Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Настоящий протокол описывает усовершенствованный метод увеличения коэкспрессии факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в планарных монослоях. Это достигается путем пополнения свежей матрицы, манипулирования плотностью клеток и диссоциации эндодермальных клеток.
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) являются отличным инструментом для изучения раннего развития поджелудочной железы и исследования генетических факторов диабета. Клетки, полученные из hPSC инсулина, могут быть получены для клеточной терапии и моделирования заболеваний, однако, с ограниченной эффективностью и функциональными свойствами. hPSC-производные предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками бета-клеток и других эндокринных клеток, при совместной экспрессии двух факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 указывают предшественников функциональных, инсулин-секретирующих бета-клеток как in vitro , так и in vivo. Предшественники поджелудочной железы, полученные из hPSC, в настоящее время используются для клеточной терапии у пациентов с диабетом 1 типа в рамках клинических испытаний. Однако современные процедуры не генерируют высокую долю NKX6.1 и предшественников поджелудочной железы, что приводит к когенерации нефункциональных эндокринных клеток и нескольких чувствительных к глюкозе, инсулин-секретирующих клеток. Таким образом, эта работа разработала расширенный протокол для генерации прародителей поджелудочной железы, полученных из hPSC, которые максимизируют совместную экспрессию PDX1 и NKX6.1 в 2D-монослое. Такие факторы, как плотность клеток, наличие свежей матрицы и диссоциация эндодермальных клеток, полученных из hPSC, модулируются, что увеличивает уровни PDX1 и NKX6.1 в генерируемых предшественниках поджелудочной железы и сводит к минимуму приверженность альтернативной печеночной линии. Исследование подчеркивает, что манипулирование физической средой клетки во время дифференцировки in vitro может повлиять на спецификацию родословной и экспрессию генов. Таким образом, текущий оптимизированный протокол облегчает масштабируемую генерацию коэкспрессионных предшественников PDX1 и NKX6.1 для клеточной терапии и моделирования заболеваний.
Диабет является сложным метаболическим расстройством, затрагивающим миллионы людей во всем мире. Добавление инсулина считается единственным вариантом лечения диабета. Более продвинутые случаи лечатся бета-клеточной заместительной терапией, достигаемой путем трансплантации либо целой трупной поджелудочной железы, либо островков 1,2. Несколько вопросов связаны с трансплантационной терапией, такие как ограничение доступности и качества ткани, инвазивность процедур трансплантации в дополнение к постоянной потребности в иммунодепрессантах. Это обусловливает необходимость открытия новых и альтернативных вариантов бета-клеточной заместительной терапии 2,3. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) недавно стали многообещающим инструментом для понимания биологии поджелудочной железы человека и неисчерпывающим и потенциально более персонализированным источником для трансплантационной терапии 4,5,6,7. hPSCs, включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), обладают высокой способностью к самообновлению и дают начало любому типу тканей человеческого тела. hESCs получают из внутренней клеточной массы эмбриона, а hiPSCs перепрограммируются из любой соматической клетки 4,8.
Протоколы направленной дифференцировки оптимизированы для генерации бета-клеток поджелудочной железы из hPSCs, которые последовательно направляют hPSCs через стадии развития поджелудочной железы invitro. Эти протоколы генерируют островковые органоиды, полученные из hPSC. Хотя они значительно улучшились в увеличении доли бета-клеток поджелудочной железы в них, эффективность протоколов сильно варьируется. Он не увеличивается до более чем ~40% NKX6.1+/INSULIN+ или C-PEPTIDE + клеток 5,9,10,11,12,13. Однако генерируемые бета-клетки не полностью идентичны бета-клеткам взрослого человека с точки зрения их транскрипционных и метаболических профилей и их реакции на глюкозу 4,5,14. Бета-клеткам, полученным из hPSC, отсутствует экспрессия генов ключевых маркеров бета-клеток, таких как PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 и KCNK3 по сравнению с островками5 взрослых людей. Кроме того, бета-клетки, полученные из hPSC, уменьшают передачу сигналов кальция в ответ на глюкозу. Они загрязнены совместно генерируемыми полигормональными клетками, которые не секретируют соответствующее количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы5. С другой стороны, производные от hPSC предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками островков, могут генерироваться более эффективно in vitro по сравнению с бета-клетками и при трансплантации in vivo могут созревать в функциональные, секретирующие инсулин бета-клетки15,16. Клинические испытания в настоящее время сосредоточены на демонстрации их безопасности и эффективности при трансплантации у субъектов СД1.
Примечательно, что экспрессия транскрипционных факторов PDX1 (панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1) и NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) в пределах одной и той же клетки-предшественника поджелудочной железы имеет решающее значение для приверженности бета-клеточной линии5. Предшественники поджелудочной железы, которые не экспрессируют NKX6.1, дают начало полигормональным эндокринным клеткам или нефункциональным бета-клеткам17,18. Таким образом, высокая коэкспрессия PDX1 и NKX6.1 на стадии предшественника поджелудочной железы необходима для получения в конечном итоге большого количества функциональных бета-клеток. Исследования показали, что эмбриоидное тело или 3D-культура усиливает PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, где дифференцирующие клетки агрегируются, варьируясь между 40%-80% PDX1 + / NKX6.1 + популяции12,19. Однако, по сравнению с культурами суспензии, культуры 2D-дифференцировки являются более экономически эффективными, осуществимыми и удобными для применения на нескольких клеточных линиях5. Недавно мы показали, что монослойные дифференцировочные культуры дают более 90% PDX1+/NKX6.1+, коэкспрессирующих hPSC-производных предшественников поджелудочной железы 20,21,22. Сообщенный способ придавал высокую реплицирующую способность генерируемым прародителям поджелудочной железы и предотвращал альтернативные спецификации судьбы, такие как печеночная линия21. Таким образом, в настоящем описании данный протокол демонстрирует высокоэффективный способ дифференцировки гПСК к предшественникам бета-клеток поджелудочной железы, совместно экспрессирующим PDX1 и NKX6.1. Этот метод использует технику диссоциации эндодермы, полученной из hPSC, и манипулирования плотностью клеток с последующей расширенной передачей сигналов FGF и ретиноидов, а также ингибированием Hedgehog для стимулирования коэкспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 1). Этот метод может способствовать масштабируемой генерации прекурсоров бета-клеток поджелудочной железы, полученных из hPSC, для трансплантационной терапии и моделирования заболеваний.
Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) HMC (No 16260/16) и Катарским институтом биомедицинских исследований (QBRI) (No 2016-003). Эта работа оптимизирована для hESCs, таких как H1, H9 и HUES8. Образцы крови были получены от здоровых людей из больницы Hamad Medical Corporation (HMC) с полного информированного согласия. ИПСК генерируются из мононуклеарных клеток периферической крови (ПБМК) контрольного, здорового индивидуума23.
1. Подготовка питательных сред
2. Приготовление посуды с матричным покрытием из базальной мембраны
3. Культура недифференцированных HPSC
4. Индукция дифференциации окончательной энтодермы (DE) в гПСК (Стадия 1)
5. Иммунофлуоресцентный анализ ДЭ, полученного из hPSC (Стадия 1)
6. Генерация примитивной кишечной трубки (PGT) из hPSCs (Стадия 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Если иммунофлуоресцентный анализ на стадии 5.13 определяется как коэкспрессия SOX17-FOXA2 80% и выше, эксперимент переходит к стадии 2. Если эффективность составляет <80%, продлите продолжительность стадии с 1 до 4 дней.
7. Генерация задней передней кишки из гПСК (Стадия 3)
8. Генерация прародителей поджелудочной железы из hPSCs (Стадия 4)
9. Оценка эффективности дифференцировки генерации прародителей поджелудочной железы из гПСК
Результаты показывают, что оптимизированный протокол P2-D (рис. 1A) повысил эффективность дифференцировки предшественников поджелудочной железы путем повышения регуляции совместной экспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 2A, B и рисунок 3A). В ?...
В данной работе описан усовершенствованный протокол генерации предшественников поджелудочной железы из гПСК с высокой коэкспрессией PDX1 и NKX6.1. Диссоциация и повторное покрытие эндодермы, полученной из hPSC, при половинной плотности на свежей матрице привели к повышению PDX1 и NKX6.1 у предше...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа финансировалась за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No. НПРП10-1221-160041).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
Portable vacuum aspirator | |||
Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
Tween 20 | Sigma | P2287 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены