需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
Method Article
本协议描述了一种增强的方法,以增加PDX1和NKX6.1转录因子在平面单层中源自人多能干细胞(hPSC)的胰腺祖细胞中的共表达。这是通过补充新鲜基质、操纵细胞密度和解离内胚层细胞来实现的。
人类多能干细胞(hPSCs)是研究早期胰腺发育和研究糖尿病遗传因素的绝佳工具。hPSC衍生的胰岛素分泌细胞可以产生用于细胞治疗和疾病建模,然而,其效率和功能特性有限。hPSC 来源的胰腺祖细胞是 β 细胞和其他内分泌细胞的前体,当共表达两种转录因子 PDX1 和 NKX6.1 时,在 体外 和 体内指定功能性胰岛素分泌 β 细胞的祖细胞。hPSC来源的胰腺祖细胞目前用于1型糖尿病患者的细胞治疗,作为临床试验的一部分。然而,目前的程序不能产生高比例的NKX6.1和胰腺祖细胞,导致无功能内分泌细胞的共同生成和很少的葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞。因此,这项工作开发了一种增强的方案,用于生成hPSC衍生的胰腺祖细胞,该方案最大限度地提高PDX1和NKX6.1在2D单层中的共表达。细胞密度、新鲜基质的可用性和hPSC来源的内胚层细胞的解离等因素被调节,以增加生成的胰腺祖细胞中的PDX1和NKX6.1水平,并最大限度地减少对替代肝谱系的承诺。该研究强调,在 体外 分化过程中操纵细胞的物理环境会影响谱系规范和基因表达。因此,当前优化的方案有助于PDX1和NKX6.1共表达祖细胞的可扩展生成,用于细胞治疗和疾病建模。
糖尿病是一种复杂的代谢紊乱,影响着全球数百万人。补充胰岛素被认为是糖尿病的唯一治疗选择。更晚期的病例用β细胞替代疗法治疗,通过移植整个尸体胰腺或胰岛1,2来实现。围绕移植治疗的几个问题,例如组织的可用性和质量的限制,移植程序的侵入性以及对免疫抑制剂的持续需求。这就需要发现β细胞替代疗法的新颖和替代选择2,3。人类多能干细胞(hPSCs)最近已成为了解人类胰腺生物学的有前途的工具,并且是移植治疗的非详尽且可能更个性化的来源4,5,6,7。hPSC,包括人类胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hiPSCs),具有很高的自我更新能力,并产生人体的任何组织类型。hESC来源于胚胎的内部细胞团,hiPSCs从任何体细胞4,8重新编程。
定向分化方案经过优化,可从 hPSC 生成胰腺 β 细胞,这些 hPSC 依次引导 hPSC 通过胰腺发育阶段体外。这些方案产生hPSC衍生的胰岛类器官。虽然它们在增加胰腺β细胞的比例方面有了很大的改善,但方案的效率是高度可变的。它不会增加到NKX6.1 + / INSULIN +或C-PEPTIDE +细胞5,9,10,11,12,13的~40%。然而,生成的β细胞在转录和代谢谱以及对葡萄糖4,5,14的反应方面与成人β细胞并不完全相同。与成人胰岛相比,hPSC 衍生的 β 细胞缺乏关键 β 细胞标记物(如 PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2 和 KCNK3)的基因表达5。此外,hPSC衍生的β细胞响应葡萄糖的钙信号传导减弱。它们被共同生成的多激素细胞污染,这些细胞不会分泌适量的胰岛素以响应葡萄糖水平的增加5。另一方面,与β细胞相比,hPSC衍生的胰腺祖细胞(胰岛前体)可以在体外更有效地产生,并且在体内移植时,可以成熟为功能性的胰岛素分泌β细胞15,16。临床试验目前集中在证明其在T1D受试者移植时的安全性和有效性。
值得注意的是,转录因子PDX1(胰腺和十二指肠同源盒1)和NKX6.1(NKX6同源盒1)在同一胰腺祖细胞中的表达对于β细胞谱系5的承诺至关重要。不能表达NKX6.1的胰腺祖细胞产生多激素内分泌细胞或无功能的β细胞17,18。因此,PDX1和NKX6.1在胰腺祖细胞期的高共表达对于最终产生大量功能性β细胞至关重要。研究表明,胚体或3D培养增强了胰腺祖细胞聚集的PDX1和NKX6.1,在PDX1 + / NKX6.1 +群体的40%-80%之间变化12,19。然而,与悬浮培养相比,2D分化培养物更具成本效益,可行且便于在多个细胞系上应用5。我们最近表明,单层分化培养物产生高达90%以上的PDX1 + / NKX6.1 +共表达hPSC来源的胰腺祖细胞20,21,22。报告的方法赋予生成的胰腺祖细胞高复制能力,并防止了替代命运规范,如肝谱系21。因此,在此,该协议展示了一种将hPSCs分化为共表达PDX1和NKX6.1的胰腺β细胞前体的高效方法。该方法利用解离hPSC衍生的内胚层并操纵细胞密度的技术,然后扩展FGF和类视黄醇信号传导以及Hedgehog抑制以促进PDX1和NKX6.1共表达(图1)。该方法可以促进用于移植治疗和疾病建模的hPSC衍生胰腺β细胞前体的可扩展生成。
该研究已获得适当的机构研究伦理委员会的批准,并按照1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的伦理标准中规定的伦理标准进行。该协议由HMC机构审查委员会(IRB)(编号16260/16)和卡塔尔生物医学研究所(QBRI)(编号2016-003)批准。这项工作针对H1、H9和HUES8等hESC进行了优化。血液样本是从哈马德医疗公司(HMC)医院的健康个体获得的,并得到完全知情同意。iPSCs由对照的外周血单核细胞(PBMC)产生,健康个体23。
1. 培养基的制备
2. 地下室膜基质涂层培养皿的制备
3. 未分化 hPSC 的培养
4. 诱导 hPSC 中的确定性内胚层 (DE) 分化(第 1 阶段)
5. hPSC衍生DE的免疫荧光分析(第1阶段)
6. 从 hPSC 生成原始肠管 (PGT)(第 2 阶段)
注意:如果步骤5.13中的免疫荧光分析被确定为80%及以上的SOX17-FOXA2共表达,则实验继续进行第2阶段。如果效率为 <80%,则将第 1 阶段的持续时间延长至 4 天。
7. hPSCs产生后前肠(第3阶段)
8. 从 hPSC 产生胰腺祖细胞(第 4 阶段)
9. 评估从hPSCs产生胰腺祖细胞的分化效率
结果表明,优化的方案P2-D(图1A)通过上调PDX1和NKX6.1共表达来提高胰腺祖细胞分化效率(图2A,B和图3A)。特别是,结果表明,与从先前发表的研究修改的非解离方案(P1-ND)相比,内胚层细胞的解离及其在新鲜膜基质上的重新铺板以及更长的3期持续时间增强了hPSC来源的胰腺祖细胞(优化方案,P2-D)(图
这项工作描述了一种增强的方案,用于从具有PDX1和NKX6.1高共表达的hPSC产生胰腺祖细胞。hPSC来源的内胚层在新鲜基质上以半密度解离和再铺板导致hPSC来源的胰腺祖细胞中的PDX1和NKX6.1升高。
尽管每个阶段的生长因子混合物与P1-ND27高度相似,但已经表明,包括FGF和类视黄醇信号传导以及BMP和刺猬抑制在内的更扩展的3期治疗会增加NKX6.1表达,这与Nostro等人的发?...
作者没有什么可透露的。
这项工作由卡塔尔国家研究基金(QNRF)资助(资助号)。NPRP10-1221-160041)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
Portable vacuum aspirator | |||
Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
Tween 20 | Sigma | P2287 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。