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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) son una excelente herramienta para estudiar el desarrollo pancreático temprano e investigar los contribuyentes genéticos a la diabetes. Sin embargo, las células secretoras de insulina derivadas de hPSC se pueden generar para la terapia celular y el modelado de enfermedades, con una eficiencia y propiedades funcionales limitadas. Los progenitores pancreáticos derivados de hPSC que son precursores de las células beta y otras células endocrinas, cuando coexpresan los dos factores de transcripción PDX1 y NKX6.1, especifican los progenitores de las células beta funcionales secretoras de insulina tanto in vitro como in vivo. Los progenitores pancreáticos derivados de hPSC se utilizan actualmente para la terapia celular en pacientes con diabetes tipo 1 como parte de ensayos clínicos. Sin embargo, los procedimientos actuales no generan una alta proporción de NKX6.1 y progenitores pancreáticos, lo que lleva a la cogeneración de células endocrinas no funcionales y pocas células secretoras de insulina sensibles a la glucosa. Este trabajo desarrolló un protocolo mejorado para generar progenitores pancreáticos derivados de hPSC que maximizan la coexpresión de PDX1 y NKX6.1 en una monocapa 2D. Los factores como la densidad celular, la disponibilidad de matriz fresca y la disociación de las células endodérmicas derivadas de hPSC se modulan para aumentar los niveles de PDX1 y NKX6.1 en los progenitores pancreáticos generados y minimizar el compromiso con el linaje hepático alternativo. El estudio destaca que la manipulación del entorno físico de la célula durante la diferenciación in vitro puede afectar la especificación del linaje y la expresión génica. Por lo tanto, el protocolo optimizado actual facilita la generación escalable de progenitores coexpresivos PDX1 y NKX6.1 para la terapia celular y el modelado de enfermedades.

Introducción

La diabetes es un trastorno metabólico complejo que afecta a millones de personas en todo el mundo. La suplementación de insulina se considera la única opción de tratamiento para la diabetes. Los casos más avanzados se tratan con terapia de reemplazo de células beta, lograda mediante el trasplante de páncreas cadavérico completo o islotes 1,2. Varios problemas rodean la terapia de trasplante, como la limitación con la disponibilidad y calidad del tejido, la invasividad de los procedimientos de trasplante, además de la necesidad continua de inmunosupresores. Esto requiere la necesidad de descubrir opciones novedosas y alternativas para la terapia de reemplazo de células beta 2,3. Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) han surgido recientemente como una herramienta prometedora para comprender la biología del páncreas humano y como una fuente no exhaustiva y potencialmente más personalizada para la terapia de trasplante 4,5,6,7. Las hPSC, incluidas las células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs), tienen una alta capacidad de autorrenovación y dan lugar a cualquier tipo de tejido del cuerpo humano. Las hESCs se derivan de la masa celular interna del embrión, y las hiPSCs se reprograman a partir de cualquier célula somática 4,8.

Los protocolos de diferenciación dirigida están optimizados para generar células beta pancreáticas a partir de hPSCs que dirigen secuencialmente hPSCs a través de etapas de desarrollo pancreático invitro. Estos protocolos generan organoides de islotes derivados de hPSC. Si bien han mejorado mucho en el aumento de la proporción de células beta pancreáticas en ellos, la eficiencia de los protocolos es muy variable. No aumenta a más de ~40% de las células NKX6.1+/INSULINA+ o C-PÉPTIDO + 5,9,10,11,12,13. Sin embargo, las células beta generadas no son completamente idénticas a las células beta humanas adultas en términos de sus perfiles transcripcionales y metabólicos y su respuesta a la glucosa 4,5,14. Las células beta derivadas de hPSC carecen de expresión génica de marcadores clave de células beta como PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 y KCNK3 en comparación con losislotes 5 de humanos adultos. Además, las células beta derivadas de hPSC han disminuido la señalización de calcio en respuesta a la glucosa. Están contaminados con las células polihormonales cogeneradas que no secretan cantidades adecuadas de insulina en respuesta al aumento de los niveles de glucosa5. Por otro lado, los progenitores pancreáticos derivados de hPSC, que son precursores de islotes, podrían generarse de manera más eficiente in vitro en comparación con las células beta y, cuando se trasplantan in vivo, podrían madurar en células beta funcionales, secretoras de insulina15,16. Los ensayos clínicos se centran actualmente en demostrar su seguridad y eficacia tras el trasplante en sujetos con DT1.

En particular, la expresión de los factores de transcripción PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) y NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) dentro de la misma célula progenitora pancreática es crucial para el compromiso hacia un linaje de células beta5. Los progenitores pancreáticos que no expresan NKX6.1 dan lugar a células endocrinas polihormonales o células beta no funcionales17,18. Por lo tanto, una alta coexpresión de PDX1 y NKX6.1 en la etapa progenitora pancreática es esencial para generar finalmente un gran número de células beta funcionales. Los estudios han demostrado que un cuerpo embrioide o cultivo 3D mejora PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos donde se agregan las células diferenciadoras, variando entre el 40% -80% de la población PDX1+/NKX6.1+12,19. Sin embargo, en comparación con los cultivos en suspensión, los cultivos de diferenciación 2D son más rentables, factibles y convenientes para su aplicación en múltiples líneas celulares5. Recientemente hemos demostrado que los cultivos de diferenciación monocapa producen más del 90% de los progenitores pancreáticos derivados de hPSC que coexpresan PDX1+/NKX6.1+20,21,22. El método reportado confirió una alta capacidad de replicación a los progenitores pancreáticos generados y evitó especificaciones de destino alternativo como el linaje hepático21. Por lo tanto, en este documento, este protocolo demuestra un método altamente eficiente para la diferenciación de hPSCs a precursores de células beta pancreáticas que coexpresan PDX1 y NKX6.1. Este método utiliza la técnica de disociar el endodermo derivado de hPSC y manipular la densidad celular, seguido de una señalización extendida de FGF y retinoide, así como la inhibición de Hedgehog para promover la coexpresión de PDX1 y NKX6.1 (Figura 1). Este método puede facilitar una generación escalable de precursores de células beta pancreáticas derivadas de hPSC para la terapia de trasplante y el modelado de enfermedades.

Protocolo

El estudio ha sido aprobado por el comité ético de investigación institucional apropiado y realizado siguiendo los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de HMC (no. 16260/16) y el Instituto de Investigación Biomédica de Qatar (QBRI) (no. 2016-003). Este trabajo está optimizado para hESCs como H1, H9 y HUES8. Se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos del hospital Hamad Medical Corporation (HMC) con pleno consentimiento informado. Las iPSCs son generadas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de control, individuo sano23.

1. Preparación de los medios de cultivo

  1. Preparar medios de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC)
    1. Preparar medios de cultivo de hPSC a partir del medio disponible comercialmente para mantener y expandir células madre embrionarias humanas complementando 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina (ver Tabla de materiales). Alícuota y conservar el soporte completo a -20 °C a largo plazo o a 4 °C para su uso inmediato.
  2. Prepare los medios de diferenciación de la Etapa 1 (para el endodermo definitivo (DE)).
    1. Prepare medios basales a partir de medios MCDB 131 complementando con 0.5% de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (FFA-BSA), 1.5 g / L de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 10 mM de glucosa, 2 mM de Glutamax, 100 unidades / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina (consulte la Tabla de materiales). Filtrar el medio preparado con un filtro de 0,2 μm y almacenar a 4 °C.
    2. Preparar los medios de la Etapa 1 que contienen CHIR99021 a partir del medio basal (preparado en el paso 1.2.1) calentando los medios basales a 37 °C y luego complementándolos con 2 μM de CHIR99021, 100 ng/ml de activina A, 10 μM de inhibidor de roca (Y-27632) y 0,25 mM de vitamina C (ver Tabla de materiales). Mezcle bien los medios suplementados y cúbralos con papel de aluminio para protegerlos de la luz.
      NOTA: Este medio se utilizará solo el primer día de diferenciación.
    3. Prepare los medios de la Etapa 1 sin CHIR99021 a partir del medio basal calentándolos a 37 °C y complementándolos con 100 ng / ml de activina A y 0.25 mM de vitamina C y mezcle bien.
      NOTA: 5 ng/mL de FGF básico o FGF2 se pueden agregar opcionalmente a este medio. Este medio se utilizará durante los días restantes de la Etapa 1.
  3. Preparar los medios de diferenciación de la Etapa 2 (para Primitive Gut Tube; PGT).
    1. Prepare los medios de diferenciación de la etapa 2 que contienen inhibidor de roca del medio basal calentándolo a 37 °C y complementando con 50 ng / ml de FGF10, 50 ng / ml de NOGGIN, 0.25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inhibidor de roca) y 0.25 mM de vitamina C.
      NOTA: Este medio se utiliza el día de la disociación de las células endodérmicas.
    2. Preparar los medios de diferenciación de la fase 2 sin inhibidor de Rock siguiendo el mismo procedimiento para los medios preparados en el paso 1.3.1, excluyendo el inhibidor de Rock.
      NOTA: Este medio se utiliza en el segundo día de la Etapa 2.
  4. Prepare los medios de diferenciación de la etapa 3 (para el intestino anterior posterior).
    1. Prepare medios DMEM que contengan 4.5 g / L de glucosa, luego complemente con 1% de penicilina-estreptomicina y 2 mM de Glutamax y úselo como medio basal para las etapas 3 y 4.
    2. Caliente el medio DMEM (preparado en el paso 1.4.1) y complemente con 2 μM de ácido retinoico, 0,25 μM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF10, 50 ng/ml de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C y 1% de suplemento de B27 sin vitamina A (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Este medio se utiliza durante 4 días de la Etapa 3 para P2-D (Protocolo 2, optimizado, disociado) y 2 días de la Etapa 3 para P1-ND (Protocolo 1, no optimizado, no disociado).
  5. Preparar medios de diferenciación de la etapa 4 (para progenitores pancreáticos).
    1. Agregue DMEM que contenga 4.5 g / L de glucosa con 100 ng / ml de EGF, 10 mM de nicotinamida, 50 ng / ml de NOGGIN, 0.25 mM de vitamina C y 1% de suplemento de B27 sin vitamina A (consulte la Tabla de materiales). Utilice este medio para todos los días de la Etapa 4.
      NOTA: Mantener todos los reactivos a temperaturas apropiadas, y todas las citoquinas y reactivos sensibles deben ser alícuotas. Descongelar los reactivos alícitados y añadir a los medios basales en el momento de cambiar los medios de diferenciación. Las composiciones de los diferentes medios de diferenciación se proporcionan en la Tabla 1.

2. Preparación de platos recubiertos de matriz de membrana basal

  1. Descongelar la matriz del sótano disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) y alícuota sobre hielo; congelar las alícuotas a -20 °C.
  2. Antes de recubrir las placas de cultivo de tejidos, descongele las alícuotas congeladas en hielo. Agregue el volumen apropiado de la solución de matriz de membrana al medio refrigerado KO-DMEM / F-12 (KnockOut DMEM / F-12) (consulte la Tabla de materiales) para lograr la concentración diluida deseada y mezclar bien. Conservar la solución de matriz diluida a 4 °C para su uso inmediato.
  3. Cubrir la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos (ver Tabla de materiales) con una solución de matriz de membrana diluida y colocar las placas a 37 °C durante al menos 60 minutos antes de colocar las células. Utilice una dilución de 1:50 de la solución de matriz de membrana en KO-DMEM/F-12 para placas de células para el experimento de diferenciación pancreática y 1:80 para la expansión de hPSCs indiferenciadas.

3. Cultura de hPSCs indiferenciadas

  1. Pasar las hPSCs cuando las colonias alcanzan una confluencia del 70%-80%.
  2. Para pasar, lave las hPSC una vez con PBS caliente, aspire con un aspirador de vacío portátil dentro de la campana de cultivo de tejidos y agregue 0,5 mM de solución de EDTA en PBS para cubrir la superficie de la colonia. Incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante 1 min o hasta que los bordes de las colonias se desprendan de la superficie de la placa.
  3. Retirar la solución de EDTA y recoger las colonias desprendentes con medio de cultivo hPSC utilizando una micropipeta P1000. Centrifugar las células recogidas a 128 x g durante 4 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y complementar las células con medios de cultivo de hPSC que contengan 10 μM de Y-27632 (inhibidor de roca)23,24.
    NOTA: Pase las hPSC en al menos una proporción de 1:3 en platos recubiertos con matriz de membrana 1:80. Sin embargo, para experimentos de diferenciación, emplate las hPSC en platos recubiertos 1:50.

4. Inducción de la diferenciación definitiva del endodermo (DE) en hPSCs (Etapa 1)

  1. Cuando las colonias de hPSC alcancen una confluencia del 70% -80%, lávelas dos veces con PBS caliente y aspire usando un aspirador de vacío portátil dentro de la campana de cultivo de tejidos para comenzar la diferenciación de la Etapa 1.
  2. Añadir a las colonias un medio de diferenciación de la fase 1 que contenga CHIR99021 (a partir del paso 1.2.2) 2 ml por placa de 6 pocillos e incubar a 37 °C durante 24 h.
  3. Al día siguiente, sustituya el medio gastado por un medio de diferenciación de la etapa 1 sin CHIR99021 (paso 1.2.3).
  4. Cada 24 h, aspire el medio gastado con un aspirador de vacío portátil dentro de la campana de cultivo de tejidos y reemplácelo con un nuevo medio de diferenciación de Etapa 1 sin CHIR99021.
    NOTA: La etapa 1 se puede extender hasta 4 días. La longitud de la Etapa 1 depende de la línea hPSC que se utiliza y debe optimizarse en consecuencia.

5. Análisis de inmunofluorescencia de DE derivada de hPSC (Etapa 1)

  1. Para la inmunofluorescencia, aspire los medios gastados usando un aspirador de vacío portátil dentro de la campana de cultivo de tejidos de los pocillos y lave dos veces con PBS caliente. Agite la placa para deshacerse de cualquier residuo celular.
  2. Cubra la superficie de los pocillos con 4% de paraformaldehído (PFA) para fijar las células DE; por ejemplo, agregue 250 uL de PFA por pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa en una agitadora 2D a 20 x g durante 20 min.
  3. Después de la fijación, lave las células DE con solución salina tamponada con tris con 0,5% de Tween (TBST) (consulte la Tabla de materiales) y coloque la placa en el agitador a 20 x g durante 10 min. Repita este paso una vez más.
  4. Permeabilizar las células fijas agregando un volumen generoso de solución salina tamponada con fosfato con 0.5% de Triton X-100 (PBST); por ejemplo, agregue 1 ml de PBST por pocillo de una placa de 24 pocillos y vuelva a colocar la placa en el agitador a 20 x g durante 20 minutos.
  5. Prepare recién el 5% -6% de BSA en PBST como tampón de bloqueo y agréguelo a las células permeabilizadas. Incubar la placa durante al menos 1 h en la solución de bloqueo del agitador.
  6. Diluir los anticuerpos primarios contra SOX17 y FOXA2 juntos (ver Tabla de materiales) en BSA al 2% -3% en solución PBST. Añadir los anticuerpos combinados a las células bloqueadas y colocar la placa en el agitador a 4 °C durante la noche a baja velocidad con una agitación suave.
    NOTA: SOX17 y FOXA2 son marcadores DE bien establecidos25,26.
  7. Al día siguiente, aspire los anticuerpos primarios con un filtro de vacío portátil y lave los pocillos con TBST tres veces, cada una lave durante 10 minutos en la coctelera.
  8. Prepare una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados Alexa fluor 488 y 568 (consulte la Tabla de materiales) contra las especies en las que se criaron los anticuerpos primarios.
  9. Agregue la combinación de anticuerpos secundarios al pozo manchado y cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz. Coloque el plato en la coctelera durante 1 h a temperatura ambiente.
  10. Aspire la solución de anticuerpos secundarios con un filtro de vacío portátil y lave los pocillos manchados con TBST en el agitador durante 10 minutos, cubriendo la placa con papel de aluminio. Repita el paso de lavado un total de tres veces.
  11. Preparar una dilución de 1 μg/ml de Hoechst 33342 en PBS para teñir los núcleos. Agregue la solución de Hoechst a los pocillos y coloque la placa en el agitador durante 2-3 minutos.
  12. Aspire la solución de Hoechst con un filtro de vacío portátil y enjuague los pocillos con PBS dos veces.
  13. Finalmente, agregue PBS a las células teñidas y visualícelas usando un microscopio de fluorescencia invertida (consulte la Tabla de materiales) en la oscuridad. Mantenga la placa cubierta con papel de aluminio cuando no se cree una imagen para minimizar el blanqueo del fluoróforo.
    NOTA: Alternativamente, se puede utilizar la citometría de flujo para evaluar la eficiencia de DE como se describe en el paso 9.2.

6. Generación del tubo intestinal primitivo (PGT) a partir de hPSCs (Etapa 2)

NOTA: Si se determina que el análisis de inmunofluorescencia en el paso 5.13 es una coexpresión SOX17-FOXA2 del 80% o más, el experimento pasa a la Etapa 2. Si la eficiencia es <80%, extienda la duración de la Etapa 1 a 4 días.

  1. En el día 1 de la Etapa 2, disocie las células endodérmicas derivadas de hPSC usando TrypLE o Accutase (consulte la Tabla de materiales) para el protocolo P2-D optimizado. Lave las células adherentes con PBS caliente y agregue 1 ml caliente de solución de tripLE o Accutase por pocillo de una placa de 6 pocillos durante 3-5 min a 37 °C, 5% deCO2, o hasta que las células comiencen a desprenderse entre sí.
  2. Disocie las láminas separadas o la monocapa de células en los pocillos y luego recójalos juntos en un tubo de polipropileno de 15 ml utilizando medios basales en etapa 1/2 sin citoquinas que contengan al menos 0.5% de suero bovino fetal (FBS) o suero KnockOut (KOSR) (ver Tabla de materiales).
  3. Girar las células a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS estéril y resuspenda el pellet en celdas individuales.
  4. Cuente las celdas utilizando un contador automático (consulte la Tabla de materiales) cargando el volumen recomendado de celdas en el portaobjetos de la cámara. Girar las células resuspendidas a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  5. Resuspender el pellet en el volumen apropiado del medio de diferenciación de la etapa 2 que contiene inhibidor de roca a una densidad de 2.5-3.5 x 105 células/cm2.
    NOTA: Este recuento puede reducirse a una relación de división de 1:2 para la mayoría de las líneas celulares, dependiendo de la tasa de proliferación. El volumen total será de 2 mL de medios con células resuspendidas en 1 pocillo de placa de 6 pocillos.
  6. Colocar las células resuspendidas en placas recubiertas de matriz de membrana 1:50 (preparadas en el paso 2) e incubarlas a 37 °C, 5% deCO2 en la incubadora.
  7. 24 h más tarde, sustituir el medio por medio de diferenciación de fase 2 sin inhibidor de roca (preparado en el paso 1.3.2).

7. Generación del intestino anterior posterior a partir de hPSCs (Etapa 3)

  1. Aspire los medios usados de la Etapa 2 con un aspirador de vacío portátil dentro de la campana de cultivo de tejidos y lave las células con PBS caliente.
  2. Añadir los medios de diferenciación de la fase 3 del paso 1.4 a las células e incubar a 37 °C, 5% deCO2.
  3. Después de 24 h, reemplace los medios gastados con medios de diferenciación Etapa 3 recién preparados. Repita esto durante un total de 4 días para el protocolo P2-D (optimizado) y solo 2 días para el P1-ND no disociado.

8. Generación de progenitores pancreáticos a partir de hPSCs (Etapa 4)

  1. Después de 4 días de tratamiento de la Etapa 3, lave las células con PBS caliente, agite suavemente la placa y aspire con un aspirador de vacío portátil. A continuación, agregue los medios de diferenciación de la etapa 4 del paso 1.5 a las celdas.
  2. Después de 24 h, reemplace los medios gastados con medios recién preparados de la Etapa 4. Repita esto durante un total de 4 días.

9. Evaluación de la eficiencia de diferenciación de progenitores pancreáticos generadores a partir de hPSCs

  1. Realizar el análisis de inmunofluorescencia de los progenitores pancreáticos derivados de hPSC (Estadio 4) para la expresión de PDX1 y NKX6.1.
    NOTA: PDX1 y NKX6.1 son marcadores progenitores pancreáticos bien establecidos17,18.
    1. Realizar fijación, permeabilización, bloqueo e incubación de anticuerpos y lavados de acuerdo con el paso 5.
    2. Colorear los progenitores pancreáticos derivados de hPSC con una combinación de anticuerpos PDX1 y NKX6.1 (consulte la Tabla de materiales) diluidos en BSA al 2% -3% en PBST.
    3. Use diluciones 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados Alexa fluor 488 y 568 apropiados (consulte la Tabla de materiales).
  2. Realizar análisis de citometría de flujo de progenitores pancreáticos derivados de hPSC para la expresión de PDX1 y NKX6.1.
    NOTA: El análisis de citometría de flujo de los marcadores pancreáticos en los progenitores pancreáticos derivados de hPSC generados proporciona una forma de cuantificar las células que coexpresan PDX1 y NKX6.1.
    1. Al final de la Etapa 4, lave las células dos veces con PBS caliente y agregue suficiente TrypLE o Accutase para cubrir la superficie de los pocillos, por ejemplo, 1 ml de TrypLE o Accutase por pocillo de placa de 6 pocillos. Coloque la placa en la incubadora durante 5-7 minutos o hasta que las células se desprendan de la superficie.
    2. Disocie las láminas adherentes de células dentro del pozo usando una micropipeta P1000 antes de recogerlas en un tubo de polipropileno de 15 ml.
    3. Girar las células en progenitores pancreáticos derivados de hPSC a 800 x g durante 5 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante. Lave las células con PBS disociándolas en células individuales. Cuente las celdas usando un contador automático (consulte la Tabla de materiales) y observe la concentración en el número de celdas por ml.
    4. Girar a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Añadir 200 μL de PBS refrigerado al pellet y disociar.
    5. Agregue 2 ml de etanol refrigerado al 80% gota a gota, con el tubo en un vórtice a velocidad baja-media (400 x g a temperatura ambiente). Cierre bien las tapas y coloque los tubos ligeramente inclinados sobre el agitador a 4 °C durante la noche.
    6. Girar las células a 800 x g durante 5 min a 4 °C, y lavar con PBS para disociar cualquier grupo de células fijas.
    7. Bloquear las celdas fijas con una solución de BSA al 5% -6% en PBST durante al menos 1 h a temperatura ambiente o 4 °C durante la noche en el agitador.
    8. Tinción para los marcadores progenitores pancreáticos siguiendo los pasos a continuación.
      1. Distribuir 2,00,000 células por condición, incluidos los controles de isotipo apropiados dependientes de la subclase IgG de la especie huésped del anticuerpo primario, controles de anticuerpos secundarios y no teñidos en una placa inferior en V de 96 pocillos o tubos de centrífuga de 1.5 ml.
      2. Girar la placa a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C y voltear la placa con un movimiento rápido para desechar el sobrenadante sin perder los pellets. Prepare diluciones de anticuerpos primarios en solución de BSA al 3% (ver Tabla de materiales).
        NOTA: La concentración de anticuerpos primarios puede estar entre 1:50 y 1:200.
      3. Incubar las células teñidas durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C en una coctelera con agitación suave a baja velocidad.
      4. Lave las células teñidas con TBST tres veces pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo en los pocillos. Girar y desechar el sobrenadante como en el paso 9.2.8.2.
      5. Agregue una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios (anticuerpos conjugados Alexa fluor 488 y 647) preparados en PBS (consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
      6. Lave las células teñidas con TBST al menos dos veces pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo. Gire la placa y deseche el sobrenadante como en el paso 9.2.8.2.
      7. Recoja las células teñidas en al menos 100 μL de PBS y transfiéralas a tubos FACS protegidos contra la luz (consulte la Tabla de materiales). Ejecute las muestras en una máquina de citometría de flujo.

Resultados

Los resultados muestran que el protocolo optimizado P2-D (Figuras 1A) mejoró la eficiencia de la diferenciación del progenitor pancreático al regular al alza la coexpresión de PDX1 y NKX6.1 (Figura 2A, B y Figura 3A). En particular, los resultados mostraron que la disociación de las células endodérmicas y su recubrimiento en la matriz de membrana fresca junto con una mayor duración de la Etapa 3 mejoraron la...

Discusión

Este trabajo describe un protocolo mejorado para generar progenitores pancreáticos a partir de hPSCs con una alta coexpresión de PDX1 y NKX6.1. La disociación y el replacado del endodermo derivado de hPSC a la mitad de la densidad en la matriz fresca dieron lugar a mayores PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de hPSC.

Aunque el cóctel del factor de crecimiento para cada etapa es muy similar a P1-ND 27, se ha demostrado que un tratamiento más extendido de la Etapa 3 que in...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well culture plates, flat bottom with lidCostar3524
50 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339652
6- well culture plates, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid freeSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucoseThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Inverted microscopeOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum replacementGibco10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)SigmaA92902Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in distilled water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonateSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer automated cell counterInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

Referencias

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

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