JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью данного протокола является описание доклинической животной модели хориоамнионита, индуцированного стрептококком группы В (СГБ). Целью исследования является изучение механистических процессов, потенциальных причинно-следственных связей с нарушениями развития и, наконец, разработка трансляционных противовоспалительных плаценто- и нейропротекторных методов лечения.

Аннотация

Стрептококк группы В (СГБ) является одной из наиболее распространенных бактерий, выделяемых во время беременности человека. Это основная причина плацентарной инфекции/воспаления, называемой хориоамнионитом. Хориоамнионит подвергает развивающийся плод высокому риску повреждения органов, перинатальной заболеваемости и смертности, а также пожизненных нейроповеденческих нарушений и других неневрологических проблем развития. Двумя наиболее частыми подтипами изолятов СГБ из тканей матери и плода являются серотипы Ia (13%-23%) и III (25%-53%). Наша лаборатория разработала и охарактеризовала модель хориоамнионита, вызванного СГБ, на крысах для изучения последующих воздействий на центральную нервную систему развивающегося плода и понимания лежащих в ее основе механистических аспектов. В данной статье представлен дизайн, а также использование доклинической модели крысы, которая в точности воспроизводит отличительный признак СГБ-индуцированного хориоамнионита у человека. Цель этой статьи — помочь ученым воспроизвести план эксперимента, а также предоставить поддержку с помощью примеров устранения неполадок. Настоящая модель также может способствовать потенциальным открытиям за счет раскрытия причин, механизмов и новых терапевтических путей, которые остаются нерешенными при многих нарушениях развития, возникающих в результате хориоамнионита. Кроме того, использование этой модели может быть распространено на исследования перинатальных неневрологических общих и тяжелых заболеваний, затрагивающих, например, сетчатку, кишечник, легкие и почки. Основной интерес данного исследования связан с СГБ-индуцированными нарушениями развития нервной системы плода, такими как церебральный паралич (ДЦП), синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и расстройства аутистического спектра (РАС). В данной статье представлено обоснование этой модели, а также процедуры и результаты.

Введение

Материнская иммунная активация (MIA) была описана как один из наиболее важных независимых факторов риска преждевременных родов, смерти плода и пожизненных когнитивных и поведенческих нарушений у потомства 1,2,3,4. Большая часть существующих доклинических исследований о роли гестационного воспаления в плаценте и исходах развития использует компоненты патогенов, такие как липополисахарид (ЛПС) из E. coli и синтетический аналог вирусной двухцепочечной РНК, полиинозиновую: полицитидиловую кислоту (Poly[I: C]), которые имитируют вирусные инфекции. Однако, несмотря на то, что стрептококк группы В (СГБ) является наиболее частой причиной перинатальной инфекции, лишь немногие животные модели рассматривали его роль в воспалительных механизмахи исходах.

СГБ представляет собой инкапсулированный грамположительный кокк, который колонизирует нижние отделы половых путей примерно у 15-30% беременных женщин6. Это приводит к плацентарной инфекции/воспалению, называемому хориоамнионитом 7,8. Из десяти серотипов СГБ два наиболее частых серотипа Ia и III являются основными инфекционными детерминантами повреждений в тканях матери и плода 9,10. Было показано, что инфекция СГБ приводит к более высокой воспалительной реакции в крови плода и плацентарной недостаточности, которые, как предполагается, участвуют в множественных нарушениях развития нервной системы, таких как церебральный паралич (ДЦП), синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и расстройства аутистического спектра (РАС)5,11.

За последние десять лет мы разработали модель СГБ-индуцированного хориоамнионита на крысах, который приводит к различным нарушениям развития у потомства12. Эта доклиническая модель демонстрирует причинно-следственную связь между СГБ-индуцированным воспалением плаценты и рядом специфических для пола нарушений развития нервной системы у потомства 13,14,15. Цель данной статьи – дать читателям представление о разработке доклинической модели инфекции в конце гестационного периода и вызванных ею нейроповеденческих нарушений у потомства. Настоящий протокол направлен на имитацию клинической реальности хориоамнионита, вызванного СГБ.

Результаты этой доклинической модели показывают, что внутрибрюшинная (IP) инокуляция СГБ в конце гестационной беременности (рис. 1) приводит к (i) плацентарной инфекции и воспалению, удовлетворяя диагностическим критериям хориоамнионита16; (ii) массивная апрегуляция IL-1β и последующих воспалительных молекул из пути IL-1 в плаценте12; (iii) нарушения развития нервной системы у потомства12; (iv) половые различия в иммунных реакциях и последующие нейроповеденческие нарушения, такие как признаки СДВГ у взрослых особей, в то время как у потомства мужского пола наблюдаются ранние и длительные черты, подобные РАС; (v) различные нейроповеденческие исходы у потомства в зависимости от серотипа СГБ, используемого для индуцирования хориоамнионита 14,15. В соответствии с этими выводами, основными следующими шагами с использованием этой модели будут проверка, во-первых, роль андрогена в хориоамнионите, вызванном СГБ, и, во-вторых, плацентарная и нейропротекторная роль молекул, нацеленных на конкретные воспалительные пути, в надежде довести некоторые из этих молекул до порога терапевтических клинических испытаний.

протокол

Все эксперименты были одобрены Научно-исследовательским институтом Центра здоровья Университета Макгилла (RI-MUHC). Все эксперименты проводились в соответствии с данными Канадского совета по уходу за животными.

1. Беременные крысы Льюиса

  1. Получите крыс Льюиса из коммерческих источников на день беременности (G)14. Содержать их в соответствующем помещении для содержания животных (RI-MUHC animal facility) в контролируемой среде при температуре 20-23 °C с 12-часовым циклом света/темноты и доступом к воде и пище в неограниченном количестве.
  2. Ежедневно взвешивайте дамбы, чтобы выявить любые проявления болезни с G14 (т.е. день прибытия) до G22 (т.е. день кесарева сечения)

2. Рост бактерий

  1. На G18 приготовьте две стерильные пробирки с 5 мл стерильного бульона Brain Heart Infusion (BHI). Возьмите небольшую порцию замороженного бактериального запаса (β-гемолитический капсульный серотип Ia в BHI и 15% глицерина14) при температуре -80 °C и добавьте его в пробирки BHI объемом 5 мл (рис. 2).
  2. Поместите трубки в шейкер (240 об/мин) на 18 часов при температуре 37 °C.
  3. На G19 приготовьте 3% раствор GBS в стерильном бульоне BHI, собрав 1,5 мл инкубированного раствора в 48,5 мл стерильного бульона BHI.
  4. Соберите 1,5 мл 3% раствора GBS плюс BHI в кювету. С помощью спектрофотометра запишите начальное поглощение как T0 (оптическая плотность (OD) 600 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для балансировки спектрофотометра каждый раз использовалась заготовка, изготовленная из стерильного бульона BHI.
  5. Поместите 3% раствор в инкубатор при температуре 37 °C и встряхивайте со скоростью 240 об/мин в течение примерно 2 ч. Проверяйте абсорбцию каждые 20 мин через 2 ч до тех пор, пока не будет достигнута мера абсорбции от 0,6 до 0,8 (наружный диаметр600 нм).
  6. После достижения желаемой абсорбции соберите 20 мл 3% раствора GBS плюс BHI и добавьте его в пробирку объемом 50 мл.
  7. Центрифугируйте (1792 x g) образцы при 4 °C в течение 13 мин и дважды промойте осажденный GBS 20 мл 0,9% стерильного физиологического раствора.
  8. Суспендировать осажденный СГБ в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора. Держите эту аликвоту на льду до момента инъекции.
  9. Вводите (внутрибрюшинно) контрольной группе 100 мкл стерильного 0,9% физиологического раствора и группе СГБ 100 мкл β-гемолитического серотипа Ia СГБ, суспендированного в стерильном 0,9% физрастворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводимая доза составляла 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) СГБ или физиологического раствора (для контроля). Инокуляция 108КОЕ хорошо зарекомендовала себя в качестве модели хориоамнионита человека. Инокуляция более высокой дозой СГБ, скорее всего, приведет к гибели самок. Инъекция меньше указанной дозы не будет имитировать инфекцию и воспаление.
  10. Сделайте разведения от 10-5 до 10-10 и нанесите разведения в трех размерах на пластины агара BHI. Чтобы исключить загрязнение, проведите два отрицательных контроля (без добавления вещества), один на агаровой пластине BHI, а другой на агаровой пластине CHROMID Strepto B. Сделайте два положительных контроля, поместив подготовленные бактерии на агаровую пластину BHI и агаровую пластину CHROMID Strepto B. Поместите все тарелки в инкубатор на ночь при температуре 37 °C (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агаровые пластины CHROMID Strepto B являются селективной средой для скрининга СГБ, на котором колонии СГБ выглядят красными.

3. Техника инъекций

  1. На G19 аккуратно выньте крысу из клетки и положите ее на ровную поверхность. Обездвижите крысу, накрыв голову и верхнюю часть тела полотенцем. Поднимите заднюю ногу, чтобы обеспечить легкий доступ к месту инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что подходящая анатомическая область для инъекции находится в нижнем правом квадранте брюшной полости, чтобы избежать прокола таких органов, как мочевой пузырь и слепая кишка (Рисунок 1).
  2. Используйте инсулиновый шприц U-100 с иглой 29 г 1/2 дюйма. Вставьте скос иглы вверх по направлению к головке под углом 40-45° к горизонтали, как показано на рисунке 1. Выполните инъекции GBS один раз для каждой плотины. Обязательно выполняйте инъекции каждые 1 ч, чтобы избежать эффекта времени между привитыми плотинами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции следует варьировать между левой и правой сторонами в дни, когда выполняется более одной инъекции в день.

4. Определение дозы

  1. На G20 проверьте четыре контрольных элемента (шаг 10.2) и подсчитайте колонии бактерий на каждой агаровой пластине BHI.
  2. Рассчитайте среднее количество колоний СГБ для каждого фактора разведения (от 10-5 до 10-10), чтобы определить точную введенную дозу СГБ

5. Кесарево сечение и забор тканей

  1. Выполните кесарево сечение на G22 (через 72 ч после инъекции) и выполняйте последующие операции с интервалом 1 ч между плотинами в зависимости от времени прививки каждой плотины.
  2. Обезболить даму в камере эвтаназии 2% изофлураном и 1,5%О2 для общей анестезии.
  3. Поместите коффердам на грелку, покрытую соответствующей хирургической повязкой, и нанесите офтальмологическую мазь на глаз, чтобы избежать высыхания.
  4. Подготовьте операционную зону, удалив волосы в нижней части живота с помощью лезвия или скальпеля.
  5. Очистите операционную область стерильной марлей, смоченной дезинфицирующим средством.
  6. С помощью стерильного скальпеля и ножниц с тонким наконечником сделайте горизонтальный разрез в нижней части живота крысы. Сделайте вертикальный разрез по обе стороны живота, чтобы выявить нижележащие органы.
  7. Отделите образцы плаценты от плодов. Запишите вес плода, плаценты и соотношение плода и плаценты.
  8. С помощью стерильного скальпеля разрежьте плаценту на две половинки.
    1. Используйте 2-метилбутан для быстрой заморозки половины плаценты и поддерживайте при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется для определения уровня белка с помощью иммуноферментного анализа.
    2. Зафиксировать вторую половину плаценты в 4% буферном формальдегиде для анализа in situ с помощью иммуногистохимии (ИГХ) для изучения экспрессии СГБ и полиморфноядерных клеток (ПМН) в собранных плацентах.
  9. Обезглавливайте для сбора крови из живых плодов и переноса крови в пробирки-сепараторы с гелем лития и гепарина.
  10. Центрифуга (18 928 x g) выводит образцы крови при температуре 4 °C для отделения плазмы и хранит образцы плазмы при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные образцы плазмы крови плода будут использоваться для ИФА для проверки уровня белка различных цитокинов в крови плода.
  11. Соберите хвосты плода для определения пола плода путем амплификации последовательности в гене SRY с использованием следующих праймеров (прямой праймер: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; обратный праймер: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'), как описано ранее18.
  12. С помощью иглы 5 мл 23 G соберите кровь из плотины с помощью пункции сердца, чтобы проверить и сравнить уровни различных цитокинов в крови матери с таковыми в крови плода. Усыпляют плотины методом прокола диафрагмы и обезглавливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Между животными очистите все используемые инструменты стерильной тканью и стерильным физиологическим раствором. Для проведения невропатологических и поведенческих исследований на потомстве, самки естественным образом рожали G23. После усыпления потомства на 80-й день после рождения (ПН) был собран мозг для молекулярных и гистологических исследований.

Результаты

Инокуляция IP-инфекции СГБ привела к плацентарной инфекции
Иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) (с использованием поликлональных антител, нацеленных на СГБ серотипа Ia) показало, что инфекция СГБ достигла децидуального компартмента плаценты. Инфекция та...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Несколько этапов протокола имеют решающее значение и требуют некоторого контроля качества. Например, существует риск заражения популяции СГБ другими патогенами. Это может быть быстро идентифицировано с помощью соответствующ?...

Раскрытие информации

У авторов отсутствует финансовый конфликт интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Научно-исследовательским институтом Центра здоровья Университета Макгилла (RI-MUHC), Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR). Это исследование стало возможным благодаря следующим финансирующим агентствам, учреждениям и фондам: Канадскому институту исследований в области здравоохранения (CIHR), Фонду звезд, Фонду исследований Квебека (FRQS), Университету Макгилла и Шербрукскому университету. Большое спасибо доктору Клэр Пойарт из Университета Дени Дидро (Париж VII), Франция, и доктору Мариэле Сегура из Университета Монреаля, Канада, за щедрые пожертвования GBS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL sterile tubeBD Biosciences
50 ml falcon tubesThermo Fisher339652
Blade or scalpelBD Medical371716
Brain Heart Infusion BrothCriterion (Hardy diagnostics)C5141
CHROMID Strepto B agar plateBioMerieux, Saint-Laurent43461
Columbia blood agar 5 % with sheep blood mediumThermo ScientificR01215
Forward primer5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'Sigma
Insulin syringeBecton, Dickinson and Co(BD)324702
Lewis ratsCharles River Laboratories
MethylbutanSigma AldrichM32631
Microtainer blood collection tubesBecton, Dickinson and Co(BD)365965
Reverse primer5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'Sigma
Serological Pipettes 1 MLThermo Fisher170353N
Serological Pipettes 10 MLThermo Fisher170356N
Serological Pipettes 25 MLThermo Fisher170357N
Serological Pipettes 5 MLThermo Fisher170355N
Superfrost Plus Micro Slide, PremiumVWRCA48311-703

Ссылки

  1. Hui, C. W., et al. Prenatal immune challenge in mice leads to partly sex-dependent behavioral, microglial, and molecular abnormalities associated with schizophrenia. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 13 (2018).
  2. Costa, A., et al. Activation of the NLRP3 inflammasome by group B streptococci. Journal of Immunology. 188 (4), 1953-1960 (2012).
  3. Gupta, R., et al. RNA and beta-hemolysin of group B Streptococcus induce interleukin-1beta (IL-1beta) by activating NLRP3 inflammasomes in mouse macrophages. Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 13701-13705 (2014).
  4. Henneke, P., et al. Lipoproteins are critical TLR2 activating toxins in group B streptococcal sepsis. Journal of Immunology. 180 (9), 6149-6158 (2008).
  5. Nelson, K. B., Chang, T. Is cerebral palsy preventable. Current Opinion in Neurology. 21 (2), 129-135 (2008).
  6. Larsen, J. W., Sever, J. L. Group B Streptococcus and pregnancy: a review. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (4), 440-448 (2008).
  7. Patras, K. A., Nizet, V. Group B Streptococcal maternal colonization and neonatal disease: molecular mechanisms and preventative approaches. Frontiers in Pediatrics. 6, 27 (2018).
  8. Tita, A. T., Andrews, W. W. Diagnosis and management of clinical chorioamnionitis. Clinics in Perinatology. 37 (2), 339-354 (2010).
  9. Teatero, S., et al. Serotype distribution, population structure, and antimicrobial resistance of Group B Streptococcus strains recovered from colonized pregnant women. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 412-422 (2017).
  10. Lu, B., et al. Microbiological and clinical characteristics of Group B Streptococcus isolatescausing materno-neonatal infections: high prevalence of CC17/PI-1 and PI-2b sublineage in neonatal infections. Journal of Medical Microbiology. 67 (11), 1551-1559 (2018).
  11. Limperopoulos, C., et al. Positive screening for autism in ex-preterm infants: prevalence and risk factors. Pediatrics. 121 (4), 758-765 (2008).
  12. Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic-like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Developmental Neuroscience. 35 (6), 504-515 (2013).
  13. Giraud, A., et al. Ampicillin treatment increases placental Interleukin-1 beta concentration and polymorphonuclear infiltration in Group B Streptococcus-induced chorioamnionitis: A preclinical study. Neonatology. 117 (3), 369-373 (2020).
  14. Allard, M. J., et al. A sexually dichotomous, autistic-like phenotype is induced by Group B Streptococcus maternofetal immune activation. Autism Research. 10 (2), 233-245 (2017).
  15. Allard, M. J., Giraud, A., Segura, M., Sebire, G. Sex-specific maternofetal innate immune responses triggered by group B Streptococci. Scientific Reports. 9 (1), 8587 (2019).
  16. Allard, M. J., Brochu, M. E., Bergeron, J. D., Segura, M., Sebire, G. Causal role of group B Streptococcus-induced acute chorioamnionitis in intrauterine growth retardation and cerebral palsy-like impairments. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 10 (5), 595-602 (2019).
  17. Girard, S., Tremblay, L., Lepage, M., Sebire, G. IL-1 receptor antagonist protects against placental and neurodevelopmental defects induced by maternal inflammation. Journal of Immunology. 184 (7), 3997-4005 (2010).
  18. Bergeron, J., et al. Activation of the IL-1beta/CXCL1/MMP-10 axis in chorioamnionitis induced by inactivated Group B Streptococcus. Placenta. 47, 116-123 (2016).
  19. Allard, M. J., Brochu, M. E., Bergeron, J. D., Sebire, G. Hyperactive behavior in female rats in utero-exposed to group B Streptococcus-induced inflammation. International Journal of Developmental Neuroscience. 69, 17-22 (2018).
  20. Shuster, K. A., et al. Naturally occurring disseminated group B streptococcus infections in postnatal rats. Comparative Medicine. 63 (1), 55-61 (2013).
  21. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  22. Noble, K., et al. Group B Streptococcus cpsE is required for Serotype V capsule production and aids in biofilm formation and ascending infection of the reproductive tract during pregnancy. ACS Infectious Diseases. 7 (9), 2686-2696 (2021).
  23. Kim, C. J., et al. Acute chorioamnionitis and funisitis: definition, pathologic features, and clinical significance. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213, 29-52 (2015).
  24. Becker, K. J. Strain-related differences in the immune response: Relevance to human stroke. Translational Stroke Research. 7 (4), 303-312 (2016).
  25. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  26. Fernandez de Cossio, L., Guzman, A., vander Veldt, S., Luheshi, G. N. Prenatal infection leads to ASD-like behavior and altered synaptic pruning in the mouse offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 88-98 (2017).
  27. Shi, L., Fatemi, S. H., Sidwell, R. W., Patterson, P. H. Maternal influenza infection causes marked behavioral and pharmacological changes in the offspring. The Journal of Neuroscience. 23 (1), 297-302 (2003).
  28. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  29. Girard, S., Kadhim, H., Beaudet, N., Sarret, P., Sebire, G. Developmental motor deficits induced by combined fetal exposure to lipopolysaccharide and early neonatal hypoxia/ischemia: a novel animal model for cerebral palsy in very premature infants. Neuroscience. 158 (2), 673-682 (2009).
  30. Meyer, U., Feldon, J. To poly(I:C) or not to poly(I:C): advancing preclinical schizophrenia research through the use of prenatal immune activation models. Neuropharmacology. 62 (3), 1308-1321 (2012).
  31. Lammert, C. R., Lukens, J. R. Modeling autism-related disorders in mice with Maternal Immune Activation (MIA). Methods. Journal of Molecular Biology. 1960, 227-236 (2019).
  32. Gundling, W. E., Wildman, D. E. A review of inter- and intraspecific variation in the eutherian placenta. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 370 (1663), 20140072 (2015).
  33. Harrell, M. I., et al. Exploring the pregnant guinea pig as a model for Group B Streptococcus intrauterine infection. The Journal of Infectious Diseases. 2 (2), (2017).
  34. Redline, R. W. Classification of placental lesions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213, 21-28 (2015).
  35. Erez, O., et al. Differential expression pattern of genes encoding for anti-microbial peptides in the fetal membranes of patients with spontaneous preterm labor and intact membranes and those with preterm prelabor rupture of the membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 22 (12), 1103-1115 (2009).
  36. Burns, C., Hall, S. T., Smith, R., Blackwell, C. Cytokine levels in late pregnancy: Are female infants better protected against inflammation. Frontiers in Immunology. 6, 318 (2015).
  37. Elsmen, E., Ley, D., Cilio, C. M., Hansen-Pupp, I., Hellstrom-Westas, L. Umbilical cord levels of interleukin-1 receptor antagonist and neonatal outcome. Biology of the Neonate. 89 (4), 220-226 (2006).
  38. Chuang, K. H., et al. Neutropenia with impaired host defense against microbial infection in mice lacking androgen receptor. Journal of Experimental Medicine. 206 (5), 1181-1199 (2009).
  39. Mantalaris, A., et al. Localization of androgen receptor expression in human bone marrow. The Journal of Pathology. 193 (3), 361-366 (2001).
  40. Rasmussen, J. M., et al. Maternal Interleukin-6 concentration during pregnancy is associated with variation in frontolimbic white matter and cognitive development in early life. Neuroimage. 185, 825-835 (2019).
  41. Dozmorov, M. G., et al. Associations between maternal cytokine levels during gestation and measures of child cognitive abilities and executive functioning. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 390-397 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены