Taglio cesareo di un modello animale preclinico di corioamnionite scatenata da streptococco di gruppo B (GBS)

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un modello animale preclinico di corioamnionite indotta da streptococco di gruppo B (GBS). Lo studio è progettato per indagare i processi meccanicistici, i potenziali legami causali con i disturbi dello sviluppo e, infine, per sviluppare trattamenti traslazionali antinfiammatori placento e neuroprotettivi.

Abstract

Lo streptococco di gruppo B (GBS) è uno dei batteri più comuni isolati durante la gravidanza umana. È una delle principali cause di infezione/infiammazione della placenta, chiamata corioamnionite. La corioamnionite espone il feto in via di sviluppo a un alto rischio di lesioni d'organo, morbilità perinatale e mortalità, nonché a menomazioni neurocomportamentali per tutta la vita e altri problemi di sviluppo non neurologici. I due sottotipi più frequenti di isolati di GBS da tessuti materni e fetali sono i sierotipi Ia (13%-23%) e III (25%-53%). Il nostro laboratorio ha sviluppato e caratterizzato un modello di corioamnionite indotta da GBS per studiare i successivi impatti sul sistema nervoso centrale del feto in via di sviluppo e per comprendere gli aspetti meccanicistici sottostanti. Questo articolo presenta il design e gli usi del modello preclinico di ratto, che riproduce fedelmente il segno distintivo della corioamnionite indotta da GBS nell'uomo. Questo articolo ha lo scopo di aiutare gli scienziati a riprodurre il progetto sperimentale e di fornire supporto attraverso esempi di risoluzione dei problemi. Il presente modello può anche contribuire a potenziali scoperte attraverso la scoperta di cause, meccanismi e nuove vie terapeutiche, che rimangono incerte in molte menomazioni dello sviluppo derivanti dalla corioamnionite. Inoltre, l'uso di questo modello può essere esteso agli studi delle morbilità perinatali non neurologiche comuni e gravi che interessano, ad esempio, la retina, l'intestino, il polmone e il rene. L'interesse principale di questa ricerca è nel campo delle menomazioni dello sviluppo neurologico fetale indotte da GBS come la paralisi cerebrale (CP), il disturbo da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) e il disturbo dello spettro autistico (ASD). La logica a sostegno di questo modello è presentata in questo articolo, seguita da procedure e risultati.

Introduzione

L'attivazione immunitaria materna (MIA) è stata descritta come uno dei fattori di rischio indipendenti più critici per la nascita prematura, la morte fetale e i disturbi cognitivi e comportamentali permanenti nella progenie 1,2,3,4. Gran parte della ricerca preclinica esistente sul ruolo dell'infiammazione gestazionale sulla placenta e sugli esiti dello sviluppo utilizza componenti patogeni, come il lipopolisaccaride (LPS) di E. coli e l'analogo sintetico dell'RNA virale a doppio filamento, la poliinosinica: acido policitidilico (Poly[I: C]), che imitano le infezioni virali. Tuttavia, anche se lo streptococco di gruppo B (GBS) è la causa più frequente di infezione perinatale, pochi modelli animali hanno affrontato il suo ruolo nei meccanismi infiammatori in gioco e gli esiti⁵.

GBS è un cocco gram-positivo incapsulato che colonizza il tratto genitale inferiore in circa il 15%-30% delle donne in gravidanza⁶. Porta a infezione/infiammazione della placenta, chiamata corioamnionite ^7,8. Dei dieci sierotipi GBS, i due sierotipi più frequenti Ia e III sono i principali determinanti infettivi delle lesioni nei tessuti maternofetali ^9,10. È stato dimostrato che l'infezione da GBS porta a una maggiore risposta infiammatoria nel sangue fetale e nella carenza placentare, che sono altamente sospettati di essere coinvolti in molteplici disturbi dello sviluppo neurologico come la paralisi cerebrale (CP), il disturbo da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) e il disturbo dello spettro autistico (ASD)^5,11.

Negli ultimi dieci anni, abbiamo sviluppato un modello di ratto di corioamnionite indotta da GBS che porta a vari disturbi dello sviluppo nella prole¹². Questo modello preclinico dimostra il nesso causale tra l'infiammazione placentare indotta da GBS e una serie di disturbi dello sviluppo neurologico specifici del sesso nella prole 13,14,15. L'obiettivo di questo articolo è fornire ai lettori informazioni sulla progettazione di un modello preclinico di ratto di infezione di fine gestazionale e conseguenti menomazioni neuro-comportamentali nella prole. Il presente protocollo mira a imitare la realtà clinica della corioamnionite indotta da GBS.

I risultati di questo modello preclinico mostrano che l'inoculazione intraperitoneale (IP) di fine gestazionale (Figura 1) di GBS porta a (i) infezione e infiammazione placentare, soddisfacendo i criteri diagnostici della corioamnionite¹⁶; (ii) una massiccia sovraregolazione di IL-1β e delle molecole infiammatorie a valle della via IL-1, all'interno della placenta¹²; (iii) disturbi dello sviluppo neurologico nella prole¹²; (iv) differenze di sesso nelle risposte immunitarie e conseguenti menomazioni neurocomportamentali, come la prole femminile che presenta tratti adulti simili all'ADHD mentre la prole maschile presenta tratti simili all'ASD ad esordio precoce e di lunga durata; (v) esiti neurocomportamentali distinti nella progenie a seconda del sierotipo GBS utilizzato per indurre la corioamnionite^14,15. In linea con questi risultati, i principali passi successivi utilizzando questo modello saranno quelli di testare, in primo luogo, il ruolo degli androgeni nella corioamnionite indotta da GBS e, in secondo luogo, il ruolo placentare e neuro-protettivo di molecole che prendono di mira specifiche vie infiammatorie, nella speranza di portare alcune di queste molecole alla soglia degli studi clinici terapeutici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Istituto di ricerca del McGill University Health Centre (RI-MUHC). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Canadian Council on Animal Care.

1. Ratti Lewis gravidi

1. Ottenere ratti Lewis da fonti commerciali al giorno gestazionale (G)14. Ospitarli in un'adeguata struttura per animali (RI-MUHC animal facility) in un ambiente controllato a 20-23 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore e accesso all'acqua e al cibo ad libitum¹⁷.
2. Pesare le dighe ogni giorno per rilevare qualsiasi comportamento di malattia dal G14 (cioè il giorno dell'arrivo) fino al G22 (cioè il giorno del taglio cesareo)

2. Crescita batterica

1. Su G18, preparare due provette sterili con 5 ml di brodo sterile di Brain Heart Infusion (BHI). Prelevare una piccola porzione di stock batterico congelato (sierotipo capsulare β-emolitico Ia in BHI e 15% di glicerolo¹⁴) da -80 °C e aggiungerlo in provette BHI da 5 ml (Figura 2).
2. Mettere le provette nell'agitatore (240 giri/min) per 18 ore a 37 °C.
3. Su G19, preparare una soluzione al 3% di GBS in brodo BHI sterile raccogliendo 1,5 mL della soluzione incubata in 48,5 mL di brodo BHI sterile.
4. Raccogliere 1,5 ml della soluzione al 3% di GBS più BHI in una cuvetta. Utilizzando uno spettrofotometro, registrare l'assorbimento iniziale come T₀ (densità ottica (OD) _{600 nm}).
   NOTA: Ogni volta è stato utilizzato un grezzo realizzato con brodo BHI sterile per bilanciare lo spettrofotometro.
5. Porre la soluzione al 3% nell'incubatore a 37 °C agitando 240 giri/min per circa 2 ore. Controllare l'assorbimento ogni 20 minuti dopo 2 ore fino a raggiungere una misura di assorbanza compresa tra 0,6 e 0,8 (OD_{600 nm}).
6. Dopo aver raggiunto l'assorbanza desiderata, raccogliere 20 mL di soluzione al 3% di GBS più BHI e aggiungerla a una provetta da 50 mL.
7. Centrifugare (1792 x g) i campioni a 4 °C per 13 minuti e lavare due volte il GBS precipitato con 20 mL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.
8. Sospendere il GBS precipitato in 2 mL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9%. Conservare questa aliquota in ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
9. Iniettare (per via intraperitoneale) il gruppo di controllo con 100 μL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% e il gruppo GBS con 100 μL di sierotipo β-emolitico Ia GBS sospeso in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.
   NOTA: La dose iniettata era di 10⁸ unità formanti colonie (CFU) di GBS o soluzione salina (per il controllo). L'inoculazione di^10-8 CFU è stata ben consolidata come modello di corioamnionite umana. L'inoculazione con una dose più elevata di GBS causerà probabilmente la mortalità della diga. L'iniezione di una dose inferiore a quella menzionata non imiterà l'infezione e l'infiammazione.
10. Effettuare diluizioni tra ^10-5 e ^10-10 e impiattare le diluizioni in triplicato su piastre di agar BHI. Per escludere contaminazioni, effettuare due controlli negativi (senza alcuna aggiunta di sostanza), uno su una piastra di agar BHI e l'altro su una piastra di agar CHROMID Strepto B. Effettuare due controlli positivi impiattando i batteri preparati sulla piastra di agar BHI e sulla piastra di agar CHROMID Strepto B. Mettere tutte le piastre nell'incubatore per una notte a 37 °C (Figura 3).
    NOTA: Le piastre di agar CHROMID Strepto B sono un terreno selettivo per lo screening di GBS su cui le colonie di GBS appaiono rosse.

3. Tecnica di iniezione

1. Su G19, rimuovere delicatamente il ratto dalla gabbia e posizionarlo su una superficie piana. Immobilizza il ratto usando un asciugamano per coprire la testa e la parte superiore del corpo. Sollevare la zampa posteriore per consentire un facile accesso al sito di iniezione.
   NOTA: Assicurarsi che l'area anatomica appropriata per l'iniezione si trovi nel quadrante inferiore destro dell'addome per evitare la puntura di organi come la vescica urinaria e il cieco (Figura 1).
2. Utilizzare una siringa da insulina U-100 con un ago da 29 G 1/2 pollice. Inserire lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto verso la testa con un angolo di 40-45° rispetto all'orizzontale, come mostrato nella Figura 1. Eseguire iniezioni GBS una volta per ogni diga. Assicurati di eseguire iniezioni ogni 1 ora per evitare un effetto tempo tra le dighe inoculate.
   NOTA: Le iniezioni devono essere variate tra il lato sinistro e quello destro nei giorni in cui viene eseguita più di un'iniezione al giorno.

4. Determinazione della dose

1. Su G20, verificare quattro controlli (passaggio 10.2) e contare le colonie batteriche su ciascuna piastra di agar BHI.
2. Calcolare le colonie medie di GBS per ciascun fattore di diluizione (da ^10-5 a ^10-10) per determinare l'esatta dose iniettata di GBS

5. Taglio cesareo e prelievo dei tessuti

1. Eseguire tagli cesarei su G22 (72 ore dopo l'iniezione) ed eseguire successivi interventi chirurgici con 1 ora tra le dighe in base al tempo di inoculazione di ciascuna madre.
2. Anestetizzare la diga in una camera di eutanasia con isoflurano al 2% e O₂ all'1,5_{%, per} l'anestesia generale.
3. Posizionare la diga su un termoforo coperto con un'apposita medicazione chirurgica e applicare l'unguento oftalmico sull'occhio per evitare che si secchi.
4. Preparare l'area chirurgica rimuovendo i peli dalla zona addominale inferiore utilizzando una lama o un bisturi.
5. Pulire l'area chirurgica con una garza sterile imbevuta di disinfettante.
6. Usando un bisturi sterile e forbici a punta fine, praticare un'incisione orizzontale nell'addome inferiore del ratto. Fai un'incisione verticale su entrambi i lati dell'addome per rivelare gli organi sottostanti.
7. Separare i campioni di placenta dai feti. Registra il peso dei feti, delle placente e il rapporto feto/placenta.
8. Usando un bisturi sterile, taglia la placenta in due metà.
   1. Utilizzare il 2-metilbutano per congelare rapidamente metà della placenta e mantenerla a -80 °C fino a quando non è necessario per la determinazione dei livelli proteici mediante ELISA.
   2. Fissare l'altra metà della placenta in formaldeide tamponata al 4% per l'analisi in situ mediante immunoistochimica (IHC) per studiare l'espressione di GBS e cellule polimorfonucleate (PMN) nelle placente raccolte.
9. Decapitare per raccogliere il sangue dai feti vivi e trasferire il sangue nelle provette separatori di gel di litio eparina.
10. Centrifugare campioni di sangue (18.928 x g) a 4 °C per separare il plasma e conservare i campioni di plasma a -80 °C fino a ulteriori analisi.
    NOTA: I campioni di plasma sanguigno fetale raccolti verranno utilizzati per l'ELISA per controllare i livelli proteici di diverse citochine nel sangue del feto.
11. Raccogliere le code fetali per determinare il sesso dei feti mediante amplificazione di una sequenza all'interno del gene SRY, utilizzando i seguenti primer (primer in avanti: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; primer inverso: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3') come descritto in precedenza¹⁸.
12. Utilizzando un ago da 5 ml da 23 G, prelevare il sangue dalla diga mediante puntura cardiaca per controllare e confrontare i livelli proteici di diverse citochine nel sangue della diga con quelli nel sangue fetale. Eutanasia delle dighe mediante puntura del diaframma e metodo di decapitazione.
    NOTA: Tra un animale e l'altro, pulire tutti gli strumenti usati con fazzoletto sterile e soluzione fisiologica sterile. Per eseguire studi neuropatologici e comportamentali nella progenie, le madri hanno partorito naturalmente il G23. Dopo l'eutanasia della prole il giorno postnatale (PN) 80, i cervelli sono stati raccolti per studi molecolari e istologici.

Risultati

L'inoculazione IP di GBS ha provocato un'infezione placentare
La colorazione con immunoistochimica (IHC) (utilizzando anticorpi policlonali che hanno come bersaglio il sierotipo Ia di GBS) ha dimostrato che l'infezione da GBS ha raggiunto il compartimento deciduale della placenta. L'infezione si è diffusa anche dalla decidua al labirinto, alla placca corionica e, in alcuni casi, ai feti, portando alla morte fetale (5,8 ± 0,8 nei GBS esposti rispetto a 9,3 ± 0,6 cuc...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Diversi passaggi del protocollo sono critici e richiedono alcuni controlli di qualità. Ad esempio, esiste il rischio di contaminazione dello stock GBS da parte di altri agenti patogeni. Questo può essere rapidamente identificato utilizzando la tecnica appropriata di identificazione microbica GBS, come l'aspetto della colonia su agar BHI (ad esempio, dimensioni, forma, colore), la placcatura in duplicato della dose di GBS β-emolitico ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL sterile tube	BD Biosciences
50 ml falcon tubes	Thermo Fisher	339652
Blade or scalpel	BD Medical	371716
Brain Heart Infusion Broth	Criterion (Hardy diagnostics)	C5141
CHROMID Strepto B agar plate	BioMerieux, Saint-Laurent	43461
Columbia blood agar 5 % with sheep blood medium	Thermo Scientific	R01215
Forward primer	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'	Sigma
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Co(BD)	324702
Lewis rats	Charles River Laboratories
Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631
Microtainer blood collection tubes	Becton, Dickinson and Co(BD)	365965
Reverse primer	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'	Sigma
Serological Pipettes 1 ML	Thermo Fisher	170353N
Serological Pipettes 10 ML	Thermo Fisher	170356N
Serological Pipettes 25 ML	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ML	Thermo Fisher	170355N
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