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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono uno strumento eccellente per studiare lo sviluppo pancreatico precoce e studiare i fattori genetici che contribuiscono al diabete. Le cellule secernenti insulina derivate da hPSC possono essere generate per la terapia cellulare e la modellizzazione della malattia, tuttavia, con efficienza e proprietà funzionali limitate. I progenitori pancreatici derivati da hPSC che sono precursori delle cellule beta e di altre cellule endocrine, quando co-esprimono i due fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1, specificano i progenitori delle cellule beta funzionali che secernono insulina sia in vitro che in vivo. I progenitori pancreatici derivati da hPSC sono attualmente utilizzati per la terapia cellulare nei pazienti con diabete di tipo 1 come parte di studi clinici. Tuttavia, le procedure attuali non generano un'alta percentuale di NKX6.1 e progenitori pancreatici, portando alla cogenerazione di cellule endocrine non funzionali e poche cellule sensibili al glucosio e secernenti insulina. Questo lavoro ha quindi sviluppato un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici derivati da hPSC che massimizzano la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 in un monostrato 2D. I fattori come la densità cellulare, la disponibilità di matrice fresca e la dissociazione delle cellule endodermiche derivate da hPSC sono modulati che hanno aumentato i livelli di PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici generati e ridotto al minimo l'impegno ad alternare la linea epatica. Lo studio evidenzia che la manipolazione dell'ambiente fisico della cellula durante la differenziazione in vitro può influire sulla specificazione del lignaggio e sull'espressione genica. Pertanto, l'attuale protocollo ottimizzato facilita la generazione scalabile di progenitori co-espressivi PDX1 e NKX6.1 per la terapia cellulare e la modellazione della malattia.

Introduzione

Il diabete è una malattia metabolica complessa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'integrazione di insulina è considerata l'unica opzione di trattamento per il diabete. I casi più avanzati sono trattati con la terapia sostitutiva delle cellule beta, ottenuta attraverso il trapianto di pancreas cadaverico intero o isole 1,2. Diverse questioni circondano la terapia dei trapianti, come la limitazione della disponibilità e della qualità del tessuto, l'invasività delle procedure di trapianto oltre alla continua necessità di immunosoppressori. Ciò richiede la necessità di scoprire opzioni nuove e alternative per la terapia sostitutiva delle cellule beta 2,3. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono recentemente emerse come uno strumento promettente per comprendere la biologia del pancreas umano e come fonte non esaustiva e potenzialmente più personalizzata per la terapia dei trapianti 4,5,6,7. Le hPSC, comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), hanno un'elevata capacità di autorinnovamento e danno origine a qualsiasi tipo di tessuto del corpo umano. Le hESCs sono derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione e le hiPSC sono riprogrammate da qualsiasi cellula somatica 4,8.

I protocolli di differenziazione diretta sono ottimizzati per generare cellule beta pancreatiche da hPSC che dirigono sequenzialmente le hPSC attraverso gli stadi di sviluppo pancreatici in vitro. Questi protocolli generano organoidi di isole derivati da hPSC. Mentre sono notevolmente migliorati nell'aumentare la proporzione di cellule beta pancreatiche al loro interno, l'efficienza dei protocolli è altamente variabile. Non aumenta a più di ~ 40% delle cellule NKX6.1 + / INSULIN + o C-PEPTIDE + 5,9,10,11,12,13. Tuttavia, le cellule beta generate non sono del tutto identiche alle cellule beta umane adulte in termini di profili trascrizionali e metabolici e della loro risposta al glucosio 4,5,14. Le cellule beta derivate da hPSC mancano di espressione genica di marcatori chiave delle cellule beta come PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 rispetto alle isole 5 dell'uomoadulto. Inoltre, le cellule beta derivate da hPSC hanno diminuito la segnalazione del calcio in risposta al glucosio. Sono contaminati dalle cellule poliormonali co-generate che non secernono quantità appropriate di insulina in risposta all'aumento dei livelli di glucosio5. D'altra parte, i progenitori pancreatici derivati da hPSC, che sono precursori delle isole, potrebbero essere generati in modo più efficiente in vitro rispetto alle cellule beta e, una volta trapiantati in vivo, potrebbero maturare in cellule beta funzionali che secernono insulina15,16. Gli studi clinici sono attualmente focalizzati sulla dimostrazione della loro sicurezza ed efficacia dopo il trapianto in soggetti T1D.

In particolare, l'espressione dei fattori di trascrizione PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) all'interno della stessa cellula progenitrice pancreatica è cruciale per l'impegno verso una linea cellulare beta5. I progenitori pancreatici che non riescono ad esprimere NKX6.1 danno origine a cellule endocrine poliormonali o cellule beta non funzionali17,18. Pertanto, un'elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1 nello stadio progenitore pancreatico è essenziale per generare un gran numero di cellule beta funzionali. Gli studi hanno dimostrato che un corpo embrioide o una coltura 3D migliora PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici in cui le cellule differenzianti sono aggregate, variando tra il 40% -80% della popolazione PDX1+/NKX6.1+12,19. Tuttavia, rispetto alle colture in sospensione, le colture di differenziazione 2D sono più economiche, fattibili e convenienti per l'applicazione su più linee cellulari5. Abbiamo recentemente dimostrato che le colture di differenziazione monostrato producono più del 90% di PDX1+/NKX6.1+ co-espressione dei progenitori pancreatici derivati da hPSC20,21,22. Il metodo riportato ha conferito un'elevata capacità di replicazione ai progenitori pancreatici generati e ha impedito specifiche di destino alternativo come la linea epatica21. Pertanto, questo protocollo dimostra un metodo altamente efficiente per la differenziazione delle hPSCs in precursori delle cellule beta pancreatiche che co-esprimono PDX1 e NKX6.1. Questo metodo utilizza la tecnica di dissociazione dell'endoderma derivato da hPSC e manipolazione della densità cellulare, seguita da una segnalazione estesa di FGF e retinoidi, nonché dall'inibizione di Hedgehog per promuovere la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Questo metodo può facilitare una generazione scalabile di precursori delle cellule beta pancreatiche derivate da hPSC per la terapia dei trapianti e la modellizzazione della malattia.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e dal Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato per hESC come H1, H9 e HUES8. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani dall'ospedale Hamad Medical Corporation (HMC) con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di controllo, individuo sano23.

1. Preparazione dei terreni di coltura

  1. Preparare terreni di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)
    1. Preparare terreni di coltura hPSC dal terreno disponibile in commercio per il mantenimento e l'espansione delle cellule staminali embrionali umane integrando 100 unità/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina (vedere Tabella dei materiali). Aliquot e conservare il mezzo completo a -20 °C per il lungo periodo o a 4 °C per l'uso immediato.
  2. Preparare i mezzi di differenziazione di fase 1 (per endoderma definitivo (DE)).
    1. Preparare terreni basali da terreni MCDB 131 integrando con 0,5% di albumina sierica bovina priva di acidi grassi (FFA-BSA), 1,5 g/L di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 10 mM di glucosio, 2 mM di Glutamax, 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina (vedere Tabella dei materiali). Filtrare il mezzo preparato con un filtro da 0,2 μm e conservare a 4 °C.
    2. Preparare i terreni di Fase 1 contenenti CHIR99021 dai terreni basali (preparati al punto 1.2.1) riscaldando i terreni basali a 37 °C e quindi completando con 2 μM di CHIR99021, 100 ng/ml di activina A, 10 μM di inibitore della roccia (Y-27632) e 0,25 mM di vitamina C (vedere Tabella dei materiali). Mescolare bene il supporto integrato e coprirlo con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
      NOTA: questo supporto verrà utilizzato solo il primo giorno di differenziazione.
    3. Preparare i terreni di Fase 1 senza CHIR99021 dai terreni basali riscaldandoli a 37 °C e integrandoli con 100 ng/ml di Activina A e 0,25 mM di Vitamina C e mescolare bene.
      NOTA: 5 ng/mL di FGF o FGF2 di base possono essere aggiunti opzionalmente a questo supporto. Questo supporto verrà utilizzato per i giorni rimanenti della Fase 1.
  3. Preparare i mezzi di differenziazione Stage 2 (per Primitive Gut Tube; PGT).
    1. Preparare i mezzi di differenziazione di stadio 2 contenenti inibitori di roccia dai terreni basali riscaldandoli a 37 °C e completando con 50 ng/ml di FGF10, 50 ng/ml di NOGGIN, 0,25 μM di CHIR99021, 10 μM di Y-27632 (inibitore della roccia) e 0,25 mM di vitamina C.
      NOTA: Questo supporto viene utilizzato il giorno della dissociazione delle cellule endodermiche.
    2. Preparare i terreni di differenziazione della fase 2 senza inibitore di roccia seguendo la stessa procedura per i terreni preparati al punto 1.3.1, escluso l'inibitore di Rock.
      NOTA: questo supporto viene utilizzato il secondo giorno della fase 2.
  4. Preparare i mezzi di differenziazione di fase 3 (per il foregut posteriore).
    1. Preparare i media DMEM contenenti 4,5 g / L di glucosio, quindi integrare con l'1% di penicillina-streptomicina e 2 mM di Glutamax e utilizzare come media basale per le fasi 3 e 4.
    2. Riscaldare il mezzo DMEM (preparato al punto 1.4.1) e integrare con 2 μM di acido retinoico, 0,25 μM di SANT-1, 50 ng/ml di FGF10, 50 ng/ml di NOGGIN, 0,25 mM di vitamina C e 1% di integratore di B27 senza vitamina A (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: questo supporto viene utilizzato per 4 giorni della fase 3 per P2-D (protocollo 2, ottimizzato, dissociato) e 2 giorni della fase 3 per P1-ND (protocollo 1, non ottimizzato, non dissociato).
  5. Preparare i mezzi di differenziazione di stadio 4 (per i progenitori pancreatici).
    1. Aggiungere DMEM contenente 4,5 g / L di glucosio con 100 ng / ml di EGF, 10 mM di nicotinamide, 50 ng / ml di NOGGIN, 0,25 mM di vitamina C e 1% di integratore B27 senza vitamina A (vedi tabella dei materiali). Usa questo supporto per tutti i giorni della Fase 4.
      NOTA: Mantenere tutti i reagenti a temperature appropriate e tutti i citochine e i reagenti sensibili devono essere aliquotati. Scongelare i reagenti aliquotati e aggiungerli ai terreni basali al momento della modifica dei mezzi di differenziazione. Le composizioni dei diversi mezzi di differenziazione sono fornite nella tabella 1.

2. Preparazione di piatti rivestiti con matrice di membrana basale

  1. Matrice seminterrata di disgelo disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e aliquota su ghiaccio; congelare le aliquote a -20 °C.
  2. Prima di rivestire i piatti di coltura tissutale, scongelare le aliquote congelate sul ghiaccio. Aggiungere il volume appropriato della soluzione di matrice di membrana al mezzo refrigerato KO-DMEM/F-12 (KnockOut DMEM/F-12) (vedere Tabella dei materiali) per ottenere la concentrazione diluita desiderata e miscelare bene. Conservare la soluzione di matrice diluita a 4 °C per un uso immediato.
  3. Coprire la superficie delle piastre trattate con coltura tissutale (vedere Tabella dei materiali) con una soluzione a matrice di membrana diluita e porre le piastre a 37 °C per almeno 60 minuti prima di placcare le cellule. Utilizzare una diluizione di 1:50 della soluzione di matrice di membrana in KO-DMEM/F-12 per la placcatura delle cellule per l'esperimento di differenziazione pancreatica e 1:80 per l'espansione delle hPSC indifferenziate.

3. Cultura delle hPSC indifferenziate

  1. Passare le hPSC quando le colonie raggiungono una confluenza del 70%-80%.
  2. Per il passaggio, lavare le hPSC una volta con PBS caldo, aspirare utilizzando un aspiratore sottovuoto portatile all'interno della cappa di coltura tissutale e aggiungere 0,5 mM di soluzione EDTA in PBS per coprire la superficie della colonia. Incubare a 37 °C, 5% di CO2 per 1 minuto o fino a quando i bordi delle colonie si staccano dalla superficie della piastra.
  3. Rimuovere la soluzione di EDTA e raccogliere le colonie distaccanti con terreno di coltura hPSC utilizzando una micropipetta P1000. Centrifugare le cellule raccolte a 128 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e integrare le cellule con terreni di coltura hPSC contenenti 10 μM di Y-27632 (inibitore della roccia)23,24.
    NOTA: Far passare le hPSC in un rapporto almeno 1:3 su piatti rivestiti con matrice di membrana 1:80. Tuttavia, per esperimenti di differenziazione, impiattare le hPSC su piatti rivestiti 1:50.

4. Induzione del differenziamento definitivo dell'endoderma (DE) nelle hPSCs (Stadio 1)

  1. Quando le colonie di hPSC raggiungono una confluenza del 70%-80%, lavarle due volte con PBS caldo e aspirarle utilizzando un aspiratore sottovuoto portatile all'interno della cappa di coltura tissutale per iniziare la differenziazione della fase 1.
  2. Aggiungere alle colonie il mezzo di differenziazione dello stadio 1 contenente CHIR99021 (dal punto 1.2.2), 2 mL per piastra a 6 pozzetti, e incubare a 37 °C per 24 ore.
  3. Il giorno successivo, sostituire il materiale esaurito con il mezzo di differenziazione Stage 1 senza CHIR99021 (passaggio 1.2.3).
  4. Ogni 24 ore, aspirare il fluido esausto utilizzando un aspiratore sottovuoto portatile all'interno della cappa di coltura tissutale e sostituirlo con un nuovo mezzo di differenziazione Stage 1 senza CHIR99021.
    NOTA: la fase 1 può essere estesa fino a 4 giorni. La lunghezza della fase 1 dipende dalla linea hPSC utilizzata e deve essere ottimizzata di conseguenza.

5. Analisi di immunofluorescenza di DE derivate da hPSC (Stadio 1)

  1. Per l'immunofluorescenza, aspirare il mezzo esaurito utilizzando un aspiratore sottovuoto portatile all'interno della cappa di coltura tissutale dai pozzetti e lavare due volte con PBS caldo. Ruotare la piastra per eliminare eventuali detriti cellulari.
  2. Coprire la superficie dei pozzetti con il 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare le cellule DE; ad esempio, aggiungere 250 uL di PFA per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra su uno shaker 2D a 20 x g per 20 minuti.
  3. Dopo la fissazione, lavare le cellule DE con soluzione salina tris-tamponata con 0,5% di Tween (TBST) (vedere Tabella dei materiali) e posizionare la piastra sullo shaker a 20 x g per 10 minuti. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
  4. Permeabilizzare le cellule fisse aggiungendo un generoso volume di soluzione salina tamponata fosfato con lo 0,5% di Triton X-100 (PBST); ad esempio, aggiungere 1 mL di PBST per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e riposizionare la piastra sullo shaker a 20 x g per 20 minuti.
  5. Preparare appena il 5% -6% di BSA in PBST come tampone bloccante e aggiungerlo alle cellule permeabilizzate. Incubare la piastra per almeno 1 ora nella soluzione di blocco sullo shaker.
  6. Diluire gli anticorpi primari contro SOX17 e FOXA2 insieme (vedere Tabella dei materiali) in BSA al 2%-3% in soluzione PBST. Aggiungere gli anticorpi combinati alle cellule bloccate e posizionare la piastra sull'agitatore a 4 °C durante la notte a bassa velocità con un leggero agitazione.
    NOTA: SOX17 e FOXA2 sono marcatori DE ben consolidati25,26.
  7. Il giorno successivo, aspirare gli anticorpi primari utilizzando un filtro sottovuoto portatile e lavare i pozzetti con TBST tre volte, ogni lavaggio per 10 minuti sullo shaker.
  8. Preparare una diluizione 1:500 di anticorpi secondari coniugati Alexa fluor 488 e 568 (vedi Tabella dei materiali) contro le specie in cui sono stati allevati gli anticorpi primari.
  9. Aggiungere la combinazione di anticorpi secondari al pozzo macchiato e coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Posizionare la piastra sullo shaker per 1 ora a temperatura ambiente.
  10. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria utilizzando un filtro sottovuoto portatile e lavare i pozzetti macchiati con TBST sullo shaker per 10 minuti, coprendo la piastra con un foglio. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
  11. Preparare una diluizione di 1 μg/mL di Hoechst 33342 in PBS per colorare i nuclei. Aggiungere la soluzione di Hoechst ai pozzetti e posizionare la piastra sullo shaker per 2-3 minuti.
  12. Aspirare la soluzione Hoechst utilizzando un filtro sottovuoto portatile e sciacquare due volte i pozzetti con PBS.
  13. Infine, aggiungere PBS alle cellule colorate e visualizzarle usando un microscopio a fluorescenza invertita (vedi Tabella dei materiali) al buio. Tenere la piastra coperta con un foglio quando non si esegue l'imaging per ridurre al minimo lo sbiancamento del fluoroforo.
    NOTA: In alternativa, la citometria a flusso può essere utilizzata per valutare l'efficienza di DE come descritto al punto 9.2.

6. Generazione del tubo intestinale primitivo (PGT) da hPSCs (Stadio 2)

NOTA: Se l'analisi di immunofluorescenza nella fase 5.13 è determinata come una co-espressione SOX17-FOXA2 dell'80% e oltre, l'esperimento procede allo stadio 2. Se l'efficienza è <80%, estendere la durata della fase 1 a 4 giorni.

  1. Il giorno 1 della fase 2, dissociare le cellule endodermiche derivate da hPSC usando TrypLE o Accutase (vedere Tabella dei materiali) per il protocollo P2-D ottimizzato. Lavare le cellule aderenti con PBS caldo e aggiungere 1 mL caldo di soluzione di TrypLE o Accutase per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 3-5 minuti a 37 °C, 5% CO2, o fino a quando le cellule iniziano a staccarsi l'una dall'altra.
  2. Dissociare i fogli staccati o il monostrato di cellule nei pozzetti e quindi raccoglierli insieme in un tubo di polipropilene da 15 mL utilizzando mezzi basali di stadio 1/2 senza citochine contenenti almeno lo 0,5% di siero bovino fetale (FBS) o siero KnockOut (KOSR) (vedi Tabella dei materiali).
  3. Ruotare le cellule a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS sterile e risospendere il pellet in singole cellule.
  4. Contare le celle utilizzando un contatore automatico (vedere Tabella dei materiali) caricando il volume consigliato di celle nella diapositiva della camera. Ruotare le cellule risospese a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  5. Risospendere il pellet nel volume appropriato del mezzo di differenziazione dello stadio 2 contenente inibitore di roccia ad una densità di 2,5-3,5 x 105 cellule/cm2.
    NOTA: Questo conteggio può scendere a un rapporto di scissione 1: 2 per la maggior parte delle linee cellulari, a seconda del tasso di proliferazione. Il volume totale sarà di 2 ml di supporto con celle risospese in 1 pozzetto di piastra a 6 pozzetti.
  6. Placcare le cellule risospese su piastre rivestite di matrice di membrana 1:50 (preparate nella fase 2) e incubarle a 37 °C, 5% CO2 nell'incubatore.
  7. 24 ore dopo, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione dello stadio 2 senza inibitore di Rock (preparato al punto 1.3.2).

7. Generazione dell'intestino anteriore posteriore da hPSCs (Stadio 3)

  1. Aspirare il fluido esausto Stage 2 utilizzando un aspiratore sottovuoto portatile all'interno della cappa di coltura tissutale e lavare le cellule con PBS caldo.
  2. Aggiungere alle cellule i mezzi di differenziazione dello stadio 3 dalla fase 1.4 e incubare a 37 °C, 5% CO2.
  3. Dopo 24 ore, sostituire i supporti esausti con i mezzi di differenziazione Stage 3 appena preparati. Ripetere questa operazione per un totale di 4 giorni per il protocollo P2-D (ottimizzato) e solo 2 giorni per il P1-ND non dissociato.

8. Generazione di progenitori pancreatici da hPSCs (Stadio 4)

  1. Dopo 4 giorni di trattamento di fase 3, lavare le cellule con PBS caldo, ruotare delicatamente la piastra e aspirare utilizzando un aspiratore a vuoto portatile. Quindi, aggiungere i supporti di differenziazione Stage 4 dal passaggio 1.5 alle celle.
  2. Dopo 24 ore, sostituire i supporti esauriti con supporti Stage 4 appena preparati. Ripeti questa operazione per un totale di 4 giorni.

9. Valutazione dell'efficienza di differenziamento della generazione di progenitori pancreatici da hPSCs

  1. Eseguire l'analisi di immunofluorescenza dei progenitori pancreatici derivati da hPSC (Stadio 4) per l'espressione di PDX1 e NKX6.1.
    NOTA: PDX1 e NKX6.1 sono marcatori progenitori pancreatici ben consolidati17,18.
    1. Eseguire fissazione, permeabilizzazione, blocco e incubazione e lavaggio degli anticorpi secondo il passaggio 5.
    2. Colorare i progenitori pancreatici derivati da hPSC con una combinazione di anticorpi PDX1 e NKX6.1 (vedere Tabella dei materiali) diluiti in BSA al 2%-3% in PBST.
    3. Utilizzare 1:500 diluizioni di anticorpi secondari coniugati Alexa fluor 488 e 568 appropriati (vedere Tabella dei materiali).
  2. Eseguire analisi citometriche a flusso di progenitori pancreatici derivati da hPSC per l'espressione di PDX1 e NKX6.1.
    NOTA: L'analisi flusso-citometria dei marcatori pancreatici nei progenitori pancreatici derivati da hPSC generati fornisce un modo per quantificare le cellule co-esprimenti PDX1 e NKX6.1.
    1. Alla fine della fase 4, lavare le celle due volte con PBS caldo e aggiungere abbastanza TrypLE o Accutase per coprire la superficie dei pozzetti, ad esempio, 1 mL di TrypLE o Accutase per pozzetto di piastra a 6 pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore per 5-7 minuti o fino a quando le celle non si staccano dalla superficie.
    2. Dissociare i fogli aderenti di cellule all'interno del pozzetto utilizzando una micropipetta P1000 prima di raccoglierli in un tubo di polipropilene da 15 ml.
    3. Ruotare le cellule nei progenitori pancreatici derivati da hPSC a 800 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante. Lavare le cellule con PBS dissociandole in singole cellule. Contare le celle usando un contatore automatico (vedi Tabella dei materiali) e annotare la concentrazione nel numero di celle per ml.
    4. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Aggiungere 200 μL di PBS refrigerato al pellet e dissociare.
    5. Aggiungere 2 ml di etanolo refrigerato all'80% a goccia, con il tubo su un vortice a bassa-media velocità (400 x g a temperatura ambiente). Chiudere bene i tappi e posizionare i tubi leggermente inclinati sull'agitatore a 4 °C durante la notte.
    6. Ruotare le cellule a 800 x g per 5 minuti a 4 °C e lavare con PBS per dissociare eventuali grumi di cellule fisse.
    7. Bloccare le celle fisse con soluzione di BSA al 5%-6% in PBST per almeno 1 ora a temperatura ambiente o 4 °C durante la notte sull'agitatore.
    8. Colorazione per i marcatori progenitori pancreatici seguendo i passaggi seguenti.
      1. Distribuire 2.00.000 cellule per condizione, compresi appropriati controlli isotipici dipendenti dalla sottoclasse IgG della specie ospite dell'anticorpo primario, controlli anticorpali non colorati e secondari in una piastra inferiore a V a 96 pozzetti o provette da centrifuga da 1,5 ml.
      2. Ruotare la piastra a 800 x g per 5 minuti a 4 °C e capovolgere la piastra con un movimento rapido per eliminare il surnatante senza perdere il pellet. Preparare diluizioni di anticorpi primari in soluzione di BSA al 3% (vedere Tabella dei materiali).
        NOTA: La concentrazione di anticorpi primari può essere compresa tra 1:50 e 1:200.
      3. Incubare le cellule colorate per almeno 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C su uno shaker agitando delicatamente a bassa velocità.
      4. Lavare le cellule colorate con TBST tre volte pipettando le cellule su e giù nei pozzetti. Ruotare ed eliminare il surnatante come al punto 9.2.8.2.
      5. Aggiungere 1:500 diluizione di anticorpi secondari (anticorpi coniugati Alexa fluor 488 e 647) preparati in PBS (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
      6. Lavare le cellule colorate con TBST almeno due volte pipettando le cellule su e giù. Ruotare la piastra ed eliminare il surnatante come al punto 9.2.8.2.
      7. Raccogliere le cellule colorate in almeno 100 μL di PBS e trasferirle in tubi FACS protetti dalla luce (vedere Tabella dei materiali). Eseguire i campioni su una macchina per citometria a flusso.

Risultati

I risultati mostrano che il protocollo ottimizzato P2-D (Figure 1A) ha migliorato l'efficienza di differenziazione dei progenitori pancreatici sovraregolando la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 2A, B e Figura 3A). In particolare, i risultati hanno mostrato che la dissociazione delle cellule endodermiche e il loro replating sulla matrice di membrana fresca insieme a una maggiore durata dello stadio 3 hanno mig...

Discussione

Questo lavoro descrive un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici da hPSC con un'elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1. La dissociazione e la riplaccatura dell'endoderma derivato da hPSC a metà densità sulla matrice fresca hanno portato a PDX1 e NKX6.1 più elevati nei progenitori pancreatici derivati da hPSC.

Sebbene il cocktail di fattori di crescita per ogni stadio sia molto simile a P1-ND 27, è stato dimostrato che un trattamento più esteso dello stadio 3 ch...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well culture plates, flat bottom with lidCostar3524
50 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339652
6- well culture plates, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid freeSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucoseThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Inverted microscopeOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum replacementGibco10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)SigmaA92902Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in distilled water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonateSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer automated cell counterInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

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