Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники бета-клеток поджелудочной железы в системе 2D-культур

Резюме

Настоящий протокол описывает усовершенствованный метод увеличения коэкспрессии факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в планарных монослоях. Это достигается путем пополнения свежей матрицы, манипулирования плотностью клеток и диссоциации эндодермальных клеток.

Аннотация

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) являются отличным инструментом для изучения раннего развития поджелудочной железы и исследования генетических факторов диабета. Клетки, полученные из hPSC инсулина, могут быть получены для клеточной терапии и моделирования заболеваний, однако, с ограниченной эффективностью и функциональными свойствами. hPSC-производные предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками бета-клеток и других эндокринных клеток, при совместной экспрессии двух факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 указывают предшественников функциональных, инсулин-секретирующих бета-клеток как in vitro , так и in vivo. Предшественники поджелудочной железы, полученные из hPSC, в настоящее время используются для клеточной терапии у пациентов с диабетом 1 типа в рамках клинических испытаний. Однако современные процедуры не генерируют высокую долю NKX6.1 и предшественников поджелудочной железы, что приводит к когенерации нефункциональных эндокринных клеток и нескольких чувствительных к глюкозе, инсулин-секретирующих клеток. Таким образом, эта работа разработала расширенный протокол для генерации прародителей поджелудочной железы, полученных из hPSC, которые максимизируют совместную экспрессию PDX1 и NKX6.1 в 2D-монослое. Такие факторы, как плотность клеток, наличие свежей матрицы и диссоциация эндодермальных клеток, полученных из hPSC, модулируются, что увеличивает уровни PDX1 и NKX6.1 в генерируемых предшественниках поджелудочной железы и сводит к минимуму приверженность альтернативной печеночной линии. Исследование подчеркивает, что манипулирование физической средой клетки во время дифференцировки in vitro может повлиять на спецификацию родословной и экспрессию генов. Таким образом, текущий оптимизированный протокол облегчает масштабируемую генерацию коэкспрессионных предшественников PDX1 и NKX6.1 для клеточной терапии и моделирования заболеваний.

Введение

Диабет является сложным метаболическим расстройством, затрагивающим миллионы людей во всем мире. Добавление инсулина считается единственным вариантом лечения диабета. Более продвинутые случаи лечатся бета-клеточной заместительной терапией, достигаемой путем трансплантации либо целой трупной поджелудочной железы, либо островков ^1,2. Несколько вопросов связаны с трансплантационной терапией, такие как ограничение доступности и качества ткани, инвазивность процедур трансплантации в дополнение к постоянной потребности в иммунодепрессантах. Это обусловливает необходимость открытия новых и альтернативных вариантов бе....

протокол

Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) HMC (No 16260/16) и Катарским институтом биомедицинских исследований (QBRI) (No 2016-003). Эта работа оптимизирована для hESCs, таких как H1, H9 и HUES8. Образцы крови были получены от здоровых людей из больницы Hamad Medical Corporation (HMC) с полного информированного согласия. ИПСК генерируются из мононуклеарных клеток периферической крови (....

Результаты

Результаты показывают, что оптимизированный протокол P2-D (рис. 1A) повысил эффективность дифференцировки предшественников поджелудочной железы путем повышения регуляции совместной экспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 2A, B и рисунок 3A). В ?.......

Обсуждение

В данной работе описан усовершенствованный протокол генерации предшественников поджелудочной железы из гПСК с высокой коэкспрессией PDX1 и NKX6.1. Диссоциация и повторное покрытие эндодермы, полученной из hPSC, при половинной плотности на свежей матрице привели к повышению PDX1 и NKX6.1 у предше.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL, conical, centrifuge tubes	Thermo Scientific	339651
20X TBS Tween 20	Thermo Scientific	28360
24-well culture plates, flat bottom with lid	Costar	3524
50 mL, conical, centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652
6- well culture plates, multidish	Thermo Scientific	140685
Accutase	Stem Cell Technologies	0-7920
Activin A	R&D	338-AC	Reconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal	DSHB	F55A12-C	Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal	Abcam	ab47308	Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit A	ThermoFisher	12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free	Sigma	A7030
CHIR 99021	Tocris	4423	Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucose	ThermoFisher	41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488		A-21206
DPBS 1X	ThermoFisher	14190144
EGF	ThermoFisher	PHG0313	Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10	R&D	345-FG	Reconstituted in PBS
Glucose	Sigma Aldrich	G8644
Hoechst 33258	Sigma	23491-45-4
Inverted microscope	Olympus	IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)	Gibco	12660-012
KnockOut SR serum replacement	Gibco	10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)	Sigma	A92902	Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131	ThermoFisher	10372019
Mouse anti-SOX17	ORIGENE	CF500096	Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	85850	Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PES	ThermoFisher	566-0020
Nicotinamide	Sigma	72340	Reconstituted in distilled water
NOGGIN	R&D	6057-NG	Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	ChemCruz	sc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2	Cell signaling technology	3143	Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625	Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)	ReproCell	04-0012-02	Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE	Stellar Scientific	FSC-9010
SANT-1	Sigma Aldrich	S4572	Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
StemFlex	ThermoFisher	A3349401	Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis Slide	Invitrogen	T10794
Tali image-based cytometer automated cell counter	Invitrogen	T10796
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
TrypLE 100 mL	ThermoFisher	12563011
Tween 20	Sigma	P2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038