Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), erken pankreas gelişimini incelemek ve diyabete genetik katkıda bulunanları araştırmak için mükemmel bir araçtır. Bununla birlikte, hPSC türevi insülin salgılayan hücreler, hücre tedavisi ve hastalık modellemesi için sınırlı verimlilik ve fonksiyonel özelliklerle üretilebilir. Beta hücrelerinin ve diğer endokrin hücrelerin öncüsü olan hPSC türevli pankreas progenitörleri, iki transkripsiyon faktörü PDX1 ve NKX6.1'i birlikte eksprese ettiklerinde, hem in vitro hem de in vivo olarak işlevsel, insülin salgılayan beta hücrelerinin progenitörlerini belirtir. hPSC kaynaklı pankreas progenitörleri şu anda klinik çalışmaların bir parçası olarak tip 1 diyabet hastalarında hücre tedavisi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, mevcut prosedürler yüksek oranda NKX6.1 ve pankreas progenitörleri üretmemekte, bu da fonksiyonel olmayan endokrin hücrelerin ve az sayıda glikoza duyarlı, insülin salgılayan hücrelerin birlikte üretilmesine yol açmaktadır. Bu nedenle bu çalışma, PDX1 ve NKX6.1'in 2D tek katmanda birlikte ekspresyonunu en üst düzeye çıkaran hPSC türevi pankreas progenitörleri üretmek için gelişmiş bir protokol geliştirdi. Hücre yoğunluğu, taze matriksin mevcudiyeti ve hPSC kaynaklı endodermal hücrelerin ayrışması gibi faktörler, üretilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 seviyelerini artıran ve alternatif hepatik soya olan bağlılığı en aza indiren modüle edilmiştir. Çalışma, in vitro farklılaşma sırasında hücrenin fiziksel ortamını manipüle etmenin soy spesifikasyonunu ve gen ekspresyonunu etkileyebileceğini vurgulamaktadır. Bu nedenle, mevcut optimize edilmiş protokol, hücre tedavisi ve hastalık modellemesi için PDX1 ve NKX6.1 birlikte eksprese eden progenitörlerin ölçeklenebilir üretimini kolaylaştırır.

Giriş

Diyabet, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen karmaşık bir metabolik bozukluktur. İnsülin takviyesi diyabet için tek tedavi seçeneği olarak kabul edilir. Daha ileri vakalar, tüm kadavra pankreasının veya adacıkların transplantasyonu yoluyla elde edilen beta hücre replasman tedavisi ile tedavi edilir 1,2. Transplantasyon tedavisini, dokunun mevcudiyeti ve kalitesi ile sınırlama, transplantasyon prosedürlerinin invazivliği ve immünsüpresanlara olan sürekli ihtiyaç gibi çeşitli konuları çevrelemektedir. Bu, beta hücre replasman tedavisi için yeni ve alternatif seçeneklerin araştırılması ihtiyacını doğurmaktadır 2,3. İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) son zamanlarda insan pankreas biyolojisini anlamak için umut verici bir araç ve transplantasyon tedavisi için kapsamlı olmayan ve potansiyel olarak daha kişiselleştirilmiş bir kaynak olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6,7. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) dahil olmak üzere hPSC'ler, yüksek bir kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve insan vücudunun herhangi bir doku tipine yol açar. hESC'ler embriyonun iç hücre kütlesinden türetilir ve hiPSC'ler herhangi bir somatik hücre 4,8'den yeniden programlanır.

Yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri, hPSC'leri pankreas gelişim aşamaları boyunca invitro olarak sıralı olarak yönlendiren hPSC'lerden pankreas beta hücreleri üretmek için optimize edilmiştir. Bu protokoller hPSC türevi adacık organoidleri üretir. Oradaki pankreas beta hücrelerinin oranını arttırmada büyük ölçüde iyileşmiş olsalar da, protokollerin etkinliği oldukça değişkendir. NKX6.1 + / INSÜLİN + veya C-PEPTIDE + hücrelerinin ~% 40'ından fazlasına artmaz 5,9,10,11,12,13. Bununla birlikte, üretilen beta hücreleri, transkripsiyonel ve metabolik profilleri ve glikoza tepkileri açısından yetişkin insan beta hücreleri ile tamamen aynı değildir 4,5,14. hPSC türevi beta hücreleri, yetişkin insan adacıkları5'e kıyasla PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 ve KCNK3 gibi anahtar beta hücre belirteçlerinin gen ekspresyonundan yoksundur. Ek olarak, hPSC kaynaklı beta hücreleri, glikoza yanıt olarak kalsiyum sinyalini azaltmıştır. Artan glikoz seviyelerine yanıt olarak uygun miktarda insülin salgılamayan birlikte üretilen polihormonal hücrelerle kontamine olurlar5. Öte yandan, adacık öncüleri olan hPSC türevi pankreas progenitörleri, beta hücrelerine kıyasla in vitro olarak daha verimli bir şekilde üretilebilir ve in vivo olarak nakledildiğinde, işlevsel, insülin salgılayan beta hücrelerine olgunlaşabilir15,16. Klinik çalışmalar şu anda T1D deneklerinde transplantasyon üzerine güvenliklerini ve etkinliklerini göstermeye odaklanmıştır.

Özellikle, aynı pankreas progenitör hücresi içinde PDX1 (Pankreatik ve Duodenal Homeobox 1) ve NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu, beta hücre soyu5'e bağlılık için çok önemlidir. NKX6.1'i eksprese edemeyen pankreas progenitörleri, polihormonal endokrin hücrelere veya fonksiyonel olmayan beta hücrelerine yol açar17,18. Bu nedenle, pankreas progenitör aşamasında PDX1 ve NKX6.1'in yüksek bir birlikte ekspresyonu, sonuçta çok sayıda fonksiyonel beta hücresi üretmek için gereklidir. Çalışmalar, bir embriyoid cismin veya 3D kültürünün, farklılaşan hücrelerin toplandığı pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1'i geliştirdiğini, PDX1 + / NKX6.1+ popülasyonunun% 40-80'i arasında değiştiğini göstermiştir. Bununla birlikte, süspansiyon kültürleriyle karşılaştırıldığında, 2B farklılaşma kültürleri daha uygun maliyetli, uygulanabilir ve çoklu hücre hatlarında uygulama için uygundur5. Son zamanlarda, tek katmanlı farklılaşma kültürlerinin PDX1 + / NKX6.1 + 'nın %90'ından fazlasını verdiğini ve hPSC türevi pankreas progenitörlerinin20,21,22 ile birlikte eksprese edildiğini gösterdik. Bildirilen yöntem, üretilen pankreas progenitörlerine yüksek bir çoğaltma kapasitesi verdi ve hepatik soy21 gibi alternatif kader spesifikasyonlarını önledi. Bu nedenle, burada, bu protokol, hPSC'lerin PDX1 ve NKX6.1'i birlikte eksprese eden pankreas beta hücre öncüllerine farklılaşması için oldukça etkili bir yöntem göstermektedir. Bu yöntem, hPSC kaynaklı endodermi ayrıştırma ve hücre yoğunluğunu manipüle etme tekniğini, ardından genişletilmiş bir FGF ve Retinoid sinyallemesinin yanı sıra PDX1 ve NKX6.1 eş ekspresyonunu teşvik etmek için Kirpi inhibisyonunu kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, transplantasyon tedavisi ve hastalık modellemesi için hPSC türevi pankreas beta hücre öncüllerinin ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesini kolaylaştırabilir.

Protokol

Çalışma, uygun kurumsal araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde veya karşılaştırılabilir etik standartlarda belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, HMC Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) (no. 16260/16) ve Katar Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (QBRI) (no. 2016-003) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma H1, H9 ve HUES8 gibi hESC'ler için optimize edilmiştir. Hamad Medical Corporation (HMC) hastanesinden sağlıklı bireylerden tam bilgilendirilmiş onam ile kan örnekleri alındı. iPSC'ler, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) kontrol edilir, sağlıklı birey23.

1. Kültür ortamının hazırlanması

  1. İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC) kültür ortamını hazırlama
    1. 100 ünite / mL Penisilin ve 100 ug / mL Streptomisin takviyesi yaparak insan embriyonik kök hücrelerini korumak ve genişletmek için ticari olarak temin edilebilen ortamdan hPSC kültür medyası hazırlayın (bkz. Aliquot ve tüm ortamı uzun süre -20 ° C'de veya hemen kullanım için 4 ° C'de saklayın.
  2. Aşama 1 farklılaşma ortamını hazırlayın (Definitive Endoderm (DE) için).
    1. MCDB 131 ortamından bazal medyayı,% 0.5 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (FFA-BSA), 1.5 g / L Sodyum bikarbonat (NaHCO3), 10 mM glikoz, 2 mM Glutamax, 100 birim / mL Penisilin ve 100 μg / mL Streptomisin ile destekleyerek hazırlayın (bkz. Hazırlanan medyayı 0,2 μm filtre kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
    2. Bazal ortamı 37 ° C'de ısıtarak ve daha sonra 2 μM CHIR99021, 100 ng / mL Activin A, 10 μM Rock inhibitörü (Y-27632) ve 0.25 mM C vitamini ile takviye ederek Bazal ortamdan (adım 1.2.1'de hazırlanan) CHIR99021 içeren Aşama 1 ortamını hazırlayın (bkz. Takviyeli ortamı iyice karıştırın ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
      NOT: Bu ortam yalnızca farklılaşmanın ilk gününde kullanılacaktır.
    3. Bazal ortamdan CHIR99021 olmadan Aşama 1 ortamını 37 ° C'de ısıtarak ve 100 ng / mL Aktivin A ve 0.25 mM C vitamini ile destekleyerek hazırlayın ve iyice karıştırın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak bu ortama 5 ng/mL temel FGF veya FGF2 eklenebilir. Bu medya, Aşama 1'in kalan günleri için kullanılacaktır.
  3. Aşama 2 farklılaşma ortamını hazırlayın (İlkel Bağırsak Tüpü için; PGT).
    1. Bazal ortamdan Kaya inhibitörü içeren Aşama 2 farklılaşma ortamını 37 ° C'de ısıtarak ve 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Kaya inhibitörü) ve 0.25 mM C vitamini ile takviye ederek hazırlayın.
      NOT: Bu ortam, endodermal hücrelerin ayrıştığı gün kullanılır.
    2. Kaya inhibitörü hariç, adım 1.3.1'de hazırlanan Medya için aynı prosedürü izleyerek Aşama 2 farklılaşma ortamını Rock inhibitörü olmadan hazırlayın.
      NOT: Bu medya, Aşama 2'nin ikinci gününde kullanılır.
  4. Aşama 3 farklılaşma ortamını hazırlayın (Posterior Foregut için).
    1. 4.5 g / L Glikoz içeren DMEM ortamını hazırlayın, daha sonra% 1 Penisilin-streptomisin ve 2 mM Glutamax ile takviye edin ve Aşama 3 ve 4 için bazal medya olarak kullanın.
    2. DMEM ortamını ısıtın (adım 1.4.1'de hazırlanmıştır) ve 2 μM Retinoik asit, 0.25 μM SANT-1, 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 mM C vitamini ve% 1 B27 takviyesi ile takviye edin (bkz.
      NOT: Bu medya, P2-D için 4 günlük Aşama 3 (Protokol 2, optimize edilmiş, ayrıştırılmış) ve P1-ND için 2 günlük Aşama 3 (Protokol 1, optimize edilmemiş, ayrışmamış) için kullanılır.
  5. Aşama 4 farklılaşma ortamını hazırlayın (Pankreatik Progenitörler için).
    1. 100 ng / mL EGF, 10 mM Nikotinamid, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 mM C Vitamini ve% 1 B27 takviyesi içeren DMEM içeren DMEM'i A vitamini olmadan ekleyin (bkz. Bu medyayı Aşama 4'ün tüm günlerinde kullanın.
      NOT: Tüm reaktifleri uygun sıcaklıklarda tutun ve tüm sitokin ve hassas reaktiflerin aliquoted edilmesi gerekir. Aliquoted reaktifleri çözün ve farklılaşma ortamını değiştirirken bazal medyaya ekleyin. Farklı farklılaşma ortamlarının bileşimleri Tablo 1'de verilmiştir.

2. Bodrum membran matris kaplı tabakların hazırlanması

  1. Ticari olarak temin edilebilen bodrum matrisini (bakınız Malzeme Tablosu) ve buz üzerinde aliquot'u çözün; alikotları -20 °C'de dondurun.
  2. Doku kültürü tabaklarını kaplamadan önce, dondurulmuş alikotları buz üzerinde çözün. İstenilen seyreltilmiş konsantrasyonu elde etmek ve iyice karıştırmak için soğutulmuş KO-DMEM/F-12 ortamına (KnockOut DMEM/F-12) membran matris çözeltisinin uygun hacmini ekleyin (bkz. Seyreltilmiş matris çözeltisini hemen kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
  3. Doku kültürü ile işlenmiş plakaların yüzeyini ( bakınız Malzeme Tablosu) seyreltilmiş membran matris çözeltisi ile örtün ve hücreleri kaplamadan önce plakaları en az 60 dakika boyunca 37 ° C'ye yerleştirin. Pankreatik farklılaşma deneyi için hücreleri kaplamak için KO-DMEM / F-12'deki membran matris çözeltisinin 1:50'lik bir seyreltilmesini ve farklılaşmamış hPSC'lerin genişlemesi için 1:80'lik bir seyreltme kullanın.

3. Farklılaşmamış hPSC'lerin kültürü

  1. Koloniler %70-%80 akıcılığa ulaştığında hPSC'lerden geçin.
  2. Geçiş yapmak için, hPSC'leri bir kez ılık PBS ile yıkayın, doku kültürü davlumbazının içine taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak aspire edin ve koloni yüzeyini kaplamak için PBS'ye 0,5 mM EDTA çözeltisi ekleyin. 37 °C'de, 1 dakika boyunca% 5 CO2'de veya kolonilerin sınırları plaka yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin.
  3. EDTA çözeltisini çıkarın ve bir P1000 mikropipet kullanarak hPSC kültür ortamı ile ayrılan kolonileri toplayın. Toplanan hücreleri oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 128 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri 10 μM Y-27632 (Kaya inhibitörü)23,24 içeren hPSC kültür ortamı ile destekleyin.
    NOT: hPSC'leri 1:80 membran matris kaplı tabaklarda en az 1:3 oranında geçirin. Bununla birlikte, farklılaştırma deneyleri için, hPSC'leri 1:50 kaplı tabaklara tabaklayın.

4. hPSC'lerde Kesin Endoderm (DE) farklılaşmasının indüksiyonu (Aşama 1)

  1. hPSC kolonileri% 70 -% 80'lik bir akıcılığa ulaştığında, bunları iki kez ılık PBS ile yıkayın ve Aşama 1 farklılaşmasına başlamak için doku kültürü davlumbazının içinde taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak aspire edin.
  2. Kolonilere CHIR99021 (adım 1.2.2'den) içeren Aşama 1 farklılaşma ortamı, 6 kuyucuklu plaka başına 2 mL ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Ertesi gün, harcanan medyayı CHIR99021 olmadan Aşama 1 farklılaştırma ortamıyla değiştirin (adım 1.2.3).
  4. Her 24 saatte bir, doku kültürü davlumbazının içinde taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak harcanan ortamı aspire edin ve CHIR99021 olmadan yeni bir Aşama 1 farklılaştırma ortamı ile değiştirin.
    NOT: Aşama 1 4 güne kadar uzatılabilir. Aşama 1'in uzunluğu, kullanılan hPSC hattına bağlıdır ve buna göre optimize edilmelidir.

5. hPSC türevi DE'nin immünofloresan analizi (Aşama 1)

  1. İmmünofloresan için, kuyucuklardan doku kültürü davlumbazının içine taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak harcanan ortamı aspire edin ve sıcak PBS ile iki kez yıkayın. Herhangi bir hücre enkazından kurtulmak için plakayı döndürün.
  2. DE hücrelerini sabitlemek için kuyucukların yüzeyini% 4 paraformaldehit (PFA) ile örtün; örneğin, 24 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 250 uL PFA ekleyin. Plakayı 20 dakika boyunca 20 x g'de bir 2D çalkalayıcıya yerleştirin.
  3. Fiksasyondan sonra, DE hücrelerini% 0.5 Ara (TBST) ile tris tamponlu salin ile yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve plakayı çalkalayıcıya 10 dakika boyunca 20 x g'de yerleştirin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  4. Triton X-100'ün% 0.5'i (PBST) ile cömert miktarda fosfat tamponlu salin ekleyerek sabit hücreleri geçirgenleştirin; Örneğin, 24 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 1 mL PBST ekleyin ve plakayı 20 dakika boyunca 20 x g'de çalkalayıcıya geri yerleştirin.
  5. PBST'de BSA'nın% 5-6'sını bloke edici tampon olarak taze olarak hazırlayın ve geçirgenleştirilmiş hücrelere ekleyin. Plakayı, çalkalayıcı üzerindeki blokaj çözeltisinde en az 1 saat boyunca inkübe edin.
  6. SOX17 ve FOXA2'ye karşı birincil antikorları PBST çözeltisinde% 2 -% 3 BSA içinde birlikte seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kombine antikorları bloke olmuş hücrelere ekleyin ve plakayı çalkalayıcının üzerine gece boyunca 4 ° C'de düşük bir hızda hafifçe sallayarak yerleştirin.
    NOT: SOX17 ve FOXA2, iyi kurulmuş DE işaretleyicileri 25,26'dır.
  7. Ertesi gün, taşınabilir bir vakum filtresi kullanarak birincil antikorları aspire edin ve kuyucukları TBST ile üç kez yıkayın, her biri çalkalayıcıda 10 dakika boyunca yıkayın.
  8. Alexa fluor 488- ve 568- konjuge sekonjuge sekonder antikorların 1:500 seyreltilmesini hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu) birincil antikorların yetiştirildiği türlere karşı.
  9. İkincil antikor kombinasyonunu lekeli kuyucuğa ekleyin ve ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün. Plakayı çalkalayıcıya oda sıcaklığında 1 saat boyunca yerleştirin.
  10. Sekonder antikor çözeltisini taşınabilir bir vakum filtresi kullanarak aspire edin ve lekeli kuyucukları çalkalayıcı üzerinde TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın, plakayı folyo ile kaplayın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.
  11. Çekirdekleri boyamak için PBS'de 1 μg/mL Hoechst 33342 seyreltme hazırlayın. Hoechst çözeltisini kuyucuklara ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya 2-3 dakika yerleştirin.
  12. Hoechst çözeltisini portatif bir vakum filtresi kullanarak aspire edin ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın.
  13. Son olarak, lekeli hücrelere PBS ekleyin ve karanlıkta ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak bunları görüntüleyin (bkz. Florofor ağartmasını en aza indirmek için görüntüleme yapmadığınızda plakayı folyo ile kapalı tutun.
    NOT: Alternatif olarak, adım 9.2'de açıklandığı gibi DE verimliliğini değerlendirmek için akış sitometrisi kullanılabilir.

6. hPSC'lerden ilkel bağırsak tüpünün (PGT) üretilmesi (Aşama 2)

NOT: Adım 5.13'teki immünofloresan analizinin% 80 ve üzeri bir SOX17-FOXA2 ortak ekspresyonu olduğu belirlenirse, deney Aşama 2'ye geçer. Verimlilik% <80 ise, Aşama 1'in süresini 4 güne uzatın.

  1. Aşama 2'nin 1. gününde, optimize edilmiş P2-D protokolü için TripLE veya Accutase kullanarak hPSC kaynaklı endodermal hücreleri ayırın (bkz. Yapışkan hücreleri ılık PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 3-5 dakika boyunca veya hücreler birbirinden ayrılmaya başlayana kadar 6 delikli bir plakanın kuyucuğuna ılık 1 mL TripLE veya Accutase çözeltisi ekleyin.
  2. Ayrılan tabakaları veya tek katmanlı hücreleri kuyucuklarda ayırın ve daha sonra fetal sığır serumunun (FBS) veya Nakavt serumunun (KOSR) en az% 0.5'ini içeren sitokinler içermeyen bazal Aşama 1/2 ortam kullanarak 15 mL'lik bir polipropilen tüpte bir araya getirin (bkz.
  3. Hücreleri 800 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın. 1 mL steril PBS ekleyin ve peleti tek hücrelere yeniden askıya alın.
  4. Otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın (bkz. Malzeme Tablosu), oda slaytına önerilen hücre hacmini yükleyerek. Yeniden askıya alınmış hücreleri 800 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın.
  5. Pelet, 2.5-3.5 x 105 hücre/ cm2 yoğunlukta Kaya inhibitörü içeren Aşama 2 farklılaşma ortamının uygun hacminde yeniden askıyaalın.
    NOT: Bu sayım, çoğalma hızına bağlı olarak çoğu hücre hattı için 1: 2 bölünme oranına düşebilir. Toplam hacim, 1 kuyucukta 6 delikli plakada yeniden askıya alınmış hücrelere sahip 2 mL ortam olacaktır.
  6. Yeniden askıya alınan hücreleri 1:50 membran matris kaplı plakalara (2. adımda hazırlanan) tabaklayın ve inkübatörde 37 °C'de,% 5 CO2'de inkübe edin.
  7. 24 saat sonra, ortamı Rock inhibitörü olmadan Aşama 2 farklılaşma ortamı ile değiştirin (adım 1.3.2'de hazırlanır).

7. hPSC'lerden posterior foregut üretimi (Aşama 3)

  1. Doku kültürü davlumbazının içine taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak harcanan Aşama 2 ortamını aspire edin ve hücreleri ılık PBS ile yıkayın.
  2. Hücrelere adım 1.4'ten Aşama 3 farklılaşma ortamı ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin.
  3. 24 saat sonra, harcanan ortamı taze hazırlanmış Aşama 3 farklılaştırma ortamı ile değiştirin. Bunu P2-D protokolü (optimize edilmiş) için toplam 4 gün ve ayrışmamış P1-ND için yalnızca 2 gün tekrarlayın.

8. hPSC'lerden Pankreatik Progenitörlerin Üretimi (Aşama 4)

  1. 4 günlük Aşama 3 tedavisinden sonra, hücreleri ılık PBS ile yıkayın, plakayı hafifçe döndürün ve taşınabilir bir vakum aspiratörü kullanarak aspire edin. Ardından, hücrelere adım 1.5'ten Aşama 4 farklılaştırma medyası ekleyin.
  2. 24 saat sonra, harcanan ortamı taze hazırlanmış Aşama 4 ortamla değiştirin. Bunu toplam 4 gün boyunca tekrarlayın.

9. hPSC'lerden pankreas progenitörleri üretmenin farklılaşma etkinliğinin değerlendirilmesi

  1. PDX1 ve NKX6.1'in ekspresyonu için hPSC kaynaklı pankreas progenitörlerinin (Aşama 4) immünofloresan analizini gerçekleştirin.
    NOT: PDX1 ve NKX6.1 iyi bilinen pankreatik progenitör belirteçleri17,18'dir.
    1. Fiksasyon, geçirgenlik, blokaj ve antikor inkübasyonu yapın ve adım 5'e göre yıkayın.
    2. PBST'de% 2-3 BSA ile seyreltilmiş PDX1 ve NKX6.1 antikorlarının bir kombinasyonu ile hPSC türevli pankreas progenitörlerini (bakınız Malzeme Tablosu) sabitleyin.
    3. Uygun Alexa fluor 488- ve 568- konjuge sekonjuge sekonder antikorların 1:500 seyreltisini kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. PDX1 ve NKX6.1'in ekspresyonu için hPSC türevi pankreas progenitörlerinin akış sitometri analizini gerçekleştirin.
    NOT: Üretilen hPSC türevi pankreas progenitörlerindeki pankreas belirteçlerinin akış sitometrisi analizi, PDX1 ve NKX6.1 birlikte eksprese eden hücreleri ölçmek için bir yol sağlar.
    1. Aşama 4'ün sonunda, hücreleri iki kez ılık PBS ile yıkayın ve kuyucukların yüzeyini örtmek için yeterli TripLE veya Accutase ekleyin, örneğin, 6 kuyucuklu plaka kuyucuğu başına 1 mL TripLE veya Accutase. Plakayı inkübatöre 5-7 dakika veya hücreler yüzeyden ayrılana kadar yerleştirin.
    2. 15 mL'lik bir polipropilen tüpte toplamadan önce bir P1000 mikropipet kullanarak kuyu içindeki yapışkan hücre tabakalarını ayırın.
    3. hPSC türevi pankreas progenitörlerindeki hücreleri 800 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürün, ardından süpernatanı atın. Hücreleri tek hücrelere ayırarak PBS ile yıkayın. Otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve mL başına hücre sayısındaki konsantrasyonu not edin.
    4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de döndürün ve süpernatanı atın. Pelet üzerine 200 μL soğutulmuş PBS ekleyin ve ayrışın.
    5. Damla yönünde 2 mL soğutulmuş% 80 etanol ekleyin, tüp düşük-orta hızda (oda sıcaklığında 400 x g ) bir vorteks üzerinde. Kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri çalkalayıcıya hafifçe eğilmiş olarak gece boyunca 4 ° C'de yerleştirin.
    6. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de döndürün ve sabit hücre kümelerini ayırmak için PBS ile yıkayın.
    7. Sabit hücreleri PBST'de% 5-6% BSA çözeltisi ile oda sıcaklığında en az 1 saat veya çalkalayıcıda gece boyunca 4 °C bloke edin.
    8. Aşağıdaki adımları izleyerek pankreas progenitör belirteçleri için leke.
      1. Birincil antikorun konakçı türünün IgG alt sınıfına bağlı uygun izotip kontrolleri, 96 kuyucuklu V alt plakada veya 1.5 mL santrifüj tüplerinde lekesiz ve ikincil antikor kontrolleri dahil olmak üzere durum başına 2.00.000 hücre dağıtın.
      2. Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün ve topakları kaybetmeden süpernatantı atmak için plakayı hızlı bir hareketle çevirin. Primer antikor seyreltilerini %3 BSA çözeltisinde hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
        NOT: Primer antikorların konsantrasyonu 1:50 ila 1:200 arasında olabilir.
      3. Lekeli hücreleri oda sıcaklığında en az 2 saat veya düşük hızda hafifçe sallanan bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      4. Lekeli hücreleri, kuyucuklarda yukarı ve aşağı pipetleyerek TBST ile üç kez yıkayın. Süpernatantı 9.2.8.2 adımında olduğu gibi döndürün ve atın.
      5. PBS'de hazırlanan sekonder antikorların (Alexa fluor 488- ve 647-konjuge antikorlar) 1:500 seyreltilmesini ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      6. Lekeli hücreleri, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek en az iki kez TBST ile yıkayın. Plakayı döndürün ve süpernatantı adım 9.2.8.2'deki gibi atın.
      7. Lekeli hücreleri en az 100 μL PBS içinde toplayın ve ışık korumalı FACS tüplerine aktarın (bkz. Örnekleri bir akış sitometri makinesinde çalıştırın.

Sonuçlar

Sonuçlar, optimize edilmiş P2-D protokolünün (Şekil 1A) PDX1 ve NKX6.1 birlikte ekspresyonunu yükselterek pankreas progenitör farklılaşma verimliliğini artırdığını göstermektedir (Şekil 2A, B ve Şekil 3A). Özellikle, sonuçlar, endodermal hücrelerin ayrışmasının ve taze membran matrisi üzerinde yeniden kaplanmasının, daha önce yayınlanmış bir çalışmadan modifiye edilmiş ayrışmam?...

Tartışmalar

Bu çalışma, PDX1 ve NKX6.1'in yüksek bir eş ekspresyonuna sahip hPSC'lerden pankreas progenitörleri üretmek için geliştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır. hPSC türevi endodermin taze matriks üzerinde yarı yoğunlukta ayrışması ve yeniden kaplanması, hPSC türevi pankreas progenitörlerinde daha yüksek PDX1 ve NKX6.1 ile sonuçlandı.

Her aşama için büyüme faktörü kokteyli P1-ND 27'ye oldukça benzer olmasına rağmen, FGF ve retinoid sinyalleme ve BMP ve kirpi inh...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Katar Ulusal Araştırma Fonu'ndan (QNRF) bir hibe ile finanse edilmiştir (Hibe No. NPRP10-1221-160041).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well culture plates, flat bottom with lidCostar3524
50 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339652
6- well culture plates, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid freeSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucoseThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Inverted microscopeOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum replacementGibco10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)SigmaA92902Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in distilled water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonateSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer automated cell counterInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

Referanslar

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır