyolojik heterojenite ve değişken klinik sonuçlar gösterir ^2,3,4. NMIBC'li hastalar tipik olarak yüksek hastalık nüks riski (% 50-70) yaşarlar ve kanserlerin üçte biri önemli ölçüde daha agresif kas invaziv mesane kanserine (MIBC^{) ilerler} ve gelişir2. NMIBC için 5 yıllık sağkalım oranları yüksek olmasına rağmen (%>90), bu hastalar uzun süreli klinik yönetime tabi tutulmalıdır⁵. Öte yandan, lokal olarak ilerlemiş (rezeke edilemez) veya metastatik MIBC genellikle tedavi edilemez olarak kabul edilir⁶. Sonuç olarak, mesane kanseri, kanser bakımı içinde en yüksek yaşam boyu tedavi maliyetlerinden birine sahiptir ve hem birey hem de sağlık sistemi için önemli bir yüktür ^3,7. İleri evre hastalıkta altta yatan genetik anormallikler, mesane kanserinin terapötik yönetimini klinik bir zorluk haline getirmektedir ve invaziv ürotelyal tümörler için terapötik seçenekler, hem ileri hem de yüksek riskli NMIBC ^8,9 için immünoterapilerin onaylanmasından bu yana yakın zamanda gelişmiştir. Günümüzde klinik karar verme, bireysel mesane kanseri tümörlerinin hastalık agresifliği ve tedaviye yanıtta büyük farklılıklar göstermesine rağmen, konvansiyonel klinik ve histopatolojik özelliklerle yönlendirilmektedir¹⁰. Bireysel hasta prognozunun tahminini ve etkili tedavilerin tanımlanmasını iyileştirmek için klinik olarak yararlı modellere yönelik araştırmaların hızlandırılmasına acil bir ihtiyaç vardır.

Üç boyutlu (3D) organoidler, orijinal tümörün içsel in vivo mimarisini ve farmakogenomik profilini kendi kendine organize etme ve özetleme yetenekleri ve türetildikleri orijinal dokunun doğal hücresel işlevselliğini yansıtma yetenekleri nedeniyle tümör modelleri olarak büyük potansiyel göstermektedir^11,12,13 . Yerleşik mesane kanseri hücre hatları kolayca bulunabilse de, nispeten uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve manipüle edilmesi basit olmasına rağmen, in vitro hücre hatları klinik mesane kanserlerinde gözlenen çeşitli genetik ve epigenetik değişikliklerin spektrumunu taklit etmekte büyük ölçüde başarısız olmuştur^12,14 ve hepsi 2D^, bağlı kültür koşulları altında kurulmuş ve sürdürülmüştür. Ek olarak, primer ve metastatik mesane tümörlerinden türetilen hücre hatları, orijinal tümör materyalinden önemli genetik ayrışma barındırmaktadır. ^8,15.

Alternatif bir yaklaşım, genetiği değiştirilmiş ve kanserojen kaynaklı fare modellerini kullanmaktır. Bununla birlikte, bu modeller insan neoplazisinde yer alan bazı doğal onkojenik kaskadları özetlerken (refs 16,17,18'de gözden geçirilmiştir), tümör heterojenliğinden yoksundurlar, pahalıdırlar^, invaziv ve metastatik mesane kanserini zayıf bir şekilde temsil ederler ve tümörlerin gelişmesi aylar sürebileceğinden hızlı süreli ilaç testi için uygun değildirler^14,19 . Hasta kaynaklı kanser modelleri (organoidler, şartlı olarak yeniden programlanmış birincil hücre kültürü ve ksenogreftler dahil), klinik tedaviden önce ilaç tedavisinin etkilerini anlamak için paha biçilmez fırsatlar sunar²⁰. Buna rağmen, az sayıda grup, taze primer hasta dokusuna sınırlı erişim ve hasta kaynaklı organoid (PDO) kültür koşullarını çoğaltılabilir bir şekilde üretmek için gereken kapsamlı optimizasyon nedeniyle bu hasta-proksimal modelleri rutin olarak kullanmaktadır. In vivo bir ortamda, onkojenik hücreler, stromal hücreler, bağışıklık hücrelerine sızan doku ve matris¹² dahil olmak üzere çevredeki bileşenlerin çeşitli bileşimleriyle etkileşime girebilir ve iletişim kurabilir. Benzer şekilde, 3B formatında yetiştirilen PDO'lar için, hücresel/matris karmaşıklığı diğer ilgili bileşenleri içerecek şekilde özelleştirilebilir. PDO'lar hızlı bir şekilde üretilebilir ve^21,22,23 sonlu bir ömre sahip olmasına rağmen^, genellikle yaygın olarak geçirilebilir veya daha sonra kullanılmak üzere kriyokorunabilir. Farmakodinamik (yani, bir ilaca yanıt), organoid canlılık ve morfoloji ve immünohistokimya hedeflerinin veya transkripsiyonel değişikliklerin karakterizasyonu dahil olmak üzere çoklu okumalar kullanılarak değerlendirilebilir.

Burada, mesane tümörünün transüretral rezeksiyonundan (TURBT) toplanan hasta materyalinden mesane kanseri organoidlerinin kurulması veya mesanenin cerrahi olarak çıkarılması (radikal sistektomi) prosedürleri açıklanmaktadır. PDO'ları üretme yöntemi, hazır bulunan ıslak laboratuvar malzemeleri ve araçları kullanılarak gösterilmiştir. Son noktalar, hücre morfolojik özelliklerindeki ve canlılığındaki değişiklikleri içerir. Bunlar floresan mikroskopi, in vitro canlılık (metabolik ve hücre zarı bütünlüğü) testleri ve histopatolojik analiz kullanılarak ölçüldü. Şekil 1 , elektif cerrahi sırasında elde edilen klinik materyalden insan mesane kanseri PDO'larının kurulması için iş akışını göstermektedir.

Protokol

Hastalar, Avustralya'nın Brisbane kentindeki Princess Alexandra Hastanesi'ndeki Üroloji ekibi altında kabul edildikten sonra bu çalışmaya onay verdiler. Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygun olarak, etik ve kurumsal kılavuzlar çerçevesinde gerçekleştirilmiştir (etik numarası HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).

NOT: Uygunluk kriteri olarak, hastalar 18 yaşın ≥ kanserliydi ve anlayabiliyor ve onay verebiliyorlardı. Bilgilendirilmiş onam veremeyenler hariç tutuldu. İngilizce dışında bir ana dile sahip olanlar, lojistik ve bütçe hususları nedeniyle tercüman temini mümkün olmadığından hariç tutuldu. Ayrıca, tümörleri biyopsi için erişilebilir olmayan veya rutin patolojiden sonra yeterli miktarda bulunma olasılığı düşük olan hastalar da hariç tutuldu.

1. Organoid Orta Hazırlık

NOT: İnsan mesane kanseri organoid ortamı, ayrışmış klinik materyalden türetilen organoidlerin hayatta kalmasına, büyümesine ve sürekli genişlemesine yardımcı olan büyüme faktörleri gerektirir (Tablo 1). Bu prosedürde kullanılan her bir ekin tüm ayrıntıları için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.

1. Dondurulmuş malzemeleri buz üzerinde veya buzdolabında 2-8 ° C'de çözün. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının ve dondurulmuş alikotlardan (-20 °C'de saklanır) çalışın.
2. Bazal ortam: Gelişmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Ham'ın F-12'sini (adDMEM / F12) HEPES (10 mM) ve glutamin (2 mM) ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın. Bu aynı zamanda bir taşıma ortamı olarak ve organoid yıkama adımları sırasında da kullanılır.
   NOT: Gelişmiş DMEM / F-12, sınırlı serum varlığında organoidlerin genişlemesine yardımcı olmak için bazal ortam olarak kullanılır; Bununla birlikte, HEPES ve L-glutamin ile takviye gerektirir.
3. Bileşenlerin şişenin dibinde olduğundan emin olmak için açılmadan önce fibroblast büyüme faktörü 10 (FGF-10), fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2), epitel büyüme faktörü (EGF), SB202190, prostaglandin E2 (PGE2) ve A 83-01'i kısaca santrifüj edin.
4. Tam organoid ortam: % 5 v / v, insan EGF (50 ng / mL), insan FGF-2 (5 ng / mL), insan FGF-10 (20 ng / mL), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nikotinamid (10 mM), N-asetilsistein (1.25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) ve üretici tarafından belirtilen konsantrasyonda geniş spektrumlu bir antibiyotik oluşumu ile insan noggin ve R-spondin 1 şartlandırılmış ortam ile ek bazal ortam.
5. Organoid medyayı karanlıkta 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde (en fazla 1 ay) kullanın. Donmayın. Işık kaynaklarına uzun süre maruz kalmaktan kaçının.
   NOT: Organoid ortam serumsuz olarak hazırlanır; Bununla birlikte, serum ve penisilin / streptomisin gerektiğinde kullanıcıdan kullanıcıya bazda takviye edilebilir.

2. 3'te özetlenen prosedürden bir gün önce

1. Çözülme büyüme faktörü, 4 °C'lik bir buzdolabında veya soğuk odada kullanılmadan önce en az 12 saat boyunca gece boyunca bazal membranı (BME; Malzeme Tablosuna bakınız) azalttı. Gerekirse, donma-çözülme döngülerini önlemek için BME'yi 1,5 mL'lik polipropilen tek kullanımlık bir tüpte 1 mL alikotlara dağıtın.
2. Filtrelenmiş pipet uçlarını 4 °C'lik bir buzdolabına veya soğuk odaya yerleştirin.
   NOT: Bu bölümde, erken polimerizasyonu önlemek ve uçların yüzeyindeki BME kaplamasını azaltmak için BME kullanılırken kullanılacak pipet uçları ele alınmaktadır.
3. İşlem için gerekli tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.

3. Mesane tümörü organoidlerinin oluşumu

NOT: Bu, primer hasta tümörlerinden PDO oluşumu için ilk adımdır. Bu prosedür, Gao ve ^ark.24 tarafından belirlenen yöntemlerden mesane kanseri dokuları için uyarlanmıştır.

1. Numuneyi hazırlamak için sınıf II biyolojik tehlike başlığı kullanın. Kuru ve ıslak buzu alın ve Hasta Numune İşleme Sayfasını (Ek Dosya) yazdırın.
2. Cerrahi rezeksiyon tamamlanmak üzereyken araştırma personelini ameliyathaneye çağırın.
   NOT: Hastanın uygunluk kriterlerini karşıladığını ve katılımcı onay formunu imzaladığını onaylayın. Doku, yalnızca klinik histopatolojik değerlendirme için gerekliliklere fazlalık olması durumunda araştırma için sağlanır.
3. Ameliyattan taze makroskopik olarak uygulanabilir bir tümör örneği toplayın. Numunenin, taşıma sırasında steril 50 mL konik tüp veya idrar numunesi kavanozunda taşıma ortamına (1x adDMEM/F12 veya 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS)) batırıldığından emin olun.
   NOT: Bazı klinik merkezlerde, dokunun araştırma için tahsis edilmek üzere bir patoloji laboratuvarına taşınması gerekebilir. Bu koşullar altında, taşıma ortamına antibiyotik ve antimikotiklerin eklenmesi önerilir. Doku, ameliyat sonrası 24 saate kadar bazal ortamda 4 ° C'de saklanabilir ve yine de canlı organoid kültürler üretir.
4. Doku ağırlığı (g veya mg), numune açıklaması ve Hasta Numune İşleme Sayfası'ndaki (Ek Dosya) herhangi bir kan ve idrar örneğiyle ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere numune ayrıntılarını kaydedin.
5. Taşıma ortamını dikkatlice çıkarın ve 10 mL bazal medya ile değiştirin. Tümör dokusunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
   NOT: Taşıma ortamı klinik atık olarak kabul edilir ve uygun miktarda dekontaminasyon çözeltisi içinde uygun şekilde etiketlenmiş bir atık kabında toplanmalıdır. Sıvı kimyasal olarak dekontamine edildikten sonra, tehlikeli atıklar için kurumsal kılavuzlara göre bertaraf edilebilir.
6. Tümör dokusunu forseps ile çıkarın ve steril 90 mm Petri kabına yerleştirin (Şekil 2A). Dokunun ağırlığını mg veya g cinsinden klinik numune işleme sayfasına ve diseksiyon ızgarasına kaydedin (Şekil 2B).
7. Kanserli olmayan dokuları (yağ dokusu dahil) ve makroskopik olarak görülebilen nekrotik bölgeleri, neşter sapına monte edilmiş steril forseps ve tek kullanımlık neşter bıçağı kullanarak çıkarın (Şekil 2C). Tümör parçalarını soğuk 1x DPBS ile 1-2 kez yıkayın. Tümör parçalarını toplayın ve yeni bir steril 90 mm Petri Kabına aktarın.
   NOT: Neşter bıçakları keskin olduğundan, manuel olarak dilimlerken dikkatli olun. Tümöre bitişik yağ dokusu, görsel tümör çevresine hemen bitişik belirgin yumuşak, jelatinimsi, soluk alanlarla tanımlanabilir. Makroskopik yağ dokusu ve nekroz alanlarını temsil eden fokal karanlık bölgeler, eksizyonel mesane tümörü biyopsisinden diseksiyon yaparken kişisel yargı gerektirecektir.
8. Bir fotoğraf çekin, bir doku diyagramı çizin ve klinik işlem ızgarasında doku diseksiyonunu planlayın (Şekil 2B ve Şekil 2C).
   NOT: Her bir spesifik vaka için bireysel makroskopik tümör özelliklerinin ve diseksiyonunun görsel bir kaydını ve kaba bir taslağını tutmak önemlidir.
9. Tümör doku parçalarını diseke eder ve histopatolojik (Şekil 2D) ve moleküler analizler (Şekil 2E) için tahsis eder.
   1. Histolojik analizler için: Etiketli tek kullanımlık plastik histoloji kasetine yaklaşık 50 mg tümör dokusu yerleştirin (Şekil 2D). Histoloji kasetini 5x ila 10x hacimli% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içeren bir kaba batırın. RT'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
   2. % 10 NBF'yi çıkarın ve ertesi gün% 70 (w / w) etanol ile değiştirin, doku rutin doku işleme protokolü kullanılarak işlenene kadar 4 ° C'de depolamak için
   3. Moleküler analizler için: Sıvı azot kullanarak RNaz / DNaz içermeyen 1.5 mL kriyovyalde en az bir adet^{1-3 mm3} tümör parçasını anında dondurun ve -80 ° C'de saklayın (Şekil 2E).
10. Kalan tümör parçalarını içeren 90 mm'lik Petri kabına 5 mL organoid ortam (Tablo 1) dağıtın.
11. Steril #10 neşter bıçağı ile dokuyu mümkün olduğunca ince (0,5-1 mm³ parça veya daha küçük) mekanik olarak kesin.
    NOT: Daha büyük parçaların veya bütün doku parçalarının (>3^mm3) sindirimi oldukça uzun sürecek ve numunenin canlılığını azaltacaktır. Doku ayrıştırılmışsa ve parçalar 5 mL serolojik pipet ucu ile pipet oluşturacak kadar küçükse yukarıdaki adımı atlayın.
12. İnce kıyılmış dokuyu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kümelenmesini önlemek için 4 mL organoid ortam, 1 mL 10x kollajenaz / hyaluronidaz ve 0.1 mg / mL deoksiribonükleaz 1 (DNaz 1) ekleyin.
    NOT: Enzim çözeltisi her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Ortamın hacmini, büyük örnekler için tümör fragmanlarının görünür miktarının yaklaşık 10 katı olacak şekilde artırın.
13. Kıyılmış tümör dokusunu ve enzim çözeltisini, fragmanları bir hücre süspansiyonuna ayırmak ve kollajenleri parçalamak için bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO 2) bir orbital çalkalayıcı veya rotatör (150 rpm) üzerinde_1-2 saat boyunca inkübe edin. Bu histolojik analiz ile kontrol edilebilir (Şekil 3A).
    NOT: Doku miktarı büyükse veya 1-1.5 saat sonra belirgin bir ayrışma gözlenmezse, her 30 dakikada bir ayrışma seviyesini kontrol ederek kuluçka süresini artırın. Bu adımın zamanlaması örneğe bağlıdır ve her seferinde ampirik olarak belirlenmelidir. Gözle fark edilemeyen doku parçaları (veya çok az parça) ile gözle görülür şekilde daha net bir çözelti, başarılı sindirimi gösterir.
14. Numuneye 2x hacim (20 mL) bazal ortam ekleyerek sindirimi sonlandırın.
15. Numuneyi oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın, aspire edin ve süpernatanı atın.
16. Kirletici kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) lize etmek için, yukarıdaki adımdan elde edilen peleti 5 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü RT'de 3 dakika boyunca veya RBC'lerin tamamen lizisi görülene kadar inkübe edin (süspansiyon netleşir).
    NOT: RBC'ler pelette küçük kırmızı bir küme olarak gözlenmezse, bu adım atlanabilir.
17. Tüpe 20 mL bazal ortam ekleyin. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
18. Bu adımda, ısınmak için 37 ° C'lik bir su banyosuna 10 mL'lik 2x ve 1x organoid ortamdan oluşan bir aliquot yerleştirin.
19. Büyük çözünmez malzemeyi çıkarmak için numuneyi önceden ıslanmış tersinir 100 μm'lik bir süzgeçten yeni bir 50 mL tüpe filtreleyin.
    NOT: Filtre tarafından toplanan büyük sindirilmemiş materyal (>100 μm) ilgilenilen hücreleri içerebilir ve 2B kültürleri türetmek için organoid ortamda 90 mm Petri kabında veya 6 delikli hücre kültürü plakasında kültürlenebilir (Şekil 1 (adım 5) ve Şekil 3B).
20. Tek hücreli ve immün hücre izolasyonu için tek hücreleri ve küçük kümeleri toplamak için ıslaklık öncesi tersinir 37 μm'lik bir süzgeçten elüatı filtreleyin (Tüp 37-1; Şekil 1 (adım 6) ve Şekil 3B).
    NOT: Bu adımda tümör hücrelerinin verimi, filtrelenmiş hücre süspansiyonunun süzgeçten tekrar geçirilmesiyle arttırılabilir.
21. 37 μm süzgeci ters çevirin ve küçük ve orta büyüklükteki kümeleri (37-100 μm) toplamak için 10 mL bazal ortam kullanın (tüp 70-1; Şekil 3B).
22. Yeni 50 mL tüplerin ( 70-1 ve 37-1 tüpleri) her birini DPBS ile 40 mL'ye kadar doldurun. RT'de 5 dakika boyunca süspansiyonu 261 x g'de santrifüj yapın.
23. 37-1 numaralı tüpe 10 mL bazal ortam ekleyin ve tripan mavisi dışlama boyası ve otomatik bir hücre sayacı (üreticinin spesifikasyonlarına göre) kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayısını ve hücrelerin yaşayabilirliğini belirleyin.
24. Numunenin geri kalanını RT'de 5 dakika boyunca 261 x g'de santrifüj yapın. Ortamı aspire edin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren hücre dondurma çözeltisi veya bazal medya ile değiştirin.
25. Örnekleri 1,5 mL kriyovyallere yerleştirin ve hücre dondurucu bir kapta saklayın. Optimum soğutma hızı için kabı hemen -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. -80 °C'de gece boyunca dondurucu depolamanın ardından, kriyovalleri uzun süreli depolama için kriyojenik sıvı veya hava fazı depolamasına (-196 °C) aktarın.
26. Hücreleri tüp 70-1'den 500 μL önceden ısıtılmış 2x organoid ortam ile yeniden askıya alın.
    NOT: Başarılı organoid yayılımı için tohumlama yoğunluğu yüksek olmalıdır. Organoid ortamın hacmi ve daha sonra BME, filtrasyon adımından izole edilen hücre sayısına göre ampirik olarak değiştirilmelidir. Bu adım, laboratuvarımızdaki çalışmalara dayanan ilgili bir başlangıç noktası sağlar.
27. Buz gibi soğuk P1000 steril filtre pipet uçlarıyla hücrelere BME ekleyin (2x organoid ortam ile 1:1 oranında) ve hücreleri askıya almak için hafifçe karıştırın. 100 μL yeniden yapılandırılmış hücre/BME karışımını ultra düşük ataşmanlı düz tabanlı 96 delikli plakanın kuyularına hızlı ve dikkatli bir şekilde pipetleyin. Katılaşması için 96 delikli plakayı 20-30 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C, %5 CO_{2) yerleştirin}.
28. Ampirik olarak değerlendirilen hacme bağlı olarak BME hücre süspansiyonunun üzerine 1: 2 oranında 1x organoid ortam ekleyin. İlgili başlangıç noktasında, 100 μL yeniden yapılandırılmış hücre / BME karışımının üzerine 50 μL 1x organoid orta ortam ekleyin.
29. Dengelemek için 96 delikli plakayı 20 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C, % 5 CO_{2) yerleştirin}.
30. Hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve mikroskop sahnesindeki bir numune tutucuya monte edin. Organoidleri faz kontrastı veya parlak alan ayarları altında görsel olarak değerlendirin.
    NOT: Görüntüler en iyi şekilde, uç nokta analizine hazırlık olarak küresel PDO'ların oluşumunu gözlemlemek için diferansiyel girişim (DIC) optikleri, dijital kamera ve ilgili yazılımlarla donatılmış ters çevrilmiş bir faz kontrastı mikroskobu ile elde edilir.
    1. Farklı kümeler görülebiliyorsa, hücre kültürü plakasını ilk 24-72 saat boyunca canlı hücre görüntülemesi için sahnede elektronik olarak ısıtılan bir mikroskop odasına (37 ° C, % 5 CO 2) yerleştirin.
    2. Termal sapmayı azaltmak için esnek ısıtmalı tasmanın lense takılı olduğundan ve nemlendiricinin dH₂O ile doldurulduğundan emin olun.
    3. İlk görüntülemeyi 4x veya 10x objektif lens (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm) kullanarak gerçekleştirin. Faz kontrastı ayarında her 5-10 dakikada bir hızlandırılmış çekim.
    4. 24-72 saatlik bir süreden sonra kuyu başına >10 kendi kendini organize eden organoidlerin ortaya çıkmasıyla karakterize edilen başarılı izolasyonu kontrol edin.
    5. Organoid sayıları düşükse kültürlerin iki haftaya kadar devam etmesine izin verin (Şekil 3C).
31. Tükenmiş büyüme faktörlerini ve genel hacmi yenilemek için 50 μL önceden ısıtılmış organoid ortam kullanarak ortamı her 2-3 günde bir doldurun.
32. 1, 2 ve 3. günlerde (hızlandırılmış seri) ve geçişten önceki 5, 7 ve 10. günlerde (varsa) görüntüleri (adım 3.30'da açıklandığı gibi) alın.
    NOT: Organoidler (genellikle tek tek hücrelerin kenarlarını göremediğiniz yuvarlak yapılar olarak gözlenir), izolasyonun başarısına bağlı olarak, tipik olarak kurulumdan 7-10 gün sonra geçirilir. Pasajdan önce veya sonra, organoidler 6 güne kadar sitotoksik veya terapötik ajanlarla tedavi edilebilir ve hücre canlılığı ve sitotoksisite testleri kullanılarak ölçülen ilaç yanıtı. Alternatif olarak, organoidler BME'den (1 mg / mL dispase kullanılarak) alınabilir ve kriyokorunmuş (biyo bankalı), moleküler test için hazırlanabilir veya histolojik olarak gömülebilir ve değerlendirilebilir (Şekil 4).

Sonuçlar

İnsan mesane kanseri hastası TURBT ve sistektomi dokularından 3D organoidler başarıyla kuruldu. Kısaca, bu teknik, histolojik değerlendirme, moleküler karakterizasyon (immünohistokimya veya kantitatif gerçek zamanlı PCR ile) ve ilaç taraması gibi diğer son nokta analizleri için hem uygulanabilir hem de uygun olan 3D çok hücreli yapıların hızlı oluşumunu vurgulamaktadır. İşlem sırasında (Şekil 1), filtrasyon aşamalarımız sırasında çeşitli elüatlar (Şekil 1, adım

Tartışmalar

Mesane kanseri dokusundan türetilen 3D organoid protokoller henüz bebeklik döneminde olmakla birlikte, aktif bir araştırma ve klinik araştırma alanıdır. Burada, hem NMIBC hem de MIBC örnekleri için uygun olan mesane kanseri PDO'larını başarılı bir şekilde oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol detaylandırılmıştır. Bu iş akışı, hastane tabanlı klinik çalışmalara paralel olarak entegre olur ve klinik organoid boru hatları için önemli bir husus olan histolojik numune işleme ve taz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL cryogenic vial	Corning	430487
1.5 mL Eppendorf tubes	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	polypropylene single-use tube
100 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27270
100 mm petri dish	Corning	430167
10x Collagenase/ Hyaluronidase	STEMCELL Technologies	#07912
37 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tube	Corning	CLS430829-500EA
6-well plate	Corning	CLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)	Sigma-Aldrich	CLS3474-24EA
A 83-01	BioScientific	2939	Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis buffer	STEMCELL Technologies	#07850
adDMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Base medium
Animal-free recombinant EGF	Sigma	518179	Growth factor
Automated cell counter (TC20)	Bio-rad	1450102
B27 additive	Gibco	17504044	Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450015
Centrifuge	Eppendorf	EP022628188
Computer system
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	#07930	Cell freezing solution
Dispase II, powder	Thermofisher	17105041	To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1	STEMCELL Technologies	#07900
DPBS	Thermofisher	14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)	Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128	Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)	Invitrogen	35050061	Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPES	Gibco	15630-080	All-purpose buffer
Histology cassette	ProSciTech	RCH44-W
Human FGF-10	Peprotech	100-26-25	Growth factor
Human FGF-2	Peprotech	100-18B-50	Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)	In Vitro Technologies	356231	Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing container	ThermoFisher	5100-0001	cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma	A7250	Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	SIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscope	Nikon	MFA510BB
NIS-Elements Advanced Research	Nikon	MQS31000
Noggin conditioned media	In-house		BMP inhibitor
Pipetboy acu 2	Integra	155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
Primocin	Jomar Bioscience	ant-pm2	Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	support proliferation of cells
Rotary tube mixer	Ratek	RSM7DC
R-spondin 1 conditioned media	In-house		WNT signalling regulator
SB202190	Jomar Bioscience	s1077-25mg	Selective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handle	Livingstone	WBLDHDL03
Scalpels, #11 blade	Medical and Surgical Requisites	EU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste Bags	Medical Search	SU09125X16
Urine specimen jar
Y27632	Jomar Bioscience	s1049-10mg	Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells