研究夜间人造光对自由放养动物影响的实验方法:实施，结果和未来研究的方向

摘要

夜间人造光（ALAN）具有广泛的生物效应。本文介绍了一种在监控行为时在巢箱内操作 ALAN 的系统，该系统由连接到电池、定时器和支持音频的红外摄像机的 LED 灯组成。 研究人员可以利用该系统来探索有关ALAN对生物体影响的许多悬而未决的问题。

摘要

动物已经进化出光明和黑暗的自然模式。然而，人造光正越来越多地从人类基础设施和娱乐活动中引入环境。夜间人造光（ALAN）有可能对动物行为，生理学和适应性产生广泛影响，这可以转化为对种群和社区的更广泛影响。了解ALAN对自由放养动物的影响并非易事，因为存在诸如测量移动生物遇到的光照水平以及将ALAN的影响与其他人为干扰因素的影响区分开来等挑战。在这里，我们描述了一种方法，该方法使我们能够通过实验性地操纵巢箱内的光照水平来隔离人造光照射对个体动物的影响。为此，可以使用由附着在板上并连接到电池和定时器系统的发光二极管（LED）光组成的系统。该设置允许巢箱内的个体暴露在ALAN的不同强度和持续时间下，同时获得视频记录，其中还包括音频。该系统已被用于对自由放养的大山雀（Parus major）和蓝山雀（Cyanistes caeruleus）的研究，以深入了解ALAN如何影响成人的睡眠和活动模式以及发育雏鸟的生理学和端粒动力学。该系统或其适应性可用于回答许多其他有趣的研究问题，例如ALAN如何与其他干扰因子相互作用并影响生物能量平衡。此外，类似的系统可以安装在各种物种的巢箱，巢穴或洞穴中或附近，以操纵ALAN的水平，评估生物反应，并致力于建立种间视角。特别是当与其他监测自由生活动物的行为和运动的先进方法相结合时，这种方法有望为我们理解ALAN的生物学意义做出持续的贡献。

引言

动物已经进化出定义白天和黑夜的光明和黑暗的自然模式。因此，荷尔蒙系统中的昼夜节律协调休息和活动模式，并允许动物最大限度地提高健身^1，2，3。例如，糖皮质激素中的昼夜节律在日常活动开始时达到峰值，通过对葡萄糖代谢和对环境应^{激源的反应}，使脊椎动物在24小时内表现适当4。同样，在黑暗中释放的松果体激素褪黑激素与昼夜节律性的控制模式有关，并且还具有抗氧化特性^5，6。昼夜节律性的许多方面的夹带，例如褪黑激素的释放，受到环境中光照水平的光接收的影响。因此，将人造光引入环境以支持人类活动，娱乐和基础设施有可能对自由放养动物的行为，生理和适应性产生广泛的影响^7，8。事实上，夜间暴露于人造光（ALAN）的各种影响已被记录为^9，10，并且ALAN已被强调为21世纪^10年全球变化研究的优先事项。

由于多种原因，测量ALAN对自由放养动物的影响带来了不小的挑战。首先，在环境中移动的动物不断经历不同程度的光照。因此，如何量化单个动物暴露的光照水平？即使可以量化动物领地上的光照水平，动物也可能采用影响暴露模式的回避策略，从而要求同时跟踪动物的位置和光照水平。事实上，在大多数实地研究中，光照水平的平均值和变化是未知的¹¹。其次，暴露于ALAN通常与暴露于其他人为干扰因素有关，例如噪声污染，化学品暴露和栖息地退化。例如，占据道路边缘栖息地的动物将暴露在路灯的光线，车辆交通的噪音和车辆排放的空气污染中。那么，如何有效地将 ALAN 的影响与混杂变量的影响隔离开来呢？能够对光照水平和反应变量进行良好测量的严格现场实验对于评估ALAN生物效应的严重程度以及制定有效的缓解策略至关重要¹¹。

本文描述了一种实验方法，尽管并非没有限制（参见讨论部分），但有助于缓解（如果不是消除上述困难的话）。该方法需要使用发光二极管（LED）灯系统和安装在巢箱内的红外（IR）摄像机，在自由生活的昼夜鸟类大山雀（Parus major）的巢箱内实验性地操纵ALAN水平。该设置可以同时采集视频记录，包括音频，使研究人员能够评估对行为和发声的影响。大山雀利用巢箱繁殖，并在11月至3月期间睡在巢箱中。雌性在繁殖季节¹²期间也会睡在巢箱内。该系统也已在较小程度上用于研究ALAN对蓝山雀（Cyanistes caeruleus）的影响。第一个困难，涉及了解动物遇到的光照水平，由于个体愿意进入巢箱（或者在不动的雏鸟的情况下已经在巢箱中），光照水平可以由研究人员精确确定。第二个困难涉及与混杂变量的相关性，可以通过在类似环境中使用嵌套框和/或测量嵌套框附近混杂变量的水平来控制。此外，在空巢筑巢鸟类中，采用实验方法是强大的，因为巢箱或自然洞穴可以保护雏鸟和成虫免受ALAN¹³的影响，这也许可以解释为什么一些相关研究发现ALAN（或人为噪音）的影响很小¹⁴，而实验研究更经常发现明显的效果（见下文）。此外，可以采用重复测量实验设计，其中个体作为自己的控制，这进一步增加了统计能力和检测有意义的生物效应的概率。以下部分:（1）解释该系统的设计和实现的细节，（2）总结迄今为止使用该系统得出的重要结果，以及（3）提出未来可以在山雀和其他动物中追求的研究方向。

研究方案

该系统在动物实验中的所有应用均已获得安特卫普大学伦理委员会的批准，并根据比利时和佛兰德法律进行。方法符合ASAB / ABS在行为研究中使用动物的指南。比利时皇家自然科学研究所（ Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen;KBIN）为所有研究人员和人员提供许可证。

1. 创建实验系统

1. 获取用于创建 ALAN 的广谱 LED。从 LED 大灯取出 LED 灯。使用单个 LED 灯或多个（例如 4 个）广谱 LED 灯进行更漫射的照明（图 1）。
   注意:作为修改，可以使用具有不同光谱属性（例如，红色与蓝色）的LED，但必须从不同的来源获得（请参阅Grunst等人的补充材料2019¹⁵ ，了解使用此系统的过去研究中使用的LED的光谱特性）。
2. 设计一个系统，将LED与红外摄像头一起安装，以进行行为监控。研究人员可以通过多种方式实现这一目标。
   1. 备选案文1.将单个广谱 LED 分别插入巢箱中，塑料管与红外摄像机相邻，该摄像机用粘合剂安装在适合巢箱内的塑料或金属板上（图 1A、B）。
   2. 备选案文2.将红外摄像机安装在塑料或金属板上的中心位置，然后将LED灯安装在红外摄像机周围板上的固定位置（图1C）。
3. 设计一种将系统连接到电源（电池）和定时器的方法。
   1. 使用刀或钻头在巢箱的侧面形成小树林，电线连接器可以通过这些小树林将系统连接到Fe电池（12 V;120 Wh）和自制计时器（12 V）。
   2. 设计一个深绿色的木制外壳，在颜色，长度和宽度上与巢箱相匹配（例如，过去研究中使用的巢箱的尺寸:120 mm x 155 mm x 250 mm），并且通过铰链的一侧开口来容纳电池，视频录像机和LED的定时器系统（图2; 补充图 1 和 补充图 2）。
4. 设计一种调整 ALAN 强度的方法。
   1. 获取电阻（值取决于电池电压和照明），并将其与LED串联。
5. 设计"虚拟"盒子，其尺寸与容纳计时器和电池的外壳相同，用于使鸟类习惯于系统（即如图 2A所示，但没有内部电子设备）。
   注意:第2节和第3节讨论了用于研究ALAN对局灶性生物体影响的分步方法。

图 1:由红外摄像机和 LED 灯组成的两个系统，用于操作巢箱内的 ALAN。 （A） 巢箱的顶视图，带有将旧系统固定到位的板。（B） 较旧的系统，带有 1 个广谱 LED，用于操作 ALAN 和中央摄像机，具有 10 个红外 LED （c） 较新的系统，带有 4 个广谱 LED，中央红外摄像机具有 4 个红外 LED。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:自制电池和定时器单元，用于操作 ALAN 和视频录制行为。 （A） 该单元封装在安装在巢箱顶部的木箱内。（B） 设备内部电子设备的视图。连接器从巢箱内部延伸到木制外壳，将电子设备连接到红外摄像机和广谱LED。 请点击此处查看此图的大图。

2. 规划实验并调整 ALAN 强度和时间

1. 确定将动物暴露在的所需光强度。
   1. 仔细考虑使用哪种实验光强度，以产生有意义的结果来回答研究问题。一般来说，这将意味着选择与生态相关的光强度，这是自由放养的动物可能遇到的（参见 表1 的指导）。
2. 将LED灯调整到所需的光强度（例如，1-3勒克斯，如过去的研究中使用的; 表 1 和 表 2）。
   1. 在放置在现场之前，将系统放置在带入实验室的巢箱上以校准光强度。将 LED 连接到电源，如下所述（协议部分 3）。
   2. 通过将测光表放置在巢箱内鸟的水平（距底部约8厘米），同时调整与LED串联的电阻器，将LED发出的光调节到所需的强度（勒克斯）。
      注意:可以实现非常低的光强度（例如，乡村天空辉光水平;0.01勒克斯）。
3. 确定将动物暴露给 ALAN 的时间范围。
   1. 确定整夜暴露的时间长度和时间。例如，人们可以在整个晚上将动物暴露在ALAN中，只在部分夜晚，或者在半夜留下一段时间的黑暗以减少扰动的程度。
   2. 如果动物必须进入巢箱（或特定区域）才能暴露在ALAN中，还要考虑在可能发生的进入事件之前还是之后是否应该打开灯。
4. 设置计时器以控制夜间的光照时间。
   1. 设置连接到广谱LED的计时器，以便灯在指定时间段打开和关闭（例如，日落前至少2小时;日出后2小时关闭）。
      注意:红外摄像机允许在光照期间同时记录动物的行为，并且只要连接到充电电池，它就会打开。
5. 确定用于目标研究问题的适当实验设计。
   注意:对于某些问题，重复测量实验设计将是最有力的选择（例如，暴露于ALAN如何影响睡眠行为？对于其他人，将需要配对的对照组和实验组（例如，暴露于ALAN如何影响发育雏鸟的端粒损失？

源/曝光水平	强度（勒克斯）
充足的阳光	103000
满月光	0.05–1
城市天空辉光	0.2–0.5
自由生活的欧洲黑鸟的暴露	0.2 (0.07–2.2)
过去使用该系统的实验研究	1–3
路灯	~10
低压钠路灯	~10
高压钠	~10
荧光灯	300
金属卤化物	400–2000

表1:环境中的特征光强度^3，9，自由放养的鸟类的暴露水平⁴¹，以及过去使用该系统的研究中使用的强度（参见表2）。

3. 实现对 ALAN 的公开

1. 使动物习惯于实验设置。
   1. 如果可能的话，在实验的背景下，通过在实验前至少1天将假盒子放在巢箱的顶部来使动物习惯于设置，以尽量减少新奇厌恶的影响。
2. 调查焦点个体。
   1. 使用被动综合应答器（PIT）标签为研究种群中的动物安装，以便在巢箱内识别而不会干扰鸟类。
   2. 在涉及ALAN对睡眠行为影响的实验中，在实验前一天晚上访问巢箱，并使用射频识别（RFID）读取器扫描箱子，以确定哪些鸟类在里面栖息。
   3. 在育种季节的实验中，涉及将发育中的雏鸟暴露给ALAN，持续监测（例如，每隔一天）巢箱，并检查巢内容物和成年身份。仔细选择包含具有某些特征（即模态育雏大小，亲本在场和进食）的育雏箱用于实验。
3. 选择并实施实验。
   1. 对于涉及睡眠行为的实验，实施重复措施设计，首先记录个体在黑暗条件下睡眠至少一晚，以记录在没有ALAN（对照治疗）的情况下不受干扰的睡眠，然后按照步骤3.3.2-3.3.21进行记录。
   2. 为此，请确保在将红外摄像机带入现场之前，将红外摄像机上的时间与本地时间同步。
   3. 将SD卡插入电池旁边的迷你DVR录像机中的SD插槽（图2B; 补充图 2）。检查以确保SD卡为空，如果没有，请擦除它包含的数据。
   4. 在黑暗开始前至少2小时，从巢箱顶部取下假盒。
   5. 打开巢箱盖。
   6. 将装有红外摄像机的板放在巢箱内，摄像机物镜朝下。
   7. 将电子连接器伸出巢箱中的小树林。
   8. 关闭巢箱盖。
   9. 将装有电池、录像机和计时器的存储模块放在巢箱的顶部。
   10. 连接电池电源接头。将录像机上的红色接头连接到照相机的白色接头（音频），将录像机上的黄色接头连接到照相机的黄色接头（视频），将电池的黑色接头连接到照相机的红色接头（电源）（补充图1 和 补充图2）。
   11. 按下录制按钮以启动相机录制。
       注:不会设置计时器和/或电源不会连接到控制 LED 的计时器，因此在控制夜晚不会产生 ALAN。
   12. 使用小tft屏幕进行检查，以确保录制已开始并且图像正确。用于连接TFT屏幕的端口位于录像机下方（补充图2）。
   13. 天黑后约1小时，返回巢箱，通过在巢箱的底部和侧面移动RFID应答器读取器并记录从PIT标签传达的唯一标识号来检查睡在里面的鸟的身份。
   14. 在控制记录后的早晨，日出后至少2小时，返回巢箱并收集电池系统和红外摄像机。
   15. 同样，在巢箱的顶部放置一个虚拟框。
   16. 在实验室或办公室，为电池充电，并从记录仪中取出并下载SD卡以收集行为数据。
       注意:电池在寒冷条件下的使用寿命为约 30 小时，以便整夜录制，但需要在连续几个晚上的录制之间充满电。
   17. 成功下载数据后，从SD卡中删除数据，然后将其重新插入迷你DVR录像机。
   18. 在随后的晚上，实施光照处理（例如，1-3勒克斯，如过去使用该系统的实验中使用的; 表 1 和 表 2）。
   19. 将计时器系统设置为所需的光照时间范围。
   20. 按照上述相同的步骤（3.3.2-3.3.17）进行控制记录，但也要将定时器连接到电源，将LED连接到定时器（补充图1 和 补充图2）。
   21. 如果需要，在第三天晚上重复控制记录（黑暗条件下的睡眠行为，即没有ALAN）。
   22. 对于涉及雏鸟暴露于ALAN的实验，使用步骤3.3.23-3.3.25中描述的对照和实验育雏。
   23. 将假巢箱（缺少电子设备）放在对照育雏的巢箱顶部，并以等效的方式处理对照和实验雏鸟。
   24. 为实验盒实施实验性 ALAN 曝光。在实验期间，如上所述，将LED系统和红外摄像机安装在巢箱内，并设置定时器以控制所需的光照时间。
   25. 为电池充电。对于涉及多个夜晚的光照和视频录制的实验，每天早上收集系统以在白天为电池充电，然后在晚上更换系统。
4. 收集有关相关响应变量的数据。
   1. 如果巢箱内的行为是感兴趣的变量，则红外摄像机将允许同时记录行为（例如，睡眠行为; 图 3）。
   2. 通过附加监测方法收集任何其他感兴趣的数据，在可变的时间点进行采样（例如，在光照照之前和之后采集的血液样本¹⁵）。

图3:暴露在ALAN的巢箱内大山雀的红外图像。 （A）睡觉和（B）警报大山雀 请点击这里查看此图的放大版本。

结果

使用该系统发表的同行评审研究文章总结在 表2中。其他几份手稿正在编写中。这些研究解决了三个主要的研究问题。首先，该系统已被用于研究光照对成人睡眠行为和活动水平的影响。为此，采用了重复的测量实验设计，其中首先记录同一个体在自然条件下睡觉，然后记录在点燃的巢箱中睡觉。这些研究中使用的所有个体都装有PIT标签，允许研究人员使用手持式应答器阅读器验证同...

讨论

这种基于巢箱的LED灯系统和配对的红外摄像机使研究人员能够评估有关ALAN生物效应的一系列有趣问题。此外，该系统还可以追求更多的研究方向。此外，将该系统的使用扩展到其他物种可能有助于促进对ALAN敏感性的种间差异的理解。下面提出了一些未来研究的非详尽可能性，希望本文将有助于激励这一重要领域的研究。结论简要重申了这种实验方法的优势，并解决了该系统的局限性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight	RANEX; Gilze; Nederlands	6000.217	A similar model could also be used
Battery	BYD	R1210A-C	Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint			Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape			For electronics
Homemade timer system	Amazon	YP109A 12V	A similar model could also be used
Infrared camera	Koberts-Goods, Melsungen, DE	205-IR-L	Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter	ISO-Tech ILM; Corby; UK	1335	To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder	Pakatak, Essex, UK	MD-101	Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags	Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK	EM4102	125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader	Trovan, Aalten, Netherlands	GR-250	To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor	RS Components		Value depending on voltage battery and illumination
SD card	SanDisk		64 GB or larger
SongMeter	Wildlife Acoustics; Maynard, MA		Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor	Walmart		Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood			To construct nest boxes/electronic encolsures