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摘要

本协议描述了一种增强的方法，以增加PDX1和NKX6.1转录因子在平面单层中源自人多能干细胞（hPSC）的胰腺祖细胞中的共表达。这是通过补充新鲜基质、操纵细胞密度和解离内胚层细胞来实现的。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）是研究早期胰腺发育和研究糖尿病遗传因素的绝佳工具。hPSC衍生的胰岛素分泌细胞可以产生用于细胞治疗和疾病建模，然而，其效率和功能特性有限。hPSC 来源的胰腺祖细胞是 β 细胞和其他内分泌细胞的前体，当共表达两种转录因子 PDX1 和 NKX6.1 时，在 体外 和 体内指定功能性胰岛素分泌 β 细胞的祖细胞。hPSC来源的胰腺祖细胞目前用于1型糖尿病患者的细胞治疗，作为临床试验的一部分。然而，目前的程序不能产生高比例的NKX6.1和胰腺祖细胞，导致无功能内分泌细胞的共同生成和很少的葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞。因此，这项工作开发了一种增强的方案，用于生成hPSC衍生的胰腺祖细胞，该方案最大限度地提高PDX1和NKX6.1在2D单层中的共表达。细胞密度、新鲜基质的可用性和hPSC来源的内胚层细胞的解离等因素被调节，以增加生成的胰腺祖细胞中的PDX1和NKX6.1水平，并最大限度地减少对替代肝谱系的承诺。该研究强调，在 体外 分化过程中操纵细胞的物理环境会影响谱系规范和基因表达。因此，当前优化的方案有助于PDX1和NKX6.1共表达祖细胞的可扩展生成，用于细胞治疗和疾病建模。

引言

糖尿病是一种复杂的代谢紊乱，影响着全球数百万人。补充胰岛素被认为是糖尿病的唯一治疗选择。更晚期的病例用β细胞替代疗法治疗，通过移植整个尸体胰腺或胰岛1，2来实现。围绕移植治疗的几个问题，例如组织的可用性和质量的限制，移植程序的侵入性以及对免疫抑制剂的持续需求。这就需要发现β细胞替代疗法的新颖和替代选择2，3。人类多能干细胞（hPSCs）最近已成为了解人类胰腺生物学的有前途的工具，并且是移植治疗的非详尽且可能更个性化的来源4，5，6，7。hPSC，包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），具有很高的自我更新能力，并产生人体的任何组织类型。hESC来源于胚胎的内部细胞团，hiPSCs从任何体细胞4，8重新编程。

定向分化方案经过优化，可从 hPSC 生成胰腺 β 细胞，这些 hPSC 依次引导 hPSC 通过胰腺发育阶段体外。这些方案产生hPSC衍生的胰岛类器官。虽然它们在增加胰腺β细胞的比例方面有了很大的改善，但方案的效率是高度可变的。它不会增加到NKX6.1 + / INSULIN +或C-PEPTIDE +细胞5，9，10，11，12，13的~40%。然而，生成的β细胞在转录和代谢谱以及对葡萄糖4，5，14的反应方面与成人β细胞并不完全相同。与成人胰岛相比，hPSC 衍生的 β 细胞缺乏关键 β 细胞标记物（如 PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2 和 KCNK3）的基因表达5。此外，hPSC衍生的β细胞响应葡萄糖的钙信号传导减弱。它们被共同生成的多激素细胞污染，这些细胞不会分泌适量的胰岛素以响应葡萄糖水平的增加5。另一方面，与β细胞相比，hPSC衍生的胰腺祖细胞（胰岛前体）可以在体外更有效地产生，并且在体内移植时，可以成熟为功能性的胰岛素分泌β细胞15，16。临床试验目前集中在证明其在T1D受试者移植时的安全性和有效性。

值得注意的是，转录因子PDX1（胰腺和十二指肠同源盒1）和NKX6.1（NKX6同源盒1）在同一胰腺祖细胞中的表达对于β细胞谱系5的承诺至关重要。不能表达NKX6.1的胰腺祖细胞产生多激素内分泌细胞或无功能的β细胞17，18。因此，PDX1和NKX6.1在胰腺祖细胞期的高共表达对于最终产生大量功能性β细胞至关重要。研究表明，胚体或3D培养增强了胰腺祖细胞聚集的PDX1和NKX6.1，在PDX1 + / NKX6.1 +群体的40%-80%之间变化12，19。然而，与悬浮培养相比，2D分化培养物更具成本效益，可行且便于在多个细胞系上应用5。我们最近表明，单层分化培养物产生高达90%以上的PDX1 + / NKX6.1 +共表达hPSC来源的胰腺祖细胞20，21，22。报告的方法赋予生成的胰腺祖细胞高复制能力，并防止了替代命运规范，如肝谱系21。因此，在此，该协议展示了一种将hPSCs分化为共表达PDX1和NKX6.1的胰腺β细胞前体的高效方法。该方法利用解离hPSC衍生的内胚层并操纵细胞密度的技术，然后扩展FGF和类视黄醇信号传导以及Hedgehog抑制以促进PDX1和NKX6.1共表达（图1）。该方法可以促进用于移植治疗和疾病建模的hPSC衍生胰腺β细胞前体的可扩展生成。

研究方案

该研究已获得适当的机构研究伦理委员会的批准，并按照1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的伦理标准中规定的伦理标准进行。该协议由HMC机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和卡塔尔生物医学研究所（QBRI）（编号2016-003）批准。这项工作针对H1、H9和HUES8等hESC进行了优化。血液样本是从哈马德医疗公司（HMC）医院的健康个体获得的，并得到完全知情同意。iPSCs由对照的外周血单核细胞（PBMC）产生，健康个体23。

1. 培养基的制备

  1. 制备人多能干细胞 （hPSC） 培养基
    1. 通过补充 100 单位/mL 青霉素和 100 ug/mL 链霉素，从市售培养基制备用于维持和扩增人胚胎干细胞的 hPSC 培养基（参见 材料表）。将完整的培养基分装并储存在-20°C下长期使用或4°C立即使用。
  2. 准备第 1 阶段分化培养基（用于确定性内胚层 （DE））。
    1. 通过补充 0.5% 无脂肪酸牛血清白蛋白 （FFA-BSA）、1.5 g/L 碳酸氢钠 （NaHCO3）、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，从 MCDB 131 培养基制备基础培养基（参见 材料表）。使用0.2μm过滤器过滤制备的培养基并储存在4°C。
    2. 通过在37°C下加热基础培养基，然后补充2μM的CHIR99021，100ng / mL的Activin A，10μM的Rock抑制剂（Y-27632）和0.25mM的维生素C（参见 材料表），从基础培养基（在步骤1.2.1中制备）制备含有CHIR99021的第1阶段培养基。将补充的培养基充分混合，并用铝箔覆盖以保护其免受光照。
      注意:此介质仅在分化的第一天使用。
    3. 从基础培养基中制备不含CHIR99021的Stage 1培养基，方法是在37°C下加热并补充100ng / mL的Activin A和0.25mM的维生素C并充分混合。
      注意:可以选择将 5 ng/mL 的碱性 FGF 或 FGF2 添加到该培养基中。此介质将在第 1 阶段的剩余天数内使用。
  3. 准备第 2 阶段分化培养基（用于原始肠管;PGT）。
    1. 从基础培养基中制备含有岩石抑制剂的第 2 阶段分化培养基，方法是在 37 °C 下加热并补充 50 ng/mL 的 FGF10、50 ng/mL 的 NOGGIN、0.25 μM 的 CHIR99021、10 μM 的 Y-27632（岩石抑制剂）和 0.25 mM 的维生素 C。
      注意:该培养基在内胚层细胞解离当天使用。
    2. 按照步骤1.3.1中制备的培养基的相同程序制备不含岩石抑制剂的Stage 2分化培养基，不包括岩石抑制剂。
      注:此介质在第 2 阶段的第二天使用。
  4. 准备第 3 阶段分化培养基（用于后前肠）。
    1. 制备含有 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基，然后补充 1% 的青霉素-链霉素和 2 mM 谷氨酰胺，并用作第 3 阶段和第 4 阶段的基础培养基。
    2. 加热DMEM培养基（在步骤1.4.1中制备），并补充2μM视黄酸，0.25μMSANT-1，50ng / mLFGF10，50ng / mLNOGGIN，0.25mM维生素C和1%不含维生素A的B27补充剂（参见 材料表）。
      注意:该培养基用于P2-D的第3阶段的4天（方案2，优化，解离）和第3阶段的2天用于P1-ND（方案1，未优化，非解离）。
  5. 准备第 4 阶段分化培养基（用于胰腺祖细胞）。
    1. 添加含有 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM、100 ng/mL EGF、10 mM 烟酰胺、50 ng/mL NOGGIN、0.25 mM 维生素 C 和 1% 不含维生素 A 的 B27 补充剂（见 材料表）。在第 4 阶段的所有日子里使用此介质。
      注意:将所有试剂保持在适当的温度下，所有细胞因子和敏感试剂都需要等分。解冻等分试剂并在更换分化培养基时添加到基础培养基中。不同分化培养基的组成见 表1。

2. 地下室膜基质涂层培养皿的制备

  1. 解冻市售的基质基质（见 材料表）并在冰上等分试样;在-20°C冷冻等分试样。
  2. 在涂覆组织培养皿之前，将冷冻的等分试样在冰上解冻。将适当体积的膜基质溶液添加到冷却的KO-DMEM / F-12介质（敲除DMEM / F-12）（参见 材料表）中，以达到所需的稀释浓度并充分混合。将稀释的基质溶液储存在4°C以立即使用。
  3. 用稀释的膜基质溶液覆盖组织培养处理的板（参见 材料表）的表面，并将板置于37°C至少60分钟，然后再铺板细胞。使用KO-DMEM / F-12中膜基质溶液的1:50稀释液进行胰腺分化实验的细胞铺板，使用1:80的稀释液进行未分化的hPSCs扩增。

3. 未分化 hPSC 的培养

  1. 当菌落达到70%-80%汇合时传代hPSC。
  2. 传代时，用温热的PBS洗涤hPSC一次，使用组织培养罩内的便携式真空吸引器吸出，并在PBS中加入0.5mM的EDTA溶液以覆盖菌落表面。在37°C，5%CO2 下孵育1分钟或直到菌落的边界与板表面分离。
  3. 取出EDTA溶液，并使用P1000微量移液器用hPSC培养基收集分离菌落。在室温下以128× g 离心收集的细胞4分钟。弃去上清液并用含有10μMY-27632（Rock抑制剂）的hPSC培养基补充细胞23，24。
    注意:在 1:80 膜基质包被的培养皿上以至少 1:3 的比例传代 hPSC。然而，对于分化实验，将hPSCs铺在1:50包被的培养皿上。

4. 诱导 hPSC 中的确定性内胚层 （DE） 分化（第 1 阶段）

  1. 当hPSC菌落达到70%-80%的汇合度时，用温热的PBS洗涤两次，并使用组织培养罩内的便携式真空吸引器抽吸，开始第1阶段分化。
  2. 将含有CHIR99021（来自步骤1.2.2）的第1阶段分化培养基加入菌落中，每6孔板2mL，并在37°C下孵育24小时。
  3. 第二天，用不含CHIR99021的第1阶段分化培养基替换用过的培养基（步骤1.2.3）。
  4. 每24小时，使用组织培养罩内的便携式真空抽吸器吸出用过的培养基，并用不含CHIR99021的新鲜Stage 1分化培养基替换。
    注意:第 1 阶段最多可延长 4 天。第 1 阶段的长度取决于所使用的 hPSC 细胞系，应相应地进行优化。

5. hPSC衍生DE的免疫荧光分析（第1阶段）

  1. 对于免疫荧光，使用组织培养罩内的便携式真空抽吸器从孔中吸出用过的培养基，并用温热的PBS洗涤两次。旋转板以清除任何细胞碎片。
  2. 用4%的多聚甲醛（PFA）覆盖孔表面以固定DE细胞;例如，在 24 孔板的每孔中添加 250 uL PFA。将板放在20 x g 的2D摇床上20分钟。
  3. 固定后，用含有0.5%吐温（TBST）的三缓冲盐水洗涤DE细胞（参见 材料表），并将板以20× g 放在摇床上10分钟。再次重复此步骤。
  4. 通过添加含有0.5%Triton X-100（PBST）的大量磷酸盐缓冲盐水来透化固定细胞;例如，每孔加入 1 mL PBST 的 24 孔板，并将板放回摇床上，以 20 x g 放置 20 分钟。
  5. 在PBST中新鲜制备5%-6%的BSA作为封闭缓冲液，并将其添加到透化的细胞中。将板在振荡器上的封闭溶液中孵育至少1小时。
  6. 将针对SOX17和FOXA2的一抗一起稀释（参见 材料表）在PBST溶液中的2%-3%BSA中。将组合抗体加入封闭的细胞中，并将板置于4°C的摇床上，以低速轻轻摇动过夜。
    注意:SOX17 和 FOXA2 是成熟的 DE 标记25，26。
  7. 第二天，使用便携式真空过滤器吸出一抗，并用TBST洗涤孔三次，每次在摇床上洗涤10分钟。
  8. 制备 1:500 稀释的 Alexa fluor 488 和 568- 偶联二抗（参见 材料表），以对抗产生一抗的物种。
  9. 将二抗组合添加到染色孔中，并用铝箔覆盖板以防止光照。将板放在室温下摇床上1小时。
  10. 使用便携式真空过滤器吸出二抗溶液，并在摇床上用TBST洗涤染色孔10分钟，用箔纸覆盖板。总共重复三次洗涤步骤。
  11. 在 PBS 中制备 1 μg/mL 的 Hoechst 33342 稀释液以染色细胞核。将Hoechst溶液加入孔中，并将板放在摇床上2-3分钟。
  12. 使用便携式真空过滤器吸出赫斯特溶液，并用PBS冲洗孔两次。
  13. 最后，将PBS添加到染色细胞中，并在黑暗中使用倒置荧光显微镜（参见 材料表）对其进行成像。不成像时保持板用箔纸覆盖，以尽量减少荧光团漂白。
    注意:或者，流式细胞术可用于评估DE效率，如步骤9.2中所述。

6. 从 hPSC 生成原始肠管 （PGT）（第 2 阶段）

注意:如果步骤5.13中的免疫荧光分析被确定为80%及以上的SOX17-FOXA2共表达，则实验继续进行第2阶段。如果效率为 <80%，则将第 1 阶段的持续时间延长至 4 天。

  1. 在第 2 阶段的第 1 天，使用 TrypLE 或 Accutase（参见 材料表）解离 hPSC 衍生的内胚层细胞，以获得优化的 P2-D 方案。用温热的PBS洗涤贴壁细胞，并在37°C，5%CO 2下每孔加入温热的1mL TrypLE或Accutase溶液3-5分钟， 或直到细胞开始彼此分离。
  2. 解离孔中分离的片状或单层细胞，然后使用不含含有至少0.5%胎牛血清（FBS）或敲除血清（KOSR）的细胞因子的基础1/2培养基将它们收集在15mL聚丙烯管中（参见 材料表）。
  3. 在4°C下以800× g 旋转细胞5分钟，弃去上清液。加入 1 mL 无菌 PBS 并将沉淀重悬到单个细胞中。
  4. 通过在腔室载玻片中加载推荐体积的细胞，使用自动计数器（参见 材料表）对细胞进行计数。在4°C下以800× g 旋转重悬细胞5分钟，弃去上清液。
  5. 将沉淀重悬于含有Rock抑制剂的适当体积的Stage 2分化培养基中，密度为2.5-3.5 x 105 细胞/ cm2。
    注意:对于大多数细胞系，该计数可能降至 1:2 的分裂比，具体取决于增殖速率。总体积将为 2 mL 培养基，其中重悬细胞位于 1 个 6 孔板的孔中。
  6. 将重悬的细胞接种在1:50膜基质包被的板（在步骤2中制备）上，并在培养箱中在37°C，5%CO2 下孵育它们。
  7. 24小时后，用不含岩石抑制剂的Stage 2分化培养基替换培养基（在步骤1.3.2中制备）。

7. hPSCs产生后前肠（第3阶段）

  1. 使用组织培养罩内的便携式真空吸液器吸出用过的第 2 阶段培养基，并用温热的 PBS 洗涤细胞。
  2. 将步骤1.4中的第3阶段分化培养基添加到细胞中，并在37°C，5%CO2下孵育。
  3. 24小时后，用新鲜制备的3期分化培养基替换用过的培养基。对于P2-D方案（优化），总共重复此操作4天，对于非解离的P1-ND仅重复2天。

8. 从 hPSC 产生胰腺祖细胞（第 4 阶段）

  1. 3期治疗4天后，用温热的PBS洗涤细胞，轻轻旋转板，并使用便携式真空吸液器吸出。然后，将步骤1.5中的第4阶段分化培养基添加到细胞中。
  2. 24小时后，用新鲜制备的第4阶段培养基替换用过的培养基。重复此操作总共 4 天。

9. 评估从hPSCs产生胰腺祖细胞的分化效率

  1. 对 hPSC 来源的胰腺祖细胞（第 4 阶段）进行免疫荧光分析，以表达 PDX1 和 NKX6.1。
    注意:PDX1和NKX6.1是成熟的胰腺祖细胞标志物17，18。
    1. 按照步骤5进行固定、透化、封闭和抗体孵育和洗涤。
    2. 用PDX1和NKX6.1抗体的组合（参见 材料表）对hPSC来源的胰腺祖细胞进行染色，该抗体在PBST中稀释在2%-3%BSA中。
    3. 使用1:500稀释的适当Alexa fluor 488-和568-偶联二抗（参见 材料表）。
  2. 对 hPSC 来源的胰腺祖细胞进行流式细胞术分析，以表达 PDX1 和 NKX6.1。
    注意:流式细胞术分析生成的hPSC来源胰腺祖细胞中的胰腺标志物提供了一种定量PDX1和NKX6.1共表达细胞的方法。
    1. 在第4阶段结束时，用温热的PBS洗涤细胞两次，并添加足够的TrypLE或Accutase以覆盖孔的表面，例如，每孔1mL的TrypLE或Accutase6孔板。将板放入培养箱中5-7分钟或直到细胞从表面分离。
    2. 使用 P1000 微量移液器解离孔内的贴壁细胞片，然后将其收集在 15 mL 聚丙烯管中。
    3. 在4°C下以800× g 离心hPSC来源的胰腺祖细胞中的细胞5分钟，然后弃去上清液。用PBS将细胞解离成单个细胞来洗涤细胞。使用自动计数器对细胞进行计数（参见 材料表），并记下每毫升细胞数的浓度。
    4. 在4°C下以800× g 旋转5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入 200 μL 冷藏 PBS 并解离。
    5. 滴加 2 mL 冷冻的 80% 乙醇，将试管以中低速（室温下 400 x g ）涡旋。紧紧关闭盖子，并将管子稍微倾斜放在4°C的摇床上过夜。
    6. 在4°C下以800× g 旋转细胞5分钟，并用PBS洗涤以解离任何固定细胞团块。
    7. 用PBST中的5%-6%BSA溶液封闭固定细胞在室温下或在振荡器上4°C过夜至少1小时。
    8. 按照以下步骤对胰腺祖细胞标志物进行染色。
      1. 每种条件分配 2，00，000 个细胞，包括取决于一抗宿主物种的 IgG 亚类的适当同种型对照、96 孔 V 底板或 1.5 mL 离心管中的未染色和二抗对照。
      2. 在4°C下以800× g 旋转板5分钟，并以快速运动翻转板以丢弃上清液而不会丢失沉淀。在3%BSA溶液中制备一抗稀释液（参见 材料表）。
        注意:一抗的浓度可以在1:50至1:200之间。
      3. 将染色的细胞在室温下孵育至少2小时或在4°C下在摇床上低速轻轻摇动过夜。
      4. 通过在孔中上下移液细胞，用TBST洗涤染色细胞三次。旋转并弃去上清液，如步骤9.2.8.2所示。
      5. 加入在PBS中制备的二抗（Alexa fluor 488和647偶联抗体）的1:500稀释度（参见 材料表）。在室温下孵育30分钟。
      6. 通过上下移液细胞，用TBST洗涤染色细胞至少两次。旋转板并弃去上清液，如步骤9.2.8.2所示。
      7. 将染色细胞收集在至少 100 μL PBS 中，并将其转移到防光 FACS 管中（参见 材料表）。在流式细胞仪上运行样品。

结果

结果表明，优化的方案P2-D（图1A）通过上调PDX1和NKX6.1共表达来提高胰腺祖细胞分化效率（图2A，B和图3A）。特别是，结果表明，与从先前发表的研究修改的非解离方案（P1-ND）相比，内胚层细胞的解离及其在新鲜膜基质上的重新铺板以及更长的3期持续时间增强了hPSC来源的胰腺祖细胞（优化方案，P2-D）（图

讨论

这项工作描述了一种增强的方案，用于从具有PDX1和NKX6.1高共表达的hPSC产生胰腺祖细胞。hPSC来源的内胚层在新鲜基质上以半密度解离和再铺板导致hPSC来源的胰腺祖细胞中的PDX1和NKX6.1升高。

尽管每个阶段的生长因子混合物与P1-ND27高度相似，但已经表明，包括FGF和类视黄醇信号传导以及BMP和刺猬抑制在内的更扩展的3期治疗会增加NKX6.1表达，这与Nostro等人的发?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作由卡塔尔国家研究基金（QNRF）资助（资助号）。NPRP10-1221-160041）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well culture plates, flat bottom with lidCostar3524
50 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339652
6- well culture plates, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid freeSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucoseThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Inverted microscopeOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum replacementGibco10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)SigmaA92902Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in distilled water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonateSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer automated cell counterInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

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