Un enfoque experimental para investigar los efectos de la luz artificial en la noche en animales en libertad: implementación, resultados y direcciones para futuras investigaciones

Resumen

La luz artificial en la noche (ALAN) tiene efectos biológicos de gran alcance. Este artículo describe un sistema para manipular ALAN dentro de cajas nido mientras se monitorea el comportamiento, que consiste en luces LED acopladas a una batería, temporizador y cámara de video infrarroja con capacidad de audio. Los investigadores podrían emplear este sistema para explorar muchas preguntas pendientes con respecto a los efectos de ALAN en los organismos.

Resumen

Los animales han evolucionado con patrones naturales de luz y oscuridad. Sin embargo, la luz artificial se está introduciendo cada vez más en el medio ambiente a partir de la infraestructura humana y la actividad recreativa. La luz artificial en la noche (ALAN) tiene el potencial de tener efectos generalizados en el comportamiento, la fisiología y la aptitud física de los animales, lo que puede traducirse en efectos a mayor escala en las poblaciones y comunidades. Comprender los efectos de ALAN en animales en libertad no es trivial debido a desafíos como medir los niveles de luz encontrados por organismos móviles y separar los efectos de ALAN de los de otros factores de perturbación antropogénica. Aquí describimos un enfoque que nos permite aislar los efectos de la exposición a la luz artificial en animales individuales mediante la manipulación experimental de los niveles de luz dentro de las cajas nido. Con este fin, se puede utilizar un sistema que consiste en luz (LED) de diodo emisor de luz (s) adherido a una placa y conectado a un sistema de batería y temporizador. La configuración permite la exposición de individuos dentro de cajas nido a diferentes intensidades y duraciones de ALAN mientras se obtienen simultáneamente grabaciones de video, que también incluyen audio. El sistema se ha utilizado en estudios sobre tetas grandes (Parus major) y tetas azules (Cyanistes caeruleus) para obtener información sobre cómo ALAN afecta los patrones de sueño y actividad en adultos y la fisiología y la dinámica de los telómeros en el desarrollo de polluelos. El sistema, o una adaptación del mismo, podría usarse para responder a muchas otras preguntas de investigación intrigantes, como la forma en que ALAN interactúa con otros factores de perturbación y afecta el equilibrio bioenergético. Además, se podrían instalar sistemas similares en o cerca de las cajas nido, nidos o madrigueras de una variedad de especies para manipular los niveles de ALAN, evaluar las respuestas biológicas y trabajar hacia la construcción de una perspectiva interespecífica. Especialmente cuando se combina con otros enfoques avanzados para monitorear el comportamiento y el movimiento de los animales de vida libre, este enfoque promete producir contribuciones continuas a nuestra comprensión de las implicaciones biológicas de ALAN.

Introducción

Los animales han evolucionado con los patrones naturales de luz y oscuridad que definen el día y la noche. Por lo tanto, los ritmos circadianos en los sistemas hormonales orquestan los patrones de descanso y actividad y permiten a los animales maximizar la aptitud^{física 1,2,3}. Por ejemplo, el ritmo circadiano en las hormonas glucocorticoides, con un pico al inicio de la actividad diaria, prepara a los vertebrados para que se comporten adecuadamente durante el período de 24 horas a través de efectos sobre el metabolismo de la glucosa y la capacidad de respuesta a los factores estresantes ambientales⁴. Del mismo modo, la hormona pineal melatonina, que se libera en respuesta a la oscuridad, está integralmente involucrada en el gobierno de los patrones de rítmica circadiana y también tiene propiedades antioxidantes ^5,6. El arrastre de muchos aspectos de la rítmica circadiana, como la liberación de melatonina, se ve afectado por la fotorrecepción de los niveles de luz en el medio ambiente. Por lo tanto, la introducción de luz artificial en el medio ambiente para apoyar la actividad humana, la recreación y la infraestructura tiene el potencial de tener efectos de amplio alcance en el comportamiento, la fisiología y la aptitud de los animales en libertad ^7,8. De hecho, se han documentado diversos efectos de la exposición a la luz artificial en la noche (ALAN) ^9,10, y ALAN se ha destacado como una prioridad para la investigación del cambio global en^{el siglo} 21¹⁰.

La medición de los efectos de ALAN en animales en libertad plantea desafíos no triviales por varias razones. Primero, los animales móviles que se mueven a través del entorno experimentan constantemente diferentes niveles de luz. Por lo tanto, ¿cómo se cuantifica el nivel de luz al que están expuestos los animales individuales? Incluso si se pueden cuantificar los niveles de luz en el territorio del animal, el animal puede emplear estrategias de evitación que afectan los patrones de exposición, lo que exige un seguimiento simultáneo de la ubicación del animal y los niveles de luz. De hecho, en la mayoría de los estudios de campo, la media y la variación en los niveles de exposición a la luz son desconocidas¹¹. En segundo lugar, la exposición a ALAN a menudo se correlaciona con la exposición a otros factores de perturbación antropogénica, como la contaminación acústica, la exposición química y la degradación del hábitat. Por ejemplo, los animales que ocupan hábitats a lo largo de los márgenes de las carreteras estarán expuestos a la luz de las farolas, al ruido del tráfico vehicular y a la contaminación del aire por las emisiones vehiculares. Entonces, ¿cómo se aíslan efectivamente los efectos de ALAN de los efectos de las variables de confusión? Los experimentos de campo rigurosos que permiten buenas mediciones tanto de los niveles de exposición a la luz como de las variables de respuesta son esenciales para evaluar la gravedad de los efectos biológicos de ALAN y para desarrollar estrategias de mitigación efectivas¹¹.

Este artículo describe un enfoque experimental que, aunque no está exento de limitaciones (ver sección de discusión), ayuda a mitigar, si no eliminar, las dificultades identificadas anteriormente. El enfoque implica manipular experimentalmente los niveles de ALAN dentro de las cajas nido de una especie de ave diurna de vida libre, la teta grande (Parus major), utilizando un sistema de luces de diodo emisor de luz (LED) y una cámara infrarroja (IR) instalada dentro de las cajas nido. La configuración permite la adquisición simultánea de grabaciones de video, incluido audio, lo que permite a los investigadores evaluar los efectos en los comportamientos y vocalizaciones. Las grandes tetas utilizan cajas nido para la reproducción, y duermen en las cajas nido entre noviembre y marzo. Las hembras también duermen dentro de las cajas nido durante la temporada de reproducción¹². El sistema también se ha utilizado en menor medida para estudiar los efectos de ALAN en las tetas azules (Cyanistes caeruleus). La primera dificultad, que implica conocer los niveles de luz encontrados por el animal, se mitiga en que, dado que un individuo está dispuesto a entrar en la caja nido (o ya está en la caja nido en el caso de los polluelos inmóviles), los niveles de luz pueden ser determinados con precisión por el investigador. La segunda dificultad, que implica correlaciones con variables de confusión, se puede controlar mediante el uso de cajas nido en entornos similares y/o midiendo los niveles de variables de confusión cerca de las cajas nido. Además, en las aves que anidan en cavidades, la adopción de un enfoque experimental es poderosa porque las cajas nido o cavidades naturales pueden proteger a los polluelos y adultos de ALAN¹³, lo que puede explicar por qué algunos estudios correlativos encuentran poco efecto de ALAN (o ruido antropogénico)¹⁴, mientras que los estudios experimentales a menudo encuentran efectos claros (ver más abajo). Además, se puede adoptar un diseño experimental de medidas repetidas en el que los individuos sirvan como su propio control, lo que aumenta aún más el poder estadístico y la probabilidad de detectar efectos biológicos significativos. Las siguientes secciones: (1) explican los detalles del diseño e implementación del sistema, (2) resumen los resultados importantes que se han derivado hasta ahora utilizando el sistema, y (3) proponen futuras direcciones de investigación que podrían seguirse, tanto en tetas como en otros animales.

Protocolo

Todas las aplicaciones de este sistema a los experimentos con animales fueron aprobadas por el comité ético de la Universidad de Amberes y llevadas a cabo de acuerdo con las leyes belgas y flamencas. Metodología adherida a las directrices ASAB/ABS para el uso de animales en la investigación conductual. El Real Instituto Belga de Ciencias Naturales (Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen; KBIN) proporcionó licencias para todos los investigadores y personal.

1. Creación del sistema experimental

1. Obtenga LED(s) de amplio espectro para utilizar en la creación de ALAN. Tome la(s) luz(es) LED de un faro LED. Utilice una sola luz LED o varias (por ejemplo, 4) luces LED de amplio espectro para una iluminación más difusa (Figura 1).
   NOTA: Como modificación, se podrían usar LED con diferentes propiedades espectrales (por ejemplo, rojo versus azul) pero tendrían que obtenerse de una fuente diferente (ver el material complementario de Grunst et al. 2019¹⁵ para las propiedades espectrales de los LED utilizados en estudios anteriores utilizando este sistema).
2. Diseñe un sistema para montar los LED junto con una cámara IR para permitir el monitoreo del comportamiento. Los investigadores pueden lograr este fin de varias maneras.
   1. Opción 1. Inserte un solo LED de amplio espectro en la caja nido por separado en un tubo de plástico adyacente a una cámara IR montada con adhesivo en una placa de plástico o metal que quepa dentro de la caja nido (Figura 1A, B).
   2. Opción 2. Monte una cámara IR en una posición central en una placa de plástico o metal y luego monte luces LED en posiciones fijas en la placa que rodea la cámara IR (Fig. 1C).
3. Diseñe un medio para conectar el sistema a una fuente de alimentación (batería) y un temporizador.
   1. Use un cuchillo o taladro para hacer arboledas en el costado de la caja nido a través de las cuales se pueden extender los conectores de cable para conectar el sistema a una batería de Fe (12 V; 120 Wh) y un temporizador casero (12 V).
   2. Diseñe un gabinete de madera verde oscuro que coincida con la caja nido en coloración, longitud y ancho (por ejemplo, las cajas nido utilizadas en estudios anteriores tenían las dimensiones: 120 mm x 155 mm x 250 mm), y con una abertura lateral a través de una bisagra para albergar la batería, grabadora para el video y sistema de temporizador para los LED (Figura 2; Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2).
4. Diseñar un medio a través del cual ajustar la intensidad de ALAN.
   1. Obtenga una resistencia (valor supeditado al voltaje y la iluminación de la batería) y conéctela en serie con el LED (s).
5. Diseñe cajas "ficticias" con las mismas dimensiones que las carcasas que albergan el temporizador y la batería para su uso en la habituación de aves al sistema (es decir, como en la Figura 2A, pero sin la electrónica interna).
   NOTA: La Sección 2 y la sección 3 discuten los métodos paso a paso utilizados para estudiar los efectos de ALAN en el organismo focal.

Figura 1: Dos sistemas que consisten en cámaras IR y luces LED utilizadas para manipular ALAN dentro de cajas nido. (A) Vista superior de la caja nido con placa que sostiene el sistema más antiguo en su lugar. (B) Sistema más antiguo con 1 LED de amplio espectro para manipular ALAN y cámara central con 10 LED IR (c) Sistema más nuevo con 4 LED de amplio espectro y cámara IR central con 4 LED IR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La batería casera y la unidad de temporizador utilizada para manipular alan y el comportamiento de grabación de video. (A) La unidad está encerrada dentro de una caja de madera que está montada en la parte superior de la caja nido. (B) Vista de la electrónica dentro de la unidad. Los conectores se extienden desde el interior de la caja nido hasta la carcasa de madera para conectar la electrónica a la cámara IR y a los LED de amplio espectro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Planificación del experimento y ajuste de la intensidad y el tiempo de ALAN

1. Determine la intensidad de luz deseada a la que exponer a los animales.
   1. Considere cuidadosamente qué intensidad de luz experimental usar para producir resultados significativos que respondan a la pregunta de investigación. En general, esto significará seleccionar una intensidad de luz ecológicamente relevante, que es probable que encuentren los animales en libertad (consulte la Tabla 1 para obtener orientación).
2. Ajuste las luces LED a la intensidad de luz deseada (por ejemplo, 1-3 lux, como se usó en estudios anteriores; Tabla 1 y Tabla 2).
   1. Antes de colocarlo en el campo, coloque el sistema en una caja nido llevada al laboratorio para calibrar la intensidad de la luz. Conecte los LED a la fuente de alimentación, como se describe más adelante (sección 3 del protocolo).
   2. Ajuste la luz emitida por los LED a la intensidad deseada (lux) colocando un medidor de luz al nivel del ave dentro de la caja nido (~ 8 cm desde la parte inferior) y ajustando simultáneamente la resistencia en serie con los LED.
      NOTA: Es posible alcanzar intensidades de luz muy bajas (por ejemplo, niveles de brillo del cielo rural; 0.01 lux).
3. Determine el período de tiempo durante el cual exponer a los animales a ALAN.
   1. Determine la duración y el momento de la exposición a lo largo de la noche. Por ejemplo, uno puede exponer a los animales a ALAN durante toda la noche, solo durante una parte de la noche, o dejar un período de oscuridad en medio de la noche para reducir el grado de perturbación.
   2. En los casos en que un animal deba ingresar a la caja nido (o un área específica) para exponerse al ALAN, también considere si la luz debe encenderse antes o después de que ocurra el evento de entrada.
4. Configure el temporizador para controlar el período de exposición a la luz durante la noche.
   1. Configure el temporizador conectado a los LED de amplio espectro para que la luz se encienda y apague en períodos específicos (por ejemplo, encendido al menos 2 h antes de la puesta del sol; apagado 2 h después del amanecer).
      NOTA: La cámara IR permite que el comportamiento del animal se registre simultáneamente durante la duración de la exposición a la luz y estará encendida siempre que esté conectada a una batería cargada.
5. Determinar el diseño experimental apropiado para usar para la(s) pregunta(s) de investigación objetivo(s).
   NOTA: Para algunas preguntas, un diseño experimental de medidas repetidas será la opción más poderosa (por ejemplo, ¿Cómo afecta la exposición a ALAN al comportamiento del sueño?). Para otros, se necesitarán grupos de control y experimentales emparejados (por ejemplo, ¿Cómo afecta la exposición a ALAN la pérdida de telómeros en el desarrollo de polluelos?).

Fuente/nivel de exposición	Intensidad (lux)
Plena luz solar	103000
Luz de luna llena	0.05–1
Resplandor del cielo urbano	0.2–0.5
Exposición de mirlos europeos de vida libre	0.2 (0.07–2.2)
Estudios experimentales anteriores utilizando el sistema	1–3
Farolas LED	~10
Farolas de sodio de baja presión	~10
Sodio a alta presión	~10
Iluminación fluorescente	300
Halogenuros metálicos	400–2000

Tabla 1: Intensidades de luz características en el ambiente ^3,9, niveles de exposición de aves en libertad⁴¹ e intensidades utilizadas en estudios anteriores utilizando este sistema (referencias en la Tabla 2).

3. Implementación de la exposición a ALAN

1. Habitúa a los animales a la configuración experimental.
   1. Si es posible dentro del contexto del experimento, habitúe a los animales a la configuración colocando cajas ficticias en la parte superior de las cajas nido al menos 1 día antes del experimento para minimizar los efectos de la aversión a la novedad.
2. Encuestar a los individuos focales.
   1. Ajuste los animales en la población de estudio con etiquetas de transpondedor integrador pasivo (PIT) para permitir la identificación dentro de las cajas nido sin molestar a las aves.
   2. En experimentos que involucren el efecto de ALAN en el comportamiento del sueño, visite las cajas nido la noche anterior al experimento y escanee las cajas con un lector de identificación por radiofrecuencia (RFID) para determinar qué aves están descansando dentro.
   3. En experimentos durante la temporada de reproducción que impliquen la exposición de polluelos en desarrollo a ALAN, monitoree constantemente (por ejemplo, cada dos días) las cajas nido y verifique el contenido del nido y la identidad adulta. Seleccione cuidadosamente las cajas nido que contengan crías con ciertas características (es decir, el tamaño modal de la cría, ambos padres presentes y la alimentación) para su uso en el experimento.
3. Seleccione e implemente el experimento.
   1. Para experimentos que involucren el comportamiento del sueño, implemente un diseño de medidas repetidas registrando primero a las personas que duermen en condiciones de oscuridad durante al menos una noche para registrar el sueño no perturbado en ausencia de ALAN (tratamiento de control) siguiendo los pasos 3.3.2-3.3.21.
   2. Con este fin, asegúrese de sincronizar la hora en las cámaras IR con la hora local antes de llevarlas al campo.
   3. Inserte una tarjeta SD en la ranura SD de la grabadora mini DVR adyacente a la batería (Figura 2B; Figura suplementaria 2). Asegúrese de que la tarjeta SD esté vacía y, de lo contrario, borre los datos que contiene.
   4. Al menos 2 h antes del inicio de la oscuridad, retire la caja ficticia de la parte superior de la caja nido.
   5. Abra la tapa de la caja nido.
   6. Coloque la placa que contiene la cámara IR dentro de la caja nido con el objetivo de la cámara orientado hacia abajo.
   7. Extienda los conectores electrónicos fuera de la arboleda en la caja nido.
   8. Cierre la tapa de la caja nido.
   9. Coloque la carcasa que contiene la batería, la grabadora y el temporizador en la parte superior de la caja nido.
   10. Conecte los conectores de alimentación de la batería. Conecte el conector rojo de la grabadora al conector blanco de la cámara (audio), el conector amarillo de la grabadora al conector amarillo de la cámara (vídeo) y el conector negro de la batería al conector rojo de la cámara (alimentación) (Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2).
   11. Presione el botón de grabación para iniciar la grabación de la cámara.
       NOTA: El temporizador no se configurará y / o la alimentación no se conectará al temporizador que controla los LED para que no se produzca ALAN en las noches de control.
   12. Verifique con una pequeña pantalla tft para asegurarse de que la grabación ha comenzado y que la imagen es correcta. Un puerto para conectar la pantalla tft se encuentra debajo de la grabadora (Figura suplementaria 2).
   13. Aproximadamente 1 h después del anochecer, regrese a la caja nido y verifique la identidad del ave que duerme en el interior moviendo un lector de transpondedor RFID alrededor de la parte inferior y los lados de la caja nido y registrando el número de identificación único comunicado desde la etiqueta PIT.
   14. En la mañana siguiente a la grabación de control, al menos 2 h después del amanecer, regrese a la caja nido y recoja el sistema de batería y la cámara IR.
   15. Una vez más, coloque una caja ficticia en la parte superior de la caja nido.
   16. En el laboratorio u oficina, cargue la batería y retire y descargue la tarjeta SD de la grabadora para recopilar los datos de comportamiento.
       NOTA: Las baterías tienen una vida útil de ~ 30 h en condiciones frías para permitir la grabación durante toda la noche, pero deben recargarse completamente entre noches consecutivas de grabación.
   17. Después de descargar con éxito los datos, borre los datos de la tarjeta SD y luego vuelva a insertarlos en la grabadora mini DVR.
   18. En la noche siguiente, implemente el tratamiento de exposición a la luz (por ejemplo, 1-3 lux, como se usó en experimentos anteriores con el sistema; Tabla 1 y Tabla 2).
   19. Configure el sistema de temporizador para el período de tiempo deseado de exposición a la luz.
   20. Siga los mismos pasos (3.3.2-3.3.17) descritos anteriormente para la grabación de control, pero también conecte el temporizador a la alimentación y los LED al temporizador (Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2).
   21. Si lo desea, repita la grabación de control (del comportamiento del sueño en condiciones de oscuridad, es decir, ausencia de ALAN) en la tercera noche.
   22. Para los experimentos que impliquen la exposición de polluelos a ALAN, utilice crías de control y experimentales como se describe en los pasos 3.3.23-3.3.25.
   23. Coloque cajas ficticias (que carecen de electrónica) encima de las cajas nido de crías de control y maneje tanto los polluelos de control como los experimentales de manera equivalente.
   24. Implementar la exposición experimental ALAN para cajas experimentales. Durante el período experimental, monte el sistema LED y la cámara IR dentro de la caja nido, como se describió anteriormente, y configure el temporizador para controlar el período deseado de exposición a la luz.
   25. Recarga las baterías. Para experimentos que involucran varias noches de exposición a la luz y grabación de video, recoja los sistemas cada mañana para recargar las baterías durante el día y luego reemplace el sistema por la noche.
4. Recopilar datos sobre la(s) variable(s) de respuesta de interés.
   1. Si el comportamiento dentro de la caja nido es la variable de interés, la cámara IR permitirá documentar simultáneamente el comportamiento (por ejemplo, el comportamiento del sueño; Figura 3).
   2. Recopilar cualquier otro dato de interés a través de métodos de monitoreo adicionales, con muestreo que ocurre en puntos variables en el tiempo (por ejemplo, muestras de sangre tomadas antes y después de la exposición a la luz¹⁵).

Figura 3: Imagen infrarroja de una gran teta dentro de una caja nido expuesta a ALAN. (A) Dormir y (B) Alertar gran teta Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Los artículos de investigación revisados por pares publicados utilizando este sistema se resumen en la Tabla 2. Varios otros manuscritos están en progreso. Estos estudios abordan tres conjuntos principales de preguntas de investigación. En primer lugar, el sistema se ha utilizado para estudiar los efectos de la exposición a la luz en el comportamiento del sueño y los niveles de actividad en adultos. Con este fin, se empleó un diseño experimental de medidas repetidas, en el que el mismo individuo ...

Discusión

Este sistema basado en cajas nido de luces LED y una cámara IR emparejada ha permitido a los investigadores evaluar una serie de preguntas intrigantes con respecto a los efectos biológicos de ALAN. Además, hay muchas más direcciones de investigación que se pueden seguir con el sistema. Además, ampliar el uso del sistema a otras especies podría ayudar a fomentar la comprensión de las diferencias interespecíficas en la sensibilidad a ALAN. A continuación se presentan algunas posibilidades no exhaustivas para futu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight	RANEX; Gilze; Nederlands	6000.217	A similar model could also be used
Battery	BYD	R1210A-C	Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint			Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape			For electronics
Homemade timer system	Amazon	YP109A 12V	A similar model could also be used
Infrared camera	Koberts-Goods, Melsungen, DE	205-IR-L	Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter	ISO-Tech ILM; Corby; UK	1335	To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder	Pakatak, Essex, UK	MD-101	Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags	Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK	EM4102	125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader	Trovan, Aalten, Netherlands	GR-250	To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor	RS Components		Value depending on voltage battery and illumination
SD card	SanDisk		64 GB or larger
SongMeter	Wildlife Acoustics; Maynard, MA		Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor	Walmart		Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood			To construct nest boxes/electronic encolsures