B 组 链球菌 （GBS） 引发的绒毛膜羊膜炎临床前动物模型的剖腹产

摘要

该方案的目标是描述 B 组 链球菌 （GBS） 诱导的绒毛膜羊膜炎的临床前动物模型。该研究旨在调查机制过程、与发育障碍的潜在因果关系，并最终开发转化抗炎胎盘和神经保护疗法。

摘要

B 组 链球菌 （GBS） 是人类怀孕期间分离出的最常见细菌之一。它是胎盘感染/炎症的主要原因，称为绒毛膜羊膜炎。绒毛膜羊膜炎使发育中的胎儿面临器官损伤、围产期发病率和死亡率的高风险，以及终生神经行为障碍和其他非神经发育问题。来自母体和胎儿组织的 GBS 分离株的两种最常见的亚型是血清型 Ia （13%-23%） 和 III 型 （25%-53%）。我们的实验室已经开发并表征了 GBS 诱导的绒毛膜羊膜炎大鼠模型，以研究对发育中胎儿中枢神经系统的后续影响，并了解潜在的机制方面。本文介绍了临床前大鼠模型的设计和用途，该模型紧密再现了 GBS 诱导的人类绒毛膜羊膜炎的标志。本文旨在帮助科学家重现实验设计，并通过故障排除示例提供支持。目前的模型还可以通过揭示原因、机制和新的治疗途径来促进潜在的发现，这些在绒毛膜羊膜炎引起的许多发育障碍中仍未解决。此外，该模型的使用可以扩展到影响例如视网膜、肠道、肺和肾脏的围产期非神经系统常见和严重发病率的研究。这项研究的主要兴趣是 GBS 诱导的胎儿神经发育障碍领域，例如脑瘫 （CP）、注意力缺陷多动障碍 （ADHD） 和自闭症谱系障碍 （ASD）。本文介绍了支持此模型的基本原理，然后是程序和结果。

引言

母体免疫激活 （MIA） 已被描述为后代早产、胎儿死亡以及终生认知和行为障碍的最关键的独立危险因素之一 1,2,3,4。许多关于妊娠炎症对胎盘和发育结局影响的现有临床前研究都使用病原体成分，例如来自大肠杆菌的脂多糖 （LPS） 和病毒双链 RNA 的合成类似物，聚肌苷：聚胞苷酸 （Poly[I： C]），它们模拟病毒感染。然而，尽管 B 组链球菌 （GBS） 是围产期感染的最常见原因，但很少有动物模型研究其在炎症机制和结果中的作用⁵。

GBS 是一种有荚膜的革兰氏阳性球菌，在大约 15%-30% 的孕妇的下生殖道定植⁶。它会导致胎盘感染/炎症，称为绒毛膜羊膜炎 ^7,8。在 10 种 GBS 血清型中，两种最常见的血清型 Ia 和 III 是母胎组织损伤的主要感染决定因素 ^9,10。GBS 感染已被证明会导致胎儿血液和胎盘缺陷中更高的炎症反应，这高度怀疑与多种神经发育障碍有关，例如脑瘫 （CP）、注意力缺陷多动障碍 （ADHD） 和自闭症谱系障碍 （ASD）^5,11。

在过去的十年中，我们开发了一种 GBS 诱导的绒毛膜羊膜炎大鼠模型，该模型导致后代出现各种发育障碍¹²。该临床前模型证明了 GBS 诱导的胎盘炎症与后代一系列性别特异性神经发育障碍之间的因果关系 13,14,15。本文的目的是为读者提供对妊娠末期感染临床前大鼠模型设计及其导致的后代神经行为障碍的见解。本方案旨在模拟 GBS 诱导的绒毛膜羊膜炎的临床现实。

该临床前模型的结果表明，妊娠末期腹膜内 （IP） 接种 GBS（图 1）导致 （i） 胎盘感染和炎症，满足绒毛膜羊膜炎的诊断标准¹⁶;（ii） 胎盘内 IL-1β 和来自 IL-1 通路的下游炎症分子的大量上调¹²;（iii） 后代的神经发育障碍¹²;（iv） 免疫反应和随后的神经行为障碍的性别差异，例如女性后代表现出成人 ADHD 样特征，而男性后代表现出早发性和长期 ASD 样特征;（v） 后代的不同神经行为结果取决于用于诱导绒毛膜羊膜炎的 GBS 血清型^14,15。根据这些发现，利用该模型的下一步主要步骤将是首先测试雄激素在 GBS 诱导的绒毛膜羊膜炎中的作用，其次，针对特定炎症途径的分子的胎盘和神经保护作用，以期将其中一些分子带到治疗临床试验的门槛。

研究方案

所有实验均已获得麦吉尔大学健康中心研究所 （RI-MUHC） 的批准。所有实验均根据加拿大动物护理委员会进行。

1. 怀孕的 Lewis 大鼠

1. 在妊娠日 （G） 从商业来源获得 Lewis 大鼠 （G）14。将它们安置在 20-23 °C 的受控环境中的适当动物设施（RI-MUHC 动物设施）中，光照/黑暗循环 12 小时，并随意获得水和食物 ¹⁷。
2. 每天称重胶卷以检测从 G14（即到达当天）到 G22（即剖腹产当天）的任何疾病行为

2. 细菌生长

1. 在 G18 上，准备两个无菌试管，其中包含 5 mL 无菌脑心输液 （BHI） 肉汤。从 -80 °C 中取出一小部分冷冻细菌原液（BHI 中的 β-溶血荚膜血清型 Ia 和 15% 甘油¹⁴），并将其加入 5 mL BHI 管中（图 2）。
2. 将试管放入摇床 （240 rpm） 中，在 37 °C 下放置 18 小时。
3. 在 G19 上，通过将 1.5 mL 孵育溶液收集到 48.5 mL 无菌 BHI 肉汤中，在无菌 BHI 肉汤中制备 3% GBS 溶液。
4. 将 1.5 mL 的 3% GBS 加 BHI 溶液收集到比色皿中。使用分光光度计，将初始吸收记录为 T₀ （光密度 （OD）_{600 nm}）。
   注意：每次使用用无菌 BHI 肉汤制成的空白来平衡分光光度计。
5. 将 3% 溶液置于 37 °C 的培养箱中，以 240 rpm 振荡约 2 小时，2 小时后每 20 分钟检查一次吸收，直到达到 0.6 和 0.8 之间的吸光度测量值（OD_{600 nm}）。
6. 达到所需的吸光度后，收集 20 mL 的 3% GBS 加 BHI 溶液，并将其添加到 50 mL 试管中。
7. 将样品在 4 °C 下离心 （1792 x g） 13 分钟，然后用 20 mL 0.9% 无菌盐水洗涤沉淀的 GBS 两次。
8. 将沉淀的 GBS 悬浮在 2 mL 的 0.9% 无菌盐水中。将此等分试样保存在冰上直至注射时。
9. 用 100 μL 无菌 0.9% 盐水注射（腹膜内）对照组，用悬浮在无菌 0.9% 盐水中β溶血血清型 Ia GBS 注射 GBS。
   注：注射剂量为 10⁸ 个 GBS 或生理盐水（用于对照）的菌落形成单位 （CFU）。接种 10⁸ CFU 已被公认为人绒毛膜羊膜炎的模型。接种较高剂量的 GBS 可能会导致母鸡死亡。注射少于上述剂量不会模拟感染和炎症。
10. 在 ^10-5 和 ^10-10 之间进行稀释，并将稀释液一式三份接种在 BHI 琼脂平板上。为了排除污染，制作两个阴性对照（不添加任何物质），一个在 BHI 琼脂板上，另一个在 CHROMID Strepto B 琼脂板上。通过将制备的细菌接种在 BHI 琼脂平板和 CHROMID Strepto B 琼脂平板上，制备两个阳性对照。将所有板置于37°C的培养箱中过夜（图3）。
    注：CHROMID Strepto B 琼脂平板是用于筛选 GBS 的选择性培养基，其中 GBS 集落呈红色。

3. 注射技术

1. 在 G19 上，轻轻地将大鼠从笼子中取出，并将其放在平坦的表面上。用毛巾盖住大鼠的头部和上半身，使大鼠无法固定。抬起后腿，以便轻松进入注射部位。
   注意：确保合适的注射解剖区域位于腹部的右下象限，以避免穿刺膀胱和盲肠等器官（图 1）。
2. 使用带有 29 G 1/2 英寸针头的 U-100 胰岛素注射器。将针斜面朝上插入头部，与水平面成 40-45° 角，如图 1 所示。为每个 dam 执行一次 GBS 注射。确保每 1 小时进行一次注射，以避免接种母细胞之间的时间效应。
   注意：在每天进行一次以上注射的日子里，左侧和右侧的注射量应有所不同。

4. 剂量测定

1. 在 G20 上，验证四个对照（步骤 10.2）并计数每个 BHI 琼脂平板上的细菌菌落。
2. 计算每个稀释因子（^10-5 至 ^10-10）的平均 GBS 菌落，以确定 GBS 的确切注射剂量

5. 剖腹产和组织采集

1. 在 G22 上进行剖腹产（注射后 72 小时），并根据每个母细胞的接种时间在母细胞之间进行 1 小时的后续手术。
2. 在含有 2% 异氟醚和 1.5% O₂ 的安乐死室中麻醉 dam_，用于全身麻醉。
3. 将膜放在覆盖有适当手术敷料的加热垫上，然后将眼药膏涂抹在眼睛上以避免干燥。
4. 使用刀片或手术刀去除下腹部的毛发，准备手术区域。
5. 用蘸有消毒剂的无菌纱布清洁手术区域。
6. 使用无菌手术刀和细尖剪刀，在大鼠的下腹部做一个水平切口。在腹部的两侧做一个垂直切口，露出下面的器官。
7. 从胎儿中分离胎盘样本。记录胎儿、胎盘的重量和胎儿/胎盘比率。
8. 使用无菌手术刀，将胎盘切成两半。
   1. 使用 2-甲基丁烷快速冷冻胎盘的一半并保持在 -80 °C，直到需要使用 ELISA 测定蛋白质水平。
   2. 将胎盘的另一半固定在 4% 缓冲甲醛中，通过免疫组织化学 （IHC） 进行 原位 分析，以研究收集的胎盘中 GBS 和多形核细胞 （PMN） 的表达。
9. 斩首以从活胎儿采集血液并将血液转移到锂肝素凝胶分离管中。
10. 在 4 °C 下离心 （18,928 x g ） 血液样品以分离血浆并将血浆样品储存在 -80 °C 直至进一步分析。
    注意：收集的胎儿血浆样本将用于 ELISA，以检查胎儿血液中不同细胞因子的蛋白水平。
11. 收集胎儿尾巴，通过扩增SRY基因内的序列来确定胎儿的性别，使用以下引物（正向引物：5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3';反向引物：5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'），如前所述¹⁸。
12. 使用 5 mL 23 G 针头，通过心脏穿刺从 dam 中采集血液，以检查和比较 dam 血液中不同细胞因子的蛋白质水平与胎儿血液中的细胞因子水平。通过隔膜穿刺和斩首方法对水坝实施安乐死。
    注意：在动物之间，用无菌组织和无菌盐水清洁所有用过的器械。为了对后代进行神经病理学和行为学研究，母鼠在 G23 上自然分娩。在出生后第 80 天 （PN） 对后代实施安乐死后，收集大脑用于分子和组织学研究。

结果

免疫 IP 接种 GBS 导致胎盘感染
免疫组织化学 （IHC） （使用靶向 GBS 血清型 Ia 的多克隆抗体） 染色显示 GBS 感染到达胎盘的蜕膜室。感染也从蜕膜传播到迷路、绒毛膜板，在某些情况下，还传播到胎儿，导致胎儿死亡（GBS 暴露为 5.8 ± 0.8 只，对照 （CTL） 窝为 9.3 ± 0.6 只幼仔）¹⁸。因此，与未暴露的胎儿相比，暴露于 GBS 的胎儿在出生时窝...

讨论

协议中的关键步骤
该方案的几个步骤很关键，需要一些质量控制。例如，GBS 储液存在被其他病原体污染的风险。这可以使用适当的 GBS 微生物鉴定技术快速鉴定，例如 BHI 琼脂上的菌落方面（例如，大小、形状、颜色），将 β 溶血 GBS 剂量接种在含有 5% 羊血培养基的哥伦比亚血琼脂和 CHROMID Strepto B 琼脂上，一种用于筛选 GBS 的选择性显色培养基。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL sterile tube	BD Biosciences
50 ml falcon tubes	Thermo Fisher	339652
Blade or scalpel	BD Medical	371716
Brain Heart Infusion Broth	Criterion (Hardy diagnostics)	C5141
CHROMID Strepto B agar plate	BioMerieux, Saint-Laurent	43461
Columbia blood agar 5 % with sheep blood medium	Thermo Scientific	R01215
Forward primer	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'	Sigma
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Co(BD)	324702
Lewis rats	Charles River Laboratories
Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631
Microtainer blood collection tubes	Becton, Dickinson and Co(BD)	365965
Reverse primer	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'	Sigma
Serological Pipettes 1 ML	Thermo Fisher	170353N
Serological Pipettes 10 ML	Thermo Fisher	170356N
Serological Pipettes 25 ML	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ML	Thermo Fisher	170355N
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