Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

Résumé

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Résumé

Le système nerveux autonome cardiaque est crucial dans le contrôle de la fonction cardiaque, comme la fréquence cardiaque et la contractilité cardiaque, et est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Normalement, il y a un équilibre entre ces deux branches pour maintenir l’homéostasie. Cependant, les états pathologiques cardiaques tels que l’infarctus du myocarde, l’insuffisance cardiaque et l’hypertension peuvent induire le remodelage des cellules impliquées dans l’innervation cardiaque, ce qui est associé à un résultat clinique défavorable.

Bien qu’il existe de grandes quantités de données sur la structure histologique et la fonction du système nerveux autonome cardiaque, son architecture biologique moléculaire dans la santé et la maladie est encore énigmatique à bien des égards. De nouvelles technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) sont prometteuses pour la caractérisation génétique des tissus à résolution unicellulaire. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation standardisée de ces techniques. Ici, ce protocole exploite le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes (snRNA-seq), une méthode pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Une approche par étapes est démontrée pour effectuer la séquence d’ARNN des ganglions cervicaux supérieurs bilatéraux (SCG) et stellaires (StG) disséqués à partir de souris adultes.

Cette méthode permet la conservation à long terme des échantillons, en maintenant une qualité d’ARN adéquate lorsque les échantillons de plusieurs individus / expériences ne peuvent pas être collectés tous en même temps dans un court laps de temps. Le codage à barres des noyaux avec des oligos de hashtag (HTO) permet de démultiplexer et de retracer des échantillons ganglionnaires distincts après le séquençage. Des analyses ultérieures ont révélé une capture réussie des noyaux des cellules neuronales, gliales satellites et endothéliales des ganglions sympathiques, validée par snRNA-seq. En résumé, ce protocole fournit une approche par étapes pour l’ARNN-seq des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une application plus large dans les études de l’innervation d’autres organes et tissus.

Introduction

Le système nerveux autonome (SNA) est une partie cruciale du système nerveux périphérique qui maintient l’homéostasie du corps, y compris l’adaptation aux conditions environnementales et à la pathologie¹. Il est impliqué dans la régulation de plusieurs systèmes d’organes dans tout le corps tels que les systèmes cardiovasculaire, respiratoire, digestif et endocrinien. Le SNA est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Les branches vertébrales du système nerveux sympathique synapsent dans les ganglions de la chaîne sympathique, situés bilatéralement en position paravertébrale. Les ganglions cervicaux et thoraciques bilatéraux, en particulier la StG, sont des composants importants participant à l’innervation sympathique cardiaque. Dans les états pathologiques, tels que l’ischémie cardiaque, un remodelage neuronal peut se produire, entraînant une surenchère sympathique². Le remodelage neuronal a été démontré dans de multiples études histologiques chez l’homme et plusieurs autres espèces ^{animales 3,4,5,6}. Une caractérisation biologique détaillée du remodelage neuronal induit par l’ischémie cardiaque dans les ganglions sympathiques cardiaques fait actuellement défaut, et les caractéristiques biologiques fondamentales des types ou sous-types de cellules neuronales spécialisées dans le système nerveux sympathique cardiaque (SNS) ne sont pas encore entièrement déterminées dans la santé et la maladie⁷.

De nouvelles technologies, telles que scRNA-seq, ont ouvert des portes pour la caractérisation génétique de petits tissus au niveau ^8,9 d’une seule cellule. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation optimisée de ces techniques unicellulaires chez l’homme¹⁰. En outre, le séquençage unicellulaire nécessite un débit élevé de cellules pour récupérer un nombre suffisant de cellules en raison d’une perte élevée dans le processus de séquençage. Cela peut s’avérer difficile lors de l’étude de petits tissus difficiles à capturer en une seule session et nécessitant plusieurs échantillons pour introduire suffisamment de cellules uniques pour le séquençage. La technologie snRNA-seq à base de gouttelettes récemment développée (c’est-à-dire la plate-forme 10x Chromium) permet d’étudier les différences biologiques entre les noyaux simples^11,12. snRNA-seq détient un avantage sur scRNA-seq pour les grandes cellules (>30 μm), qui peuvent ne pas être capturés dans Gel Bead in Emulsions (GEM), ainsi qu’une compatibilité améliorée avec une dissociation étendue et / ou une conservation prolongée 13,14,15.

L’hétérogénéité, le nombre de cellules neuronales et d’autres cellules enrichies dans le SNS cardiaque sont des aspects importants pour la caractérisation du SNA dans les états de santé et de maladie. De plus, l’innervation spécifique à un organe ou à une région par chaque ganglion sympathique contribue à la complexité du SNS. De plus, il a été démontré que les ganglions cervicaux, stellaires et thoraciques de la chaîne sympathique innervent différentes régions du cœur¹⁶. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer une analyse mononucléaire des cellules ganglionnaires dérivées de ganglions individuels pour étudier leur architecture biologique.

Le snRNA-seq à base de gouttelettes permet un profilage d’expression à l’échelle du transcriptome pour un pool de milliers de cellules provenant de plusieurs échantillons à la fois avec des coûts inférieurs à ceux des plates-formes de séquençage sur plaques. Cette approche permet aux snRNA-seq à base de gouttelettes d’être plus adaptés à la classification du phénotype cellulaire et à l’identification de nouvelles sous-populations de cellules au sein du SCG et du StG. Notamment, ce protocole fournit une approche concise par étapes pour l’identification, l’isolement et le séquençage de l’ARN mononuclé des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une large application dans les études de la caractérisation des ganglions innervant d’autres organes et tissus apparentés dans la santé et la maladie.

Protocole

Ce protocole décrit toutes les étapes requises pour le séquençage de l’ARNn des ganglions murins cervicaux et/ou cervicothoraciques (stellaires). Des souris femelles et mâles C57BL/6J (âgées de 15 semaines, n = 2 pour chaque sexe) ont été utilisées. Une souris Wnt1-Cre;mT/mG supplémentaire a été utilisée pour visualiser les ganglions à des fins de dissection^17,18. Cette souris supplémentaire a été générée par le croisement d’une souris B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J et d’une souris B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les NIH et approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Université de Leiden (numéro de licence AVD1160020185325, Leiden, Pays-Bas). Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels et animaux utilisés dans le protocole.

1. Préparatifs

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées dans une armoire de flux de culture cellulaire.

1. Nettoyez les pinces et les ciseaux en immergeant les instruments dans de l’éthanol à 70% pendant 20 min.
2. Préparer le milieu ganglionnaire composé de milieu neurobasal complété par B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) et 1% antibiotique-antimycotique. Préchauffer le milieu ganglionnaire à température ambiante.
3. Préparer la solution de digestion : 0,25 % de trypsine-EDTA (1:1) et 1 400 U/mL de collagénase de type 2 dissous dans le milieu ganglionnaire.
4. Préparer un tampon de lavage cellulaire frais et froid (4 °C) (0,4 % d’albumine sérique bovine [BSA]) et un tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl₂ et 0,1 % de détergent non ionique, 40 U/mL d’ARNase dans de l’eau sans nucléase) pour l’isolement du noyau.
5. Préparer un tampon de lavage du noyau (1x solution saline tamponnée au phosphate [PBS] avec 2,0 % de BSA et 0,2U/μL d’inhibiteur de la RNase).
6. Préparer le tampon de coloration ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 2 % BSA, 0,02 % Tween-20 dans de l’eau sans nucléase).

2. Dissection des ganglions cervicaux supérieurs de souris adultes (SCG)

1. Euthanasiez les souris et gardez-les sur la glace.
   NOTE: Dans la présente étude, un total de 4 souris C57BL6 / J ont été euthanasiées par asphyxie au CO₂ . Alternativement, l’isoflurane peut être utilisé suivi d’une exsanguination lorsqu’une grande quantité de sang doit être collectée à d’autres fins d’étude.
2. Fixez la souris sur une planche de dissection avec des broches et arrosez-la d’éthanol à 70% pour minimiser la dispersion de la fourrure (le rasage n’est pas nécessaire).
3. Sous un stéréomicroscope, ouvrez la peau de la région du cou en faisant une coupe médiane avec des ciseaux, écartez les glandes sous-maxillaires et retirez le muscle sternomastoïde pour exposer et localiser l’artère carotide commune et sa bifurcation (Figure 1A, B, voir flèche).
4. Disséquez la bifurcation de l’artère carotide droite et gauche et le tissu qui y est attaché. Transférer chaque morceau de tissu disséqué dans une boîte de Petri séparée de 3,5 cm contenant du PBS froid.
5. Recherchez le SCG attaché à la bifurcation carotidienne. Nettoyez davantage le SCG en retirant l’artère et d’autres tissus attachés dans la boîte de Pétri (Figure 1E).

3. Dissection des ganglions stellaires de souris adultes (StG)

1. Pour disséquer le StG, faites une coupe médiane dans l’abdomen, suivie de l’ouverture du diaphragme et de la paroi thoracique ventrale.
2. Retirez le cœur et les poumons pour exposer le thorax dorsal. Recherchez le StG antérolatéral gauche et droit au musculus colli longus (LCM) au niveau de la première côte (Figure 1C, D, indiqué par des lignes pointillées).
3. Disséquez les StG gauche et droit avec des pinces et transférez-les séparément dans des boîtes de Petri de 3,5 cm contenant du PBS froid (Figure 1F).
   ​

4. Isolement et cryoconservation des cellules ganglionnaires de souris

Les étapes 4 à 6 sont résumées à la figure 2.

1. Transférez soigneusement tous les SCG et StG individuels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL séparés à l’aide de pinces.
   REMARQUE: N’utilisez pas d’embouts de pipette pour transférer les ganglions, car les ganglions sont enclins à adhérer à la paroi des embouts de pipette en plastique.
2. Ajouter 500 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 40 min.
   REMARQUE: Cette étape vise à faciliter la digestion et la libération cellulaire ci-après dans la solution de collagénase de type 2.
3. Préparer un tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu ganglionnaire pour chaque échantillon. Laissez les ganglions s’installer au fond des tubes de microcentrifugation. Recueillir le surnageant, qui contient très peu de cellules ganglionnaires, transférer le surnageant dans les tubes préparés de 15 mL et étiqueter chaque tube. Alternativement, pour gagner du temps, aspirer le surnageant trypsine-EDTA sans prélèvement car très peu de cellules dissociées peuvent y être détectées.
   REMARQUE: Une petite quantité de solution de trypsine-EDTA (~ 10-30 μL) peut être laissée dans le tube de microcentrifugation pour éviter l’élimination des ganglions. Évitez le pipetage à cette étape, car il pourrait endommager les ganglions et entraîner un faible rendement de cellules ganglionnaires par la suite.
4. Ajouter 500 μL de solution de collagénase de type 2 dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 35-40 min. Essayez de remettre le ganglion en suspension après 35 minutes; si le ganglion est encore intact et ne se dissocie pas, prolongez le temps d’incubation ou augmentez la concentration de solution de collagénase de type 2 si nécessaire.
   REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier en fonction de la taille du ganglion.
5. Resuspendez les ganglions dans une solution de collagénase en pipetant de haut en bas ~ 10 fois ou jusqu’à ce que les amas de tissus ne soient plus détectés.
6. Transférer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL précédemment utilisé qui contient le milieu de culture des ganglions et la suspension de trypsine-EDTA du même ganglion. Faites tourner la suspension de la cellule avec une centrifugeuse à rotor à godet oscillant pendant 10 min, 300 × g à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant cellulaire.
   REMARQUE: Parce que les cellules ganglionnaires sont dissociées d’un seul ganglion, la pastille cellulaire peut être trop petite pour être détectée à l’œil nu; une petite quantité de surnageant peut être laissée dans le tube pour éviter l’enlèvement accidentel de la pastille de cellule.
7. Remettre en suspension les cellules ganglionnaires dans 270 μL de sérum fœtal bovin (FBS, faible endotoxine) et transférer chaque suspension cellulaire-FBS dans un cryoviral de 1 mL.
8. Pour compter les cellules, mélanger 5 μL de la suspension de cellules ganglionnaires avec 5 μL de colorant bleu trypan à 0,4% et charger le mélange dans un hémocytomètre. Comptez le nombre total et le nombre de cellules vivantes au microscope.
   REMARQUE: La viabilité cellulaire (nombre de cellules vivantes / nombre total de cellules = viabilité %) est généralement supérieure à 90% avec ce protocole de dissociation. Le nombre de cellules vivantes d’un seul ganglion (SCG ou StG) se situe généralement entre 9 000 et 60 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines.
9. Ajouter 30 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque suspension cellulaire-FBS dans les cryoviales, bien mélanger et transférer les cryoviales dans un récipient de congélation cellulaire, qui est maintenu à température ambiante. Conservez le récipient chargé de cryovial à -80 °C pendant la nuit et transférez les cryoviaux dans de l’azote liquide le lendemain pour une conservation prolongée avant le séquençage.

5. Isolement du noyau

REMARQUE: Le SCG gauche et droit isolé à partir de quatre souris (au total 8 échantillons) a été utilisé comme exemple dans la préparation suivante de l’isolement et du séquençage du noyau. Gardez tout sur la glace pendant toute la procédure. En raison de l’invisibilité des petites pastilles de noyau, une centrifugeuse avec des seaux oscillants est fortement recommandée pour faciliter l’élimination des surnageants tout au long de la procédure.

1. Préparer des tubes de 15 mL avec une passoire (30 μm) sur le dessus et précuire la passoire avec 1 mL du milieu ganglionnaire.
2. Retirez les cryoviaux de l’azote liquide et décongelez-les immédiatement au bain-marie à 37 °C. Lorsqu’un petit boulet de glace est laissé dans le cryovial, sortez les cryoviales du bain-marie.
3. Récupérez les cellules ganglionnaires en laissant tomber 1 mL du milieu ganglionnaire dans chaque cryovial tout en secouant soigneusement à la main. Facultatif : Pour évaluer la récupération cellulaire, mélanger la suspension cellulaire après la récupération et prélever 5 μL de suspension cellulaire pour le comptage des cellules vivantes, comme décrit à l’étape 4.8.
4. Charger chaque suspension de cellules ganglionnaires sur une passoire séparée (préparée à l’étape 5.1) et rincer chaque passoire avec 4-5 mL de milieu ganglionnaire.
5. Centrifuger la suspension de cellule tendue pendant 5 min à 300 × g, retirer soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon de lavage cellulaire.
6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation à faible liaison ADN/ARN de 0,5 mL.
7. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
8. Retirez 45 μL du surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille de cellule.
9. Ajouter 45 μL de tampon de lyse réfrigéré et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
10. Incuber les cellules pendant 8 min sur de la glace.
11. Ajouter 50 μL de tampon de lavage à noyau froid à chaque tube. Ne pas mélanger.
12. Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.
13. Retirer 95 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.
14. Ajouter 45 μL de tampon de lavage de noyau réfrigéré à la pastille. Facultatif: Prendre 5 μL de suspension de noyau, mélanger avec 5 μL de 0,4% de bleu de trypan pour compter, et vérifier la qualité des noyaux au microscope avec un hémocytomètre.
15. Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.
16. Retirez le surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.

6. Codage à barres du noyau avec hashtag oligos (HTOs) et multiplexage

REMARQUE: Les étapes de coloration HTO ont été modifiées et optimisées pour le marquage nucléaire de très faibles quantités de noyaux (ganglionnaires) selon l’application précédente dans le tissu cortical par Gaublomme et ^al.15.

1. Ajouter 50 μL de tampon ST-SB à la pastille du noyau, pipeter doucement 8 à 10 fois jusqu’à ce que les noyaux soient complètement remis en suspension.
2. Ajouter 5 μL de réactif Fc Blocking par 50 μL du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 10 min sur de la glace.
3. Ajouter 1 μL (0,5 μg) d’anticorps hashtag mononuclé par tube du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 30 min sur de la glace.
   REMARQUE: Un temps d’incubation plus court entraîne une baisse de l’efficacité de l’étiquetage des hashtags, comme le démontrent les résultats représentatifs.
4. Ajouter 100 μL de ST-SB à chaque tube. Ne pas mélanger.
5. Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min, 600 × g à 4 °C.
6. Retirer 145 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.
7. Répétez les étapes 6.4 et 6.5. Retirez le surnageant autant que possible sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.
8. Remettre en suspension la pastille du noyau dans 50 μL de ST-SB et mélanger doucement les noyaux.
9. Prenez 5 μL de la suspension du noyau et mélangez-la avec 5 μL de bleu de trypan à 0,4% pour compter les noyaux au microscope. Voir la figure 3A pour une image représentative de noyaux mélangés à du bleu de trypan et chargés dans un hémocytomètre.
10. Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min à 600 × g à 4 °C.
11. Remettre en suspension les noyaux dans ST-SB pour atteindre une concentration cible de noyaux de 1 000 à 3 000 noyaux/μL pour chaque échantillon en fonction du nombre de noyaux correspondant.
12. Regroupez les échantillons pour obtenir le nombre de cellules souhaité.
    REMARQUE: Par exemple, dans cette expérience, 8 échantillons ont été également regroupés pour atteindre un total de 25 000 noyaux pour passer immédiatement à 10x Genomics Chromium et snRNA-seq par la suite. Le nombre de noyaux se situe généralement entre 6 000 et 40 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines. Seulement environ la moitié des noyaux chargés totaux peuvent être capturés par snRNA-seq à base de gouttelettes. Par exemple, un mélange de 25 000 noyaux a été préparé pour assurer la capture de 10 000 noyaux, ce qui est nécessaire pour la préparation et le séquençage ultérieurs de la bibliothèque.

Résultats

Analyse du contrôle de la qualité de la préparation de la bibliothèque d’ADNc à noyau unique et de la formation d’ARNN
Les résultats représentatifs décrivent les résultats de séquençage de 10 000 noyaux capturés dans un seul pool avec une bibliothèque de 25 000 lectures/expression génique du noyau et une bibliothèque de hashtags de 5 000 lectures/noyau. La figure 3B illustre les résultats du contrôle de la qualité de la bibliothèque d’ADNc, d’ex...

Discussion

Ici, un protocole détaillé est décrit qui se concentre sur i) la dissection des ganglions cervicaux et sympathiques stellaires supérieurs de souris adultes, ii) l’isolement et la cryoconservation des cellules ganglionnaires, iii) l’isolement du noyau et iv) le codage à barres du noyau avec marquage HTO à des fins de multiplexage et de séquençage de l’ARNN.

Avec ce protocole, les cellules ganglionnaires sympathiques peuvent facilement être obtenues en dissociant les ganglions ind...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0.4% trypan blue dye	Bio-Rad	1450021
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Collagenase type 2	Worthington	LS004176	use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	67685
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)	Biowest	S1810-500
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)	Sigma-Aldrich	74385	Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)	Invitrogen	AM9937	Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)	Invitrogen	AM9937	ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20	Merck Millipore	822184	ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody	Biolegend	682205	Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody	Biolegend	682207	Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody	Biolegend	682209	Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody	Biolegend	682225	Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody	Biolegend	682227	Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody	Biolegend	682229	Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody	Biolegend	682231	Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody	Biolegend	682233	Hashtag antibody
TruStain FcX (human)	Biolegend	422302	FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer	Merck	Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38	Eppendorf	EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish	Corning	351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Fine science tools	11252-40
Hardened Fine Scissors	Fine science tools	14091-09
Ice Pan, rectangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Leica		Microscope
Moria MC50 Scissors	Fine science tools	15370-50
Noyes Spring Scissors	Fine science tools	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Olympus		Microscope
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Preseparation Filters (30 µm)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath	GFL	1083
Silicon plate	RubberBV	3530	Dissection board
Software and packages
Cell ranger	V4.0.0
R programming	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #007576
C57BL/6J mice	Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE