夜間の人工光が放し飼い動物に及ぼす影響を調べるための実験的アプローチ:その実施、結果、今後の研究の方向性

要約

夜間の人工光(ALAN)は、広範囲に及ぶ生物学的効果を有する。この記事では、バッテリー、タイマー、およびオーディオ対応赤外線ビデオカメラに結合されたLEDライトで構成される、動作を監視しながらネストボックス内のALANを操作するシステムについて説明します。 研究者は、このシステムを使用して、ALANが生物に及ぼす影響に関する多くの未解決の疑問を探求することができます。

要約

動物は光と闇の自然なパターンで進化してきました。しかし、人工光は、人間のインフラやレクリエーション活動から環境にますます導入されています。夜間の人工光(ALAN)は、動物の行動、生理学、フィットネスに広範な影響を与える可能性があり、人口やコミュニティに広範な影響を与える可能性があります。放し飼いの動物に対するALANの影響を理解することは、移動生物が遭遇する光のレベルを測定し、ALANの影響を他の人為的外乱要因の影響から分離するなどの課題のために、自明ではありません。ここでは、巣箱内の光レベルを実験的に操作することによって、個々の動物に対する人工光曝露の影響を分離できるアプローチについて説明します。この目的のために、発光ダイオード(LED)ライトをプレートに接着し、バッテリおよびタイマーシステムに接続するシステムを用いることができる。このセットアップにより、巣箱内の個人をALANのさまざまな強度と持続時間にさらしながら、同時にオーディオを含むビデオ録画を取得できます。このシステムは、放し飼いのオオシジュウカラ(Parus major)と青いシジュウカラ(Cyanistes caeruleus)に関する研究で使用され、ALANが成人の睡眠と活動パターン、および雛の発達における生理学とテロメアダイナミクスにどのように影響するかについての洞察を得ています。このシステムまたはその適応は、ALANが他の外乱因子とどのように相互作用し、生体エネルギーバランスに影響を与えるかなど、他の多くの興味深い研究上の質問に答えるために使用することができる。さらに、同様のシステムを様々な種の巣箱、巣箱、巣穴の中または近くに設置して、ALANのレベルを操作し、生物学的反応を評価し、種間視点の構築に取り組むことができる。特に、自由生活動物の行動と動きを監視するための他の高度なアプローチと組み合わせると、このアプローチはALANの生物学的影響の理解に継続的な貢献をもたらすことを約束します。

概要

動物は、昼と夜を定義する光と闇の自然なパターンで進化してきました。したがって、ホルモン系の概日リズムは、休息と活動パターンを調整し、動物がフィットネスを最大化することを可能にします^1,2,3。例えば、グルココルチコイドホルモンの概日リズムは、日常活動の開始時にピークを有し、脊椎動物がグルコース代謝および環境ストレッサーに対する応答性に及ぼす影響を介して、24時間にわたって適切に行動するようにプライミング^する4。同様に、暗闇に応答して放出される松果体ホルモンのメラトニンは、概日リズミシティの支配パターンに一体的に関与し、抗酸化特性も有する^5,6。メラトニン放出などの概日リズミシティの多くの側面の巻き込みは、環境中の光のレベルを光受容することによって影響を受ける。したがって、人間の活動、レクリエーション、およびインフラストラクチャをサポートするために環境に人工光を導入することは、放し飼いの動物の行動、生理学および適応度に広範な影響を与える可能性を秘めている^7,8。実際、夜間の人工光への曝露(ALAN)の多様な影響は^9,10で文書化されており、ALANは21^世紀の地球変動研究の優先事項として強調されています¹⁰。

放し飼いの動物に対するALANの効果を測定することは、多くの理由で自明ではない課題を提起します。第一に、環境中を移動する移動動物は、常に異なるレベルの光を経験します。では、個々の動物がさらされる光のレベルをどのように定量化すればよいのでしょうか。動物の領域上の光のレベルを定量化できたとしても、動物は曝露パターンに影響を与える回避戦略を採用する可能性があり、したがって、動物の位置と光レベルの同時追跡を必要とする。実際、ほとんどのフィールド研究では、光曝露レベルの平均と変動は不明です¹¹。第二に、ALANへの曝露は、騒音公害、化学物質曝露、生息地の劣化などの他の人為的障害要因への曝露としばしば相関している。例えば、道路の縁に沿って生息地を占有している動物は、街路灯からの光、車両交通からの騒音、および車両排出物による大気汚染にさらされます。それでは、ALANの効果を交絡変数の影響から効果的に分離するにはどうすればよいでしょうか。光曝露レベルと応答変数の両方の良好な測定を可能にする厳格な野外実験は、ALANの生物学的影響の重症度を評価し、効果的な緩和戦略を開発するために不可欠である¹¹。

この記事では、制限がないわけではありませんが(議論のセクションを参照)、上記で特定された困難を排除するものではないにしても、緩和に役立つ実験的なアプローチについて説明します。このアプローチでは、発光ダイオード(LED)ライトのシステムと巣箱内に設置された赤外線(IR)カメラを使用して、自由に生活する日周の鳥種であるオオシジュウカラ(Parus major)の巣箱内のALANレベルを実験的に操作します。このセットアップにより、オーディオを含むビデオ録画の同時取得が可能になり、研究者は行動や発声への影響を評価できます。大きなおっぱいは繁殖のために巣箱を利用し、11月から3月の間は巣箱で眠ります。雌はまた、繁殖期¹²の間に巣箱の中で眠る。このシステムはまた、青いおっぱい(Cyanistes caeruleus)に対するALANの効果を研究するために、より少ない程度で使用されています。動物が遭遇する光レベルを知ることを含む最初の困難は、個体が巣箱に入ることをいとわない(または不動の雛の場合にはすでに巣箱に入っている)ことを考えると、光レベルは研究者によって正確に決定され得るという点で軽減される。交絡変数との相関関係を含む第2の困難は、同様の環境でネストボックスを使用したり、ネストボックスの近くの交絡変数のレベルを測定したりすることによって制御できます。さらに、空洞巣の鳥類では、巣箱や自然の空洞が雛や成虫をALAN¹³から守ることができるため、実験的アプローチを採用することは強力であり、相関研究の中にはALAN(または人為的ノイズ)の影響がほとんど見られない理由が説明できる¹⁴が、実験的研究ではより頻繁に明確な効果が見られる(下記参照)。さらに、個人が自分のコントロールとして機能する反復測定実験計画を採用することができ、統計的検出力と意味のある生物学的効果を検出する確率がさらに高まります。以下のセクションでは、(1)システムの設計と実装の詳細を説明し、(2)これまでにシステムを使用して導き出された重要な結果を要約し、(3)おっぱいと他の動物の両方で追求できる将来の研究の方向性を提案します。

プロトコル

動物実験へのこのシステムのすべての適用は、アントワープ大学の倫理委員会によって承認され、ベルギーとフランドルの法律に従って実施されました。方法論は、行動研究における動物の使用に関するASAB / ABSガイドラインに準拠しています。ベルギー王立自然科学研究所(Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen;KBIN)は、すべての研究者および職員にライセンスを提供しました。

1. 実験システムの構築

1. ALAN の作成に使用する広域スペクトル LED を入手します。LEDヘッドライトからLEDライトを取り出します。拡散照明を強化するには、単一のLEDライトまたは複数の(例:4つの)広域スペクトルLEDライトを使用します(図1)。
   注:修正として、異なるスペクトル特性(例えば、赤対青)を有するLEDを使用することもできるが、異なるソースから入手しなければならない(このシステムを用いた過去の研究で使用されたLEDのスペクトル特性については、Grunst et al.^{2019 15} の補足材料を参照)。
2. 動作監視を可能にするために、赤外線カメラとともにLEDを取り付けるシステムを設計します。研究者は、さまざまな方法でこの目的を達成することができます。
   1. オプション1.1つの広域スペクトルLEDを、巣箱内に収まるプラスチックまたは金属板に接着剤で取り付けたIRカメラに隣接するプラスチックチューブに別々に入れます(図1A、B)。
   2. オプション2。IRカメラをプラスチックまたは金属製のプレートの中央位置に取り付け、IRカメラを囲むプレートの固定位置にLEDライトを取り付けます(図1C)。
3. システムを電源 (バッテリー) およびタイマーに接続する手段を設計します。
   1. ナイフまたはドリルを使用して、ネストボックスの側面に木立を作り、そこからワイヤコネクタを伸ばしてシステムをFeバッテリ(12V、120Wh)および自家製タイマー(12V)に接続できます。
   2. 色、長さ、幅で巣箱と一致する濃い緑色の木製の囲いを設計し(例えば、過去の研究で使用された巣箱の寸法は120 mm x 155 mm x 250 mmでした)、バッテリー、ビデオ用のレコーダー、およびLED用のタイマーシステムを収容するためのヒンジを介して片側開口部を有する(図2;補足図1および補足図2)。
4. ALAN 強度を調整する手段を設計します。
   1. 抵抗(バッテリ電圧と照明に依存)を取得し、LEDと直列に接続します。
5. タイマーとバッテリーを収容するエンクロージャと同じ寸法の「ダミー」ボックスを設計して、鳥をシステムに慣れさせるのに使用します(つまり、 図2Aのように、内部電子機器はありません)。
   注:セクション2とセクション3では、ALANが焦点生物に及ぼす影響を研究するために使用されるステップバイステップの方法について説明します。

図1:IRカメラとLEDライトで構成される2つのシステムは、ネストボックス内のALANを操作するために使用されていました。(A)古いシステムを所定の位置に保持するプレートを備えたネストボックスの上面図。(B)10個のIR LEDでALANと中央カメラを操作するための1つの広域スペクトルLEDを備えた古いシステム (c)4つの広域スペクトルLEDを備えた新しいシステムと4つのIR LEDを備えた中央IRカメラ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: ALAN およびビデオ録画の動作を操作するために使用される自家製のバッテリとタイマー ユニット 。(A) ユニットは、巣箱の上に取り付けられた木箱に囲まれています。(B)ユニット内の電子機器の図。コネクタは、巣箱の内側から木製の筐体に伸びて、電子機器をIRカメラと広域スペクトルLEDに接続します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 実験を計画し、ALANの強度とタイミングを調整する

1. 動物を露出させる目的光強度を決定します。
   1. 研究の質問に答える有意義な結果を生み出すために、どの実験光強度を使用するかを慎重に検討してください。一般に、これは、放し飼いの動物が遭遇する可能性が高い生態学的に関連する光強度を選択することを意味する(ガイダンスについては 表1 を参照)。
2. LEDライトを所望の光強度(例えば、過去の研究で使用されているように、1〜3ルクス;表 1 および 表2)。
   1. 現場に配置する前に、実験室に持ち込んだ巣箱にシステムを置き、光強度を校正します。以下で詳しく説明するように、LED を電源に接続します (プロトコルのセクション 3)。
   2. 巣箱(下から約8cm)内の鳥のレベルに照度計を配置し、同時にLEDと直列に抵抗を調整することによって、LEDから放出される光を所望の強度(ルクス)に調整する。
      注: 非常に低い光強度(たとえば、田舎の空のグロー レベル、0.01 ルクス)を達成することは可能です。
3. 動物をALANにさらす時間枠を決定します。
   1. 一晩中の露出の長さとタイミングを決定します。例えば、一晩中、夜の一部だけ動物をアランにさらしたり、夜中に暗闇の期間を残して摂動の程度を減らすことができます。
   2. 動物がALANにさらされるために巣箱(または特定の領域)に入る必要がある場合は、侵入イベントが発生する前または後にライトをオンにするかどうかも検討してください。
4. タイマーを設定して、夜間の光の露出期間を制御します。
   1. ブロードスペクトルLEDに接続されたタイマーを、指定した期間(例えば、日没の少なくとも2時間前に点灯、日の出の2時間後に消灯するなど)にライトがオン/オフになるように設定します。
      注:IRカメラは、光露光の間、動物の行動を同時に記録することができ、充電されたバッテリーに接続されている限りオンになります。
5. ターゲットとする研究課題に使用する適切な実験計画を決定します。
   注:いくつかの質問では、反復測定実験計画が最も強力な選択肢になります(例えば、ALANへの曝露は睡眠行動にどのように影響しますか?他のグループでは、ペアのコントロールと実験グループが必要になります(例えば、ALANへの曝露は、発達中の雛のテロメア喪失にどのように影響しますか?

ソース/露出レベル	強度(ルクス)
完全な日差し	103000
満月の光	0.05–1
アーバンスカイグロー	0.2–0.5
自由生活のヨーロッパクロウタドリの暴露	0.2 (0.07–2.2)
本システムを用いた過去の実験的研究	1–3
LED街路灯	~10
低圧ナトリウム街路灯	~10
高圧ナトリウム	~10
花の照明	300
メタルハライド	400–2000

表1:環境³、⁹における特徴的な光強度、放し飼いの鳥^類41の曝露レベル、およびこのシステムを用いた過去の研究で用いた強度(表2の参考文献)。

3. ALAN へのエクスポージャーの実施

1. 実験セットアップに動物を慣れさせる。
   1. 可能であれば、実験のコンテキスト内で、新規性回避の影響を最小限に抑えるために、実験の少なくとも1日前にダミーボックスを巣箱の上部に配置することによって、動物をセットアップに慣れさせる。
2. 対象となる個人を調査する。
   1. 受動的統合トランスポンダ(PIT)タグを使用して研究集団内の動物を適合させ、鳥を邪魔することなく巣箱内で識別できるようにします。
   2. 睡眠行動に対するALANの効果を含む実験では、実験の前夜に巣箱を訪れ、無線周波数識別(RFID)リーダーで箱をスキャンして、どの鳥が内部でねぐらをしているかを判断します。
   3. 発達中の雛をALANに曝露する繁殖期の実験では、巣箱を一貫して(例えば、1日おきに)監視し、巣の内容と成虫の身元をチェックする。実験で使用するために、特定の特性(すなわち、モーダルなひなのサイズ、両親の存在と摂食の両方)を持つひなを含む巣箱を慎重に選択してください。
3. 実験を選択して実装します。
   1. 睡眠行動を含む実験では、3.3.2-3.3.21のステップに従って、ALAN(対照治療)の非存在下での乱れのない睡眠を記録するために、少なくとも1晩は暗闇の条件下で眠っている個人を最初に記録することによって、反復測定計画を実施する。
   2. この目的のために、IRカメラを現場に持ち込む前に、現地時間と時間を同期させるようにしてください。
   3. バッテリに隣接するミニDVRレコーダーのSDスロットにSDカードを挿入します(図2B; 補足図2)。SDカードが空であることを確認し、空でない場合は、SDカードに含まれるデータを消去します。
   4. 暗闇が始まる少なくとも2時間前に、巣箱の上からダミーボックスを取り外します。
   5. 巣箱の蓋を開けます。
   6. IRカメラの入ったプレートを巣箱の内側に置き、カメラの対物レンズを下向きにします。
   7. 電子コネクタを巣箱の木立から伸ばします。
   8. 巣箱のふたを閉じます。
   9. バッテリー、レコーダー、タイマーが入ったエンクロージャーを巣箱の上に置きます。
   10. バッテリーの電源コネクタを接続します。レコーダーの赤いコネクターをカメラの白いコネクター(オーディオ)、レコーダーの黄色のコネクターをカメラの黄色のコネクター(ビデオ)に、バッテリーから黒いコネクターをカメラの赤いコネクター(電源)に接続します(補足図1、補足図2)。
   11. 録画ボタンを押して、カメラの録画を開始します。
       メモ:タイマーは設定されず、電源はLEDを制御するタイマーに接続されないため、制御夜間にALANが生成されません。
   12. 小さな tft 画面で、記録が開始されたこと、およびイメージが正しいことを確認します。tft画面を接続するポートは、レコーダーの下にあります(補足図2)。
   13. 暗くなってから約1時間後、巣箱に戻り、RFIDトランスポンダリーダーを巣箱の底と側面に動かし、PITタグから伝達された一意の識別番号を記録して、内部で眠っている鳥の身元を確認します。
   14. コントロール録音の翌朝、日の出から少なくとも2時間後に、巣箱に戻り、バッテリーシステムとIRカメラを集めます。
   15. もう一度、巣箱の上にダミーボックスを置きます。
   16. 研究室やオフィスでは、バッテリーを充電し、レコーダーからSDカードを取り外してダウンロードし、行動データを収集します。
       注:バッテリーの寿命は寒い状態で約30時間ですので、一晩中録音できますが、連続した夜の録音の間に完全に充電する必要があります。
   17. データを正常にダウンロードしたら、SDカードからデータを消去してから、ミニDVRレコーダーに再度挿入します。
   18. その後の夜に、光露光処理を実施する(例えば、1〜3ルクス、システムを用いた過去の実験で使用;表 1 および 表2)。
   19. 光露光の所望の期間のタイマーシステムを設定します。
   20. コントロール記録については、上記と同じ手順(3.3.2-3.3.17)に従いますが、タイマーを電源に接続し、LEDをタイマーに接続します(補足図1と補足図2)。
   21. 必要に応じて、3日目の夜に制御記録(暗闇の条件下での睡眠行動、すなわちALANの不在)を繰り返します。
   22. 雛をALANに曝露する実験については、ステップ3.3.23-3.3.25で説明されているように、対照および実験的なひなを使用してください。
   23. コントロールのひなの巣箱の上にダミーボックス(電子機器が欠けている)を置き、コントロールと実験の両方の雛を同等の方法で扱います。
   24. 実験的なボックスに対して実験的なALAN曝露を実施する。実験期間中は、前述のようにLEDシステムとIRカメラを巣箱内に取り付け、タイマーを設定して所望の光露光期間を制御する。
   25. バッテリーを充電します。複数晩の光暴露とビデオ録画を含む実験では、毎朝システムを集めて日中はバッテリーを充電し、夕方にはシステムを交換してください。
4. 目的の応答変数に関するデータを収集します。
   1. 巣箱内の挙動が関心のある変数である場合、IRカメラは同時に動作(例えば、睡眠動作; 図3)。
   2. 追加のモニタリング方法を介して関心のある他のデータを収集するが、サンプリングは可変時点(例えば、光曝露の前後に採取された血液サンプル¹⁵)で起こる。

図3:ALANにさらされた巣箱の中の大きなおっぱいの赤外線画像(A)眠っていることと(B)大きなおっぱいを警告するこの図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

結果

このシステムを使用して公開された査読付き研究論文を 表2にまとめた。他にもいくつかの写本が進行中です。これらの研究は、研究課題の3つの主要なスイートに対処しています。第一に、このシステムは、成人の睡眠行動および活動レベルに対する光曝露の影響を研究するために使用されている。この目的のために、同じ個体が最初に自然条件下での睡眠を記録し、続いて照?...

ディスカッション

LEDライトとペアのIRカメラのこのネストボックスベースのシステムにより、研究者はALANの生物学的効果に関するさまざまな興味深い質問を評価することができました。さらに、このシステムで追求できる研究の方向性は他にもたくさんあります。さらに、このシステムの使用を他の種に拡大することは、ALANに対する感受性の種間差の理解を促進するのに役立つ可能性がある。以下に、この論...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight	RANEX; Gilze; Nederlands	6000.217	A similar model could also be used
Battery	BYD	R1210A-C	Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint			Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape			For electronics
Homemade timer system	Amazon	YP109A 12V	A similar model could also be used
Infrared camera	Koberts-Goods, Melsungen, DE	205-IR-L	Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter	ISO-Tech ILM; Corby; UK	1335	To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder	Pakatak, Essex, UK	MD-101	Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags	Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK	EM4102	125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader	Trovan, Aalten, Netherlands	GR-250	To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor	RS Components		Value depending on voltage battery and illumination
SD card	SanDisk		64 GB or larger
SongMeter	Wildlife Acoustics; Maynard, MA		Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor	Walmart		Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood			To construct nest boxes/electronic encolsures