Uma abordagem experimental para investigar efeitos da luz artificial à noite em animais de alcance livre: implementação, resultados e direções para pesquisas futuras

Resumo

A luz artificial à noite (ALAN) tem efeitos biológicos de grande alcance. Este artigo descreve um sistema para manipular ALAN dentro de caixas de ninho enquanto monitora o comportamento, consistindo de luzes LED acoplada a uma bateria, temporizador e câmera de vídeo infravermelha capaz de áudio. Os pesquisadores poderiam empregar esse sistema para explorar muitas questões pendentes sobre os efeitos do ALAN nos organismos.

Resumo

Os animais evoluíram com padrões naturais de luz e escuridão. No entanto, a luz artificial está sendo cada vez mais introduzida no meio ambiente a partir da infraestrutura humana e da atividade recreativa. A luz artificial à noite (ALAN) tem o potencial de ter efeitos generalizados sobre o comportamento animal, a fisiologia e o condicionamento físico, que podem se traduzir em efeitos em escala mais ampla sobre populações e comunidades. Entender os efeitos do ALAN em animais de alcance livre não é trivial devido a desafios como medir níveis de luz encontrados por organismos móveis e separar os efeitos do ALAN daqueles de outros fatores de perturbação antropogênica. Aqui descrevemos uma abordagem que nos permite isolar os efeitos da exposição à luz artificial em animais individuais, manipulando experimentalmente os níveis de luz dentro das caixas de ninho. Para isso, um sistema pode ser usado consistindo de luz emissão de luz (LED) aderida a uma placa e conectada a um sistema de bateria e temporizador. A configuração permite a exposição de indivíduos dentro de caixas de ninho a intensidades e durações variadas de ALAN enquanto simultaneamente obtém gravações de vídeo, que também incluem áudio. O sistema tem sido usado em estudos sobre tetas grandes (Parus maior) e tetas azuis (Cyanistes caeruleus) para obter uma visão de como o ALAN afeta os padrões de sono e atividade em adultos e a dinâmica fisiológica e telômero no desenvolvimento de nestlings. O sistema, ou uma adaptação dele, poderia ser usado para responder a muitas outras perguntas intrigantes de pesquisa, como como alan interage com outros fatores de perturbação e afeta o equilíbrio bioenergésico. Além disso, sistemas semelhantes poderiam ser instalados dentro ou perto das caixas de ninho, ninhos ou tocas de uma variedade de espécies para manipular níveis de ALAN, avaliar respostas biológicas e trabalhar para construir uma perspectiva interespecífica. Especialmente quando combinada com outras abordagens avançadas para monitorar o comportamento e a circulação de animais livres, essa abordagem promete produzir contribuições contínuas para nossa compreensão das implicações biológicas do ALAN.

Introdução

Os animais evoluíram com os padrões naturais de luz e escuridão que definem dia e noite. Assim, ritmos circadianos em sistemas hormonais orquestram padrões de descanso e atividade e permitem que os animais maximizem o condicionamento físico ^1,2,3. Por exemplo, o ritmo circadiano nos hormônios glicocorticoides, com um pico no início da atividade diária, primes vertebrados para se comportar adequadamente durante o período de 24 horas através de efeitos sobre o metabolismo da glicose e responsividade aos estressores ambientais⁴. Da mesma forma, o hormônio pineal melatonina, que é liberado em resposta à escuridão, está integralmente envolvido em padrões de ritmismo circadiano e também tem propriedades antioxidantes ^5,6. A entrada de muitos aspectos da ritmética circadiana, como a liberação de melatonina, é afetada pela fotorrecepção dos níveis de luz no ambiente. Assim, a introdução da luz artificial no ambiente para apoiar a atividade humana, a recreação e a infraestrutura tem o potencial de ter efeitos de grande alcance sobre o comportamento, a fisiologia e a aptidão dos animais de alcance livre ^7,8. De fato, diversos efeitos da exposição à luz artificial à noite (ALAN) foram documentados ^9,10, e ALAN tem sido destacado como prioridade para a pesquisa de mudança global^{no século 21 10}.

Medir os efeitos do ALAN em animais de alcance livre representa desafios não triviais por uma série de razões. Primeiro, animais móveis que se deslocam pelo ambiente experimentam constantemente diferentes níveis de luz. Assim, como quantificar o nível de luz a que os animais individuais estão expostos? Mesmo que os níveis de luz no território do animal possam ser quantificados, o animal pode empregar estratégias de evasão que afetam padrões de exposição, exigindo assim o rastreamento simultâneo da localização animal e dos níveis de luz. De fato, na maioria dos estudos de campo, a média e a variação nos níveis de exposição à luz são desconhecidas¹¹. Em segundo lugar, a exposição ao ALAN é frequentemente correlacionada com a exposição a outros fatores de perturbação antropogênica, como poluição sonora, exposição química e degradação do habitat. Por exemplo, animais que ocupam habitats ao longo das margens das estradas serão expostos à luz de lâmpadas de rua, ruídos do tráfego veicular e poluição do ar por emissões veiculares. Como, então, isola efetivamente os efeitos do ALAN dos efeitos das variáveis de confusão? Experimentos de campo rigorosos que permitem boas medições tanto dos níveis de exposição à luz quanto das variáveis de resposta são essenciais para avaliar a gravidade dos efeitos biológicos do ALAN e desenvolver estratégias eficazes de mitigação¹¹.

Este artigo descreve uma abordagem experimental que, embora não sem suas limitações (ver seção de discussão), ajuda a assecar, se não eliminar as dificuldades identificadas acima. A abordagem implica manipular experimentalmente os níveis de ALAN dentro das caixas de ninho de uma espécie de pássaro diurna de vida livre, a grande teta (Parus maior), usando um sistema de luzes de diodo emissor de luz (LED) e uma câmera infravermelha (IR) instalada dentro de caixas de ninho. A configuração permite a aquisição simultânea de gravações de vídeo, incluindo áudio, o que permite aos pesquisadores avaliar efeitos sobre comportamentos e vocalizações. Grandes tetas utilizam caixas de ninho para reprodução, e dormem nas caixas de ninho entre novembro e março. As fêmeas também dormem dentro das caixas de ninho durante a^{temporada de reprodução 12}. O sistema também tem sido usado em menor medida para estudar efeitos de ALAN em tetas azuis (Cyanistes caeruleus). A primeira dificuldade, envolvendo conhecer os níveis de luz encontrados pelo animal, é atenuada nisso, uma vez que um indivíduo está disposto a entrar na caixa do ninho (ou já está na caixa do ninho no caso de nestlings imóveis), os níveis de luz podem ser precisamente determinados pelo pesquisador. A segunda dificuldade, envolvendo correlações com variáveis de confusão, pode ser controlada usando caixas de ninho em ambientes semelhantes e/ou medindo os níveis de variáveis de confusão perto de caixas de ninho. Além disso, em aves de ninho de cavidade, adotar uma abordagem experimental é poderoso porque caixas de ninho ou cavidades naturais podem proteger filhotes e adultos de ALAN¹³, o que pode explicar por que alguns estudos correlativos encontram pouco efeito de ALAN (ou ruído antropogênico)¹⁴, enquanto estudos experimentais mais frequentemente encontram efeitos claros (veja abaixo). Além disso, um projeto experimental de medidas repetidas pode ser adotado no qual os indivíduos servem como seu próprio controle, o que aumenta ainda mais o poder estatístico, e a probabilidade de detectar efeitos biológicos significativos. As seções abaixo: (1) explicam os detalhes da concepção e implementação do sistema, (2) resumem os importantes resultados até agora derivados utilizando o sistema, e (3) propõem futuras direções de pesquisa que poderiam ser perseguidas, tanto em tetas quanto em outros animais.

Protocolo

Todas as aplicações deste sistema a experimentos em animais foram aprovadas pelo comitê de ética da Universidade de Antuérpia e conduzidas de acordo com as leis belgas e flamengas. Metodologia aderiu às diretrizes da ASAB/ABS para o uso de animais em pesquisas comportamentais. O Instituto Real Belga de Ciências Naturais (Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen; KBIN) forneceu licenças para todos os pesquisadores e pessoal.

1. Criação do sistema experimental

1. Obtenha LEDS de amplo espectro para usar na criação de ALAN. Pegue a luz led de um farol led. Use uma única luz LED ou várias luzes LED de amplo espectro (por exemplo, 4) para uma iluminação mais difusa (Figura 1).
   NOTA: Como modificação, leds com diferentes propriedades espectrais (por exemplo, vermelho versus azul) poderiam ser utilizados, mas teriam que ser obtidos de uma fonte diferente (ver o material suplementar de Grunst et al. 2019¹⁵ para as propriedades espectrais dos LEDs utilizados em estudos anteriores utilizando este sistema).
2. Projete um sistema para montar os LEDs junto com uma câmera IR para permitir o monitoramento comportamental. Os pesquisadores podem realizar esse fim de várias maneiras.
   1. Opção 1. Insira um único LED de amplo espectro na caixa do ninho separadamente em um tubo de plástico adjacente a uma câmera IR montada com adesivo em uma placa de plástico ou metal que se encaixa dentro da caixa do ninho (Figura 1A, B).
   2. Opção 2. Monte uma câmera IR em uma posição central em uma placa de plástico ou metal e, em seguida, monte luzes LED em posições fixas na placa ao redor da câmera IR (Fig. 1C).
3. Projete um meio de conectar o sistema a uma fonte de alimentação (bateria) e temporizador.
   1. Use uma faca ou broca para fazer bosques na lateral da caixa do ninho através dos quais os conectores de arame podem se estender para conectar o sistema a uma bateria Fe (12 V; 120 Wh) e temporizador caseiro (12 V).
   2. Projetar um gabinete de madeira verde escuro que corresponda à caixa do ninho em coloração, comprimento e largura (por exemplo, as caixas de ninho usadas em estudos anteriores tinham as dimensões: 120 mm x 155 mm x 250 mm), e com uma abertura lateral através de uma dobradiça para abrigar a bateria, gravador para o vídeo e sistema temporizador para os LEDs (Figura 2; Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
4. Projete um meio através do qual ajustar a intensidade do ALAN.
   1. Obtenha um resistor (valor contingente na tensão e iluminação da bateria) e conecte-o em série com os LED(s).
5. Projete caixas "manequim" com as mesmas dimensões dos gabinetes que abrigam o temporizador e a bateria para uso em aves habituais ao sistema (ou seja, como na Figura 2A, mas sem a eletrônica interna).
   NOTA: A seção 2 e a seção 3 discutem os métodos passo a passo utilizados para estudar os efeitos do ALAN no organismo focal.

Figura 1: Dois sistemas compostos por câmeras de RI e luzes LED usadas para manipular ALAN dentro de caixas de ninho. (A) Vista superior da caixa do ninho com placa que mantém o sistema mais antigo no lugar. (B) Sistema mais antigo com LED de 1 espectro amplo para manipular ALAN e câmera central com 10 LEDs IR (c) Sistema mais novo com 4 LEDs de amplo espectro e câmera IR central com 4 LEDs IR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A bateria caseira e a unidade temporizador usada para manipular ALAN e comportamento de gravação de vídeo. (A) A unidade está fechada dentro de uma caixa de madeira que é montada no topo da caixa do ninho. (B) Ver a eletrônica dentro da unidade. Os conectores estendem-se de dentro da caixa de ninho até o gabinete de madeira para conectar a eletrônica à câmera IR e leds de amplo espectro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Planejar o experimento e ajustar a intensidade e o tempo do ALAN

1. Determine a intensidade de luz desejada para expor os animais.
   1. Considere cuidadosamente qual intensidade experimental de luz usar para produzir resultados significativos que respondam à pergunta da pesquisa. Em geral, isso significará selecionar uma intensidade de luz ecologicamente relevante, que os animais de alcance livre provavelmente encontrarão (ver Tabela 1 para orientação).
2. Ajuste as luzes LED à intensidade de luz desejada (por exemplo, 1-3 lux, como usado em estudos anteriores; Tabela 1 e Tabela 2).
   1. Antes da colocação no campo, coloque o sistema em uma caixa de ninho levada ao laboratório para calibrar a intensidade da luz. Conecte os LEDs à fonte de energia, conforme descrito mais adiante (Seção 3 do protocolo).
   2. Ajuste a luz emitida pelos LEDs à intensidade desejada (lux) colocando um medidor de luz no nível da ave dentro da caixa do ninho (~8 cm da parte inferior) e ajustando simultaneamente o resistor em série com os LEDs.
      NOTA: É possível alcançar intensidades de luz muito baixas (por exemplo, níveis de brilho do céu rural; 0,01 lux).
3. Determine o prazo sobre o qual expor animais ao ALAN.
   1. Determine o comprimento e o tempo de exposição durante toda a noite. Por exemplo, pode-se expor animais a ALAN durante toda a noite, por apenas uma parte da noite, ou deixar um período de escuridão no meio da noite para reduzir o grau de perturbação.
   2. Nos casos em que um animal deve entrar na caixa do ninho (ou em uma área específica) para ser exposto ao ALAN, considere também se a luz deve ser acesa antes ou depois do evento de entrada provável que ocorra.
4. Ajuste o temporizador para controlar o período de exposição à luz durante a noite.
   1. Defina o temporizador conectado aos LEDs de amplo espectro para que a luz se acenda e se acenda em períodos especificados (por exemplo, em pelo menos 2h antes do pôr do sol; fora 2h após o nascer do sol).
      NOTA: A câmera IR permite que o comportamento do animal seja gravado simultaneamente durante a exposição à luz e estará ligado desde que esteja conectado a uma bateria carregada.
5. Determine o design experimental apropriado para usar para a questão de pesquisa-alvo( s).
   NOTA: Para algumas perguntas, um projeto experimental de medidas repetidas será a opção mais poderosa (por exemplo, como a exposição ao ALAN afeta o comportamento do sono?). Para outros, será necessário controle emparelhado e grupos experimentais (por exemplo, Como a exposição ao ALAN afeta a perda de telômeros no desenvolvimento de nestlings?).

Nível de origem/exposição	Intensidade (lux)
Luz solar completa	103000
Luar cheia	0.05–1
Brilho do Céu Urbano	0.2–0.5
Exposição de pássaros negros europeus de vida livre	0.2 (0.07–2.2)
Estudos experimentais passados usando o sistema	1–3
Luzes de rua de LED	~10
Luzes de rua de sódio de baixa pressão	~10
Sódio de alta pressão	~10
Iluminação florescente	300
Halide metálico	400–2000

Tabela 1: Intensidades de luz características no ambiente ^3,9, níveis de exposição de aves de alcance livre⁴¹, e intensidades utilizadas em estudos anteriores utilizando esse sistema (referências na Tabela 2).

3. Implementando a exposição ao ALAN

1. Habituar os animais à configuração experimental.
   1. Se possível no contexto do experimento, habituar animais à configuração colocando caixas falsas no topo das caixas de ninho pelo menos 1 dia antes do experimento para minimizar os efeitos da aversão à novidade.
2. Pesquise os indivíduos focais.
   1. Coloque animais na população do estudo com etiquetas de transponder integrativo passivo (PIT) para permitir a identificação dentro de caixas de ninhos sem perturbar as aves.
   2. Em experimentos envolvendo o efeito de ALAN no comportamento do sono, visite as caixas de ninho na noite anterior ao experimento e escaneie as caixas com um leitor de identificação de radiofrequência (RFID) para determinar quais pássaros estão se ausentando dentro.
   3. Em experimentos durante a estação de reprodução envolvendo exposição de filhotes em desenvolvimento a ALAN, monitore consistentemente (por exemplo, a cada dois dias) caixas de ninhos e verifique se há conteúdos de ninhos e identidade adulta. Selecione cuidadosamente caixas de ninho contendo ninhadas com certas características (ou seja, tamanho de ninhada modal, tanto os pais presentes quanto a alimentação) para uso no experimento.
3. Selecione e implemente o experimento.
   1. Para experimentos envolvendo o comportamento do sono, implemente um projeto de medidas repetidas pelos primeiros indivíduos que dormem sob condições de escuridão por pelo menos uma noite para registrar sono não perturbado na ausência de ALAN (tratamento de controle) seguindo as etapas 3.3.2-3.3.21.
   2. Para isso, certifique-se de sincronizar o tempo nas câmeras de RI com o horário local antes de levá-las para o campo.
   3. Insira um cartão SD no slot SD no gravador mini DVR adjacente à bateria (Figura 2B; Figura Suplementar 2). Verifique se o cartão SD está vazio e, se não, apaguei os dados que ele contém.
   4. Pelo menos 2 h antes do início da escuridão, remova a caixa falsa do topo da caixa do ninho.
   5. Abra a tampa da caixa do ninho.
   6. Coloque a placa contendo a câmera IR dentro da caixa do ninho com o objetivo da câmera voltado para baixo.
   7. Estenda os conectores eletrônicos para fora do bosque na caixa do ninho.
   8. Feche a tampa da caixa do ninho.
   9. Coloque o gabinete contendo a bateria, o gravador e o temporizador em cima da caixa do ninho.
   10. Conecte os conectores de alimentação da bateria. Conecte o conector vermelho do gravador ao conector branco da câmera (áudio), o conector amarelo do gravador ao conector amarelo da câmera (vídeo) e o conector preto da bateria ao conector vermelho da câmera (alimentação) (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
   11. Pressione o botão de gravação para iniciar a gravação da câmera.
       NOTA: O temporizador não será definido e/ou a potência não será conectada ao temporizador que controla os LEDs para que nenhum ALAN seja produzido em noites de controle.
   12. Verifique com uma pequena tela tft para garantir que a gravação tenha sido iniciada e que a imagem esteja correta. Uma porta para conectar a tela tft está localizada abaixo do gravador (Figura Suplementar 2).
   13. Aproximadamente 1h depois de escurecer, retorne à caixa do ninho e verifique a identidade do pássaro dormindo dentro movendo um leitor de transponder RFID ao redor da parte inferior e laterais da caixa do ninho e registrando o número de identificação único comunicado da tag PIT.
   14. Na manhã seguinte à gravação de controle, pelo menos 2h após o nascer do sol, retorne à caixa do ninho e colete o sistema de bateria e a câmera IR.
   15. Mais uma vez, coloque uma caixa falsa em cima da caixa do ninho.
   16. No laboratório ou escritório, carregue a bateria e remova e baixe o cartão SD do gravador para coletar os dados comportamentais.
       NOTA: As baterias têm um tempo de vida de ~30 h em condições frias para permitir a gravação durante toda a noite, mas precisam ser totalmente recarregadas entre noites consecutivas de gravação.
   17. Depois de baixar com sucesso os dados, apaguei os dados do cartão SD e, em seguida, reinseri-los no gravador mini DVR.
   18. Na noite seguinte, implemente o tratamento de exposição à luz (por exemplo, 1-3 lux, como usado em experimentos passados usando o sistema; Tabela 1 e Tabela 2).
   19. Ajuste o sistema de temporizador para o período de tempo desejado de exposição à luz.
   20. Siga os mesmos passos (3.3.2-3.3.17) descritos acima para a gravação de controle, mas também conecte o temporizador à potência e aos LEDs ao temporizador (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
   21. Se desejar, repita a gravação de controle (do comportamento do sono em condições de escuridão, ou seja, ausência de ALAN) na terceira noite.
   22. Para experimentos envolvendo exposição de nestlings a ALAN, use controle e ninhadas experimentais conforme descrito nas etapas 3.3.23-3.3.25.
   23. Coloque caixas manequim (sem eletrônicos) em cima das caixas de ninho de ninhadas de controle e manuseie tanto o controle quanto os aninhas experimentais de maneiras equivalentes.
   24. Implementar a exposição experimental alan para caixas experimentais. Durante o período experimental, monte o sistema LED e a câmera IR dentro da caixa do ninho, conforme descrito acima, e defina o temporizador para controlar o período desejado de exposição à luz.
   25. Recarregue as baterias. Para experimentos envolvendo várias noites de exposição à luz e gravação de vídeo, colete os sistemas todas as manhãs para recarregar as baterias durante o dia e, em seguida, substituir o sistema à noite.
4. Coletar dados sobre as variáveis de resposta de interesse.
   1. Se o comportamento dentro da caixa do ninho for a variável de interesse, a câmera IR permitirá documentar simultaneamente o comportamento (por exemplo, o comportamento do sono; Figura 3).
   2. Colete quaisquer outros dados de interesse através de métodos adicionais de monitoramento, com amostragem ocorrendo em pontos variáveis no tempo (por exemplo, amostras de sangue colhidas antes e depois da exposição à luz¹⁵).

Figura 3: Imagem infravermelha de uma grande teta dentro de uma caixa de ninho exposta a ALAN. (A) Sleeping e (B) Alerta grande tit Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Os artigos de pesquisa revisados por pares publicados usando este sistema estão resumidos na Tabela 2. Vários outros manuscritos estão em andamento. Esses estudos abordam três grandes conjuntos de questões de pesquisa. Primeiro, o sistema tem sido usado para estudar os efeitos da exposição à luz sobre o comportamento do sono e os níveis de atividade em adultos. Para isso, foi empregado um projeto experimental de medidas repetidas, no qual o mesmo indivíduo foi registrado pela primeira vez dormi...

Discussão

Este sistema baseado em caixa de ninho de luzes LED e uma câmera ir emparelhada permitiu que os pesquisadores avaliassem uma série de perguntas intrigantes sobre os efeitos biológicos do ALAN. Além disso, há muito mais direções de pesquisa que podem ser perseguidas com o sistema. Além disso, a expansão do uso do sistema para outras espécies poderia ajudar a promover uma compreensão das diferenças interespecíficas na sensibilidade ao ALAN. Abaixo algumas possibilidades não exaustivas para futuras pesquisas s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight	RANEX; Gilze; Nederlands	6000.217	A similar model could also be used
Battery	BYD	R1210A-C	Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint			Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape			For electronics
Homemade timer system	Amazon	YP109A 12V	A similar model could also be used
Infrared camera	Koberts-Goods, Melsungen, DE	205-IR-L	Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter	ISO-Tech ILM; Corby; UK	1335	To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder	Pakatak, Essex, UK	MD-101	Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags	Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK	EM4102	125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader	Trovan, Aalten, Netherlands	GR-250	To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor	RS Components		Value depending on voltage battery and illumination
SD card	SanDisk		64 GB or larger
SongMeter	Wildlife Acoustics; Maynard, MA		Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor	Walmart		Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood			To construct nest boxes/electronic encolsures