低输入细胞核分离和多路复用小鼠交感神经节条形码抗体进行单核RNA测序

摘要

该协议描述了用于单核测序的详细，低输入样品制备，包括小鼠上颈神经节和星状神经节的解剖，细胞解离，冷冻保存，细胞核分离和标签条形码。

摘要

心脏自主神经系统在控制心功能（如心率和心脏收缩力）方面至关重要，分为交感神经和副交感神经分支。通常，这两个分支之间存在平衡以维持体内平衡。然而，心肌梗死、心力衰竭和高血压等心脏病状态可诱发心脏神经支配中涉及的细胞重塑，这与不良临床结果相关。

虽然心脏自主神经系统的组织学结构和功能有大量的数据，但其在健康和疾病中的分子生物学结构在许多方面仍然是神秘的。单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术有望以单细胞分辨率对组织进行遗传表征。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍这些技术的标准化使用。在这里，该协议利用基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq），这是一种表征心脏交感神经元在健康和疾病中的生物学结构的方法。证明采用逐步方法对从成年小鼠中解剖的双侧上颈椎（SCG）和星状神经节（StG）进行snRNA-seq。

这种方法能够长期保存样品，当无法在短时间内一次收集来自多个个体/实验的样品时，保持足够的RNA质量。使用标签寡核苷酸（HTO）对细胞核进行条形码，可以在测序后对不同的神经节样本进行解复用和追溯。随后的分析显示，交感神经节的神经元、卫星神经胶质和内皮细胞成功捕获细胞核，经 snRNA-seq 验证。总之，该协议为交感神经外源性心神经节的snRNA-seq提供了一种逐步的方法，该方法有可能在其他器官和组织的神经支配研究中得到更广泛的应用。

引言

自主神经系统（ANS）是维持身体稳态的周围神经系统的重要组成部分，包括对环境条件和病理学的适应¹。它参与调节全身的多个器官系统，如心血管，呼吸，消化和内分泌系统。ANS分为交感神经和副交感神经分支。交感神经系统突触的脊柱分支在交感神经链的神经节中，双侧位于椎旁位置。双侧颈神经节和胸神经节，尤其是 StG，是参与心脏交感神经支配的重要组成部分。在疾病状态下，例如心脏缺血，可能发生神经元重塑，导致交感神经过驱²。神经元重塑已经在人类和其他几种动物物种的多项组织学研究中得到证实^{3，4，5，6}。目前缺乏心脏缺血诱导的心脏交感神经节中神经元重塑的详细生物学表征，并且心脏交感神经系统（SNS）内特化神经元细胞类型或亚型的基本生物学特征尚未完全确定在健康和疾病⁷中。

新技术，如scRNA-seq，为单细胞水平^8，9上小组织的遗传表征打开了大门。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍....

研究方案

该协议描述了小鼠宫颈和/或宫颈胸（星状）神经节的snRNA-seq所需的所有步骤。使用雌性和雄性C57BL / 6J小鼠（15周龄，每个性别n = 2）。另外一只Wnt1-Cre;mT/mG小鼠用于可视化神经节以进行解剖^17，18。这只额外的小鼠是由 B6.Cg-Tg（Wnt1-cre）2Sor/J小鼠和B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo/J小鼠的杂交杂交产生的。所有动物实验均根据NIH出版并经莱顿大学动物伦理委员会批准的《实验动物护理和使用指南》（许可证号AVD1160020185325，荷兰莱顿）进行。有关协议中使用的所有材料，设备，软件和动物的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 准备工作

注意：所有步骤都在细胞培养流柜中执行。

1. 通过将仪器浸入70%乙醇中20分钟来清洁镊子和剪刀。
2. 准备由补充有B-27加（1x），L-谷氨酰胺（2mM）和1%抗生素抗真菌剂的神经基培养基组成的神经节培养基。在室温下预热神经节介质。
3. 制备消化溶液：将0.25%胰蛋白酶-EDTA（1：1）和1，400 U / mL胶原酶2型溶解在....

结果

单核cDNA文库制备和snRNA-seq的质量控制分析
代表性结果描述了单个池中10，000个捕获的细胞核的测序结果，该池具有25，000次读取/细胞核基因表达库和5，000次读取/核主题标签库。 图3B 显示了用生物分析仪检查^的第 一链cDNA，基因表达（GEX）文库和HTO文库的质量控制结果。HTO衍生的cDNA预计小于180 bp，而mRNA衍生的cDNA大于300 bp。高质量GEX库可以被检测为从.......

讨论

在这里，描述了一个详细的方案，重点是i）解剖成年小鼠上颈椎和星状交感神经节，ii）神经节细胞的分离和冷冻保存，iii）细胞核分离，以及iv）使用HTO标记进行细胞核条形码以进行多重检测和snRNA-seq。

通过该方案，可以使用常用的胰蛋白酶和胶原酶解离单个神经节，从而轻松获得交感神经节细胞。通过补充10%DMSO的FBS中冷冻细胞，也很容易实现分离的神经节细胞的长期保?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0.4% trypan blue dye	Bio-Rad	1450021
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Collagenase type 2	Worthington	LS004176	use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	67685
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)	Biowest	S1810-500
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)	Sigma-Aldrich	74385	Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)	Invitrogen	AM9937	Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)	Invitrogen	AM9937	ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20	Merck Millipore	822184	ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody	Biolegend	682205	Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody	Biolegend	682207	Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody	Biolegend	682209	Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody	Biolegend	682225	Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody	Biolegend	682227	Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody	Biolegend	682229	Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody	Biolegend	682231	Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody	Biolegend	682233	Hashtag antibody
TruStain FcX (human)	Biolegend	422302	FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer	Merck	Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38	Eppendorf	EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish	Corning	351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Fine science tools	11252-40
Hardened Fine Scissors	Fine science tools	14091-09
Ice Pan, rectangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Leica		Microscope
Moria MC50 Scissors	Fine science tools	15370-50
Noyes Spring Scissors	Fine science tools	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Olympus		Microscope
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Preseparation Filters (30 µm)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath	GFL	1083
Silicon plate	RubberBV	3530	Dissection board
Software and packages
Cell ranger	V4.0.0
R programming	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #007576
C57BL/6J mice	Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE