Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

Özet

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Özet

Kardiyak otonom sinir sistemi, kalp atış hızı ve kardiyak kontraktilitesi gibi kardiyak fonksiyonların kontrolünde çok önemlidir ve sempatik ve parasempatik dallara ayrılır. Normalde, homeostazı korumak için bu iki dal arasında bir denge vardır. Bununla birlikte, miyokard enfarktüsü, kalp yetmezliği ve hipertansiyon gibi kalp hastalığı durumları, olumsuz bir klinik sonuçla ilişkili olan kardiyak innervasyonda rol oynayan hücrelerin yeniden şekillenmesine neden olabilir.

Kardiyak otonom sinir sisteminin histolojik yapısı ve işlevi için çok miktarda veri olmasına rağmen, sağlık ve hastalıktaki moleküler biyolojik mimarisi birçok açıdan hala gizemlidir. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi yeni teknolojiler, dokuların tek hücreli çözünürlükte genetik karakterizasyonu için umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, nispeten büyük nöron boyutu, bu tekniklerin standartlaştırılmış kullanımını engelleyebilir. Burada, bu protokol, sağlık ve hastalıkta kardiyak sempatik nöronların biyolojik mimarisini karakterize etmek için bir yöntem olan damlacık bazlı tek çekirdekli RNA dizilimini (snRNA-seq) kullanır. Yetişkin farelerden disseke edilen bilateral superior servikal (SCG) ve stellat ganglionların (StG) snRNA-sekik'ini gerçekleştirmek için kademeli bir yaklaşım gösterilmiştir.

Bu yöntem, birden fazla bireyden/deneyden alınan örneklerin kısa bir süre içinde bir kerede toplanamadığı durumlarda yeterli RNA kalitesini koruyarak uzun süreli numune muhafazasını sağlar. Çekirdeklerin hashtag oligolarla (HTO'lar) barkodlanması, çoklamanın giderilmesini ve dizileme sonrası farklı gangliyonik örneklerin geri izlenmesini sağlar. Daha sonraki analizler, snRNA-seq tarafından doğrulandığı gibi, sempatik ganglionların nöronal, uydu glial ve endotel hücrelerinin başarılı çekirdek yakalamasını ortaya koydu. Özetle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak gangliyonların snRNA-seksi için, diğer organ ve dokuların innervasyonu çalışmalarında daha geniş uygulama potansiyeline sahip bir yöntem olan kademeli bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Otonom sinir sistemi (ANS), çevresel koşullara ve patolojiye adaptasyon da dahil olmak üzere vücut homeostazını koruyan periferik sinir sisteminin çok önemli bir parçasıdır¹. Kardiyovasküler, solunum, sindirim ve endokrin sistemler gibi vücuttaki çoklu organ sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar. ANS sempatik ve parasempatik dallara ayrılmıştır. Sempatik sinir sisteminin spinal dalları, sempatik zincirin ganglionlarında, iki taraflı olarak paravertebral pozisyonda bulunan sinapstır. İki taraflı servikal ve torasik ganglionlar, özellikle StG, kardiyak sempatik innervasyona katılan önemli bileşenlerdir. Kardiyak iskemi gibi hastalık durumlarında, nöronal yeniden yapılanma meydana gelebilir ve bu da sempatik bir aşırı hızlanma^ile sonuçlanır 2. Nöronal yeniden yapılanma, insanlarda ve diğer bazı hayvan türlerinde 3,4,5,6 yapılan birçok histolojik çalışmada gösterilmiştir. Kardiyak sempatik gangliyonlarda kardiyak iskemiye bağlı nöronal remodellemenin ayrıntılı bir biyolojik karakterizasyonu şu anda eksiktir ve kardiyak sempatik sinir sistemi (SNS) içindeki özelleşmiş nöronal hücre tiplerinin veya alt tiplerinin temel biyolojik özellikleri sağlık ve hastalıkta henüz tam olarak belirlenmemiştir⁷.

ScRNA-seq gibi yeni teknolojiler, küçük dokuların tek hücre seviyesinde^genetik karakterizasyonu için kapılar açmıştır ^8,9. Bununla birlikte, nöronların nispeten büyük boyutu, bu tek hücreli tekniklerin insanlarda optimize edilmiş kullanımını engelleyebilir¹⁰. Ek olarak, tek hücreli dizileme, sıralama işlemindeki yüksek bir kayıp nedeniyle yeterli bir hücre sayısını geri kazanmak için yüksek verimli bir hücre gerektirir. Bu, bir seansta yakalanması zor olan ve dizileme için yeterli tek hücreyi tanıtmak için birden fazla örnek gerektiren küçük dokuları incelerken zor olabilir. Yakın zamanda geliştirilen damlacık bazlı snRNA-seq teknolojisi (yani, 10x Krom platformu), tek çekirdekler arasındaki biyolojik farklılıkların incelenmesine izin verir^11,12. snRNA-seq, Emülsiyonlarda (GEM'ler) Jel Boncuk'ta yakalanamayan büyük hücreler (>30 μm) için scRNA-seq'e göre bir avantaja sahiptir, ayrıca kapsamlı ayrışma ve / veya uzun süreli koruma ile gelişmiş uyumluluk^13,14,15.

Heterojenlik, nöronal hücrelerin sayısı ve kardiyak SNS'de zenginleştirilmiş diğer hücreler, sağlık ve hastalık durumlarında ANS'nin karakterizasyonu için önemli hususlardır. Ek olarak, her sempatik ganglionun organa veya bölgeye özgü innervasyonu, SNS'nin karmaşıklığına katkıda bulunur. Ayrıca, sempatik zincirin servikal, stellat ve torasik ganglionlarının kalbin farklı bölgelerini innerve ettiği gösterilmiştir¹⁶. Bu nedenle, biyolojik mimarilerini incelemek için bireysel ganglionlardan türetilen gangliyonik hücrelerin tek çekirdekli analizini yapmak gerekir.

Damlacık bazlı snRNA-seq, plaka tabanlı dizileme platformlarından daha düşük maliyetlerle aynı anda birden fazla numuneden binlerce hücreden oluşan bir havuz için transkriptom çapında ekspresyon profillemesine izin verir. Bu yaklaşım, damlacık bazlı snRNA-sek'in hücresel fenotip sınıflandırması ve SCG ve StG içindeki hücrelerin yeni alt popülasyon tanımlaması için daha uygun olmasını sağlar. özellikle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak ganglionların tanımlanması, izolasyonu ve tek çekirdekli RNA dizilimi için kısa ve kademeli bir yaklaşım sağlar; bu, diğer ilgili organ ve dokuları innerve eden ganglionların karakterizasyonu çalışmalarında geniş bir uygulama potansiyeline sahip bir yöntemdir. sağlık ve hastalık.

Protokol

Bu protokol, murin servikal ve / veya servikotorasik (stellat) gangliyonların snRNA-seksi için gerekli tüm adımları açıklar. Dişi ve erkek C57BL/6J fareler (15 haftalık, her cinsiyet için n=2) kullanıldı. Ek bir Wnt1-Cre; mT / mG fare, ganglionları diseksiyon amacıyla görselleştirmek için kullanıldı^17,18. Bu ek fare, bir B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J fare ve bir B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J farenin melezlenmesiyle oluşturuldu. Tüm hayvan deneyleri, NIH tarafından yayınlanan ve Leiden Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirilmiştir (Lisans numarası AVD1160020185325, Leiden, Hollanda). Protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar, yazılımlar ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Hazırlıklar

NOT: Tüm adımlar bir hücre kültürü akış kabininde gerçekleştirilir.

1. Forseps ve makasları, aletleri 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak temizleyin.
2. B-27 artı (1x), L-glutamin (2 mM) ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik ile desteklenmiş Nörobazal Ortamdan oluşan ganglion ortamını hazırlayın. Ganglion ortamını oda sıcaklığında önceden ısıtın.
3. Sindirim çözeltisini hazırlayın:% 0.25 Tripsin-EDTA (1: 1) ve gangliyon ortamında çözünmüş 1.400 U / mL kollajenaz tip 2.
4. Çekirdek izolasyonu için taze, soğuk (4 °C) hücre yıkama tamponu (%0,4 sığır serum albümini [BSA]) ve lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ve %0,1 iyonik olmayan deterjan, nükleaz içermeyen suda 40 U/mL RNAse) hazırlayın.
5. Çekirdek yıkama tamponu hazırlayın (%2.0 BSA ve 0.2U/μL RNaz İnhibitörü ile 1x fosfat tamponlu salin [PBS]).
6. ST boyama tamponunu (ST-SB) hazırlayın (nükleaz içermeyen suda 10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl,₂₁ mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, %₂ BSA, %0,02 Ara-20).

2. Yetişkin fare superior servikal ganglionların (SCG) diseksiyonu

1. Fareleri ötenazi yapın ve buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu çalışmada, toplam 4 C57BL6/J faresi CO₂ boğulması ile ötenazi yapılmıştır. Alternatif olarak, izofluran, diğer çalışma amaçları için büyük miktarda kan toplanması gerektiğinde ekssanguinasyon ile takip edilebilir.
2. Fareyi pimlerle bir diseksiyon panosuna sabitleyin ve kürk dağılımını en aza indirmek için% 70 etanol ile doldurun (tıraş gerekli değildir).
3. Bir stereomikroskop altında, makasla orta hat kesimi yaparak boyun bölgesinin derisini açın, submandibuler bezleri bir kenara taşıyın ve ortak karotis arteri ve çatallanmasını ortaya çıkarmak ve bulmak için sternomastoid kası çıkarın (Şekil 1A, B, oka bakınız).
4. Sağ ve sol karotis arter bifurkasyonunu ve ona bağlı dokuyu diseke edin. Her disseke edilmiş doku parçasını soğuk PBS içeren ayrı bir 3,5 cm Petri kabına aktarın.
5. Karotis bifurkasyonuna bağlı SCG'yi arayın. Petri kabındaki arteri ve diğer bağlı dokuları çıkararak SCG'yi daha da temizleyin (Şekil 1E).

3. Yetişkin fare yıldız ganglionlarının (StG) diseksiyonu

1. StG'yi diseke etmek için, karında bir orta hat kesimi yapın, ardından diyaframı ve ventral torasik duvarı açın.
2. Dorsal toraksı ortaya çıkarmak için kalbi ve akciğerleri çıkarın. İlk kaburga seviyesindeki musculus colli longus'a (MCL) sol ve sağ StG anterolateral olanı arayın (Şekil 1C, D, kesikli çizgilerle gösterilir).
3. Forseps ile hem sol hem de sağ StG'yi disseke edin ve ayrı ayrı soğuk PBS içeren 3,5 cm Petri kaplarına aktarın (Şekil 1F).
   ​

4. Fare gangliyonik hücrelerinin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu

4-6 arası adımlar Şekil 2'de özetlenmiştir.

1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini forseps ile ayırmak için tüm bireysel SCG ve StG'yi dikkatlice aktarın.
   NOT: Ganglionları aktarmak için pipet uçlarını kullanmayın, çünkü ganglionlar plastik pipet uçlarının duvarına yapışmaya eğilimlidir.
2. Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin.
   NOT: Bu adım, bundan sonra kollajenaz tip 2 çözeltisinde sindirimi ve hücre salınımını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
3. Her numune için 5 mL ganglion ortamı içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın. Ganglionların mikrosantrifüj tüplerinin dibine yerleşmesine izin verin. Çok az gangliyonik hücre içeren süpernatanı toplayın, süpernatantı hazırlanan 15 mL tüplere aktarın ve her tüpü etiketleyin. Alternatif olarak, biraz zaman kazanmak için, tripsin-EDTA süpernatantını toplanmadan aspire edin, çünkü içinde çok az ayrışmış hücre tespit edilebilir.
   NOT: Ganglianın çıkarılmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünde az miktarda tripsin-EDTA çözeltisi (~ 10-30 μL) bırakılabilir. Bu adımda pipetlemeden kaçının, çünkü ganglionlara zarar verebilir ve daha sonra gangliyonik hücrelerin düşük çıkışına neden olabilir.
4. Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL kollajenaz tip 2 çözeltisi ekleyin ve 35-40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin. Ganglionu 35 dakika sonra askıya almaya çalışın; ganglion hala sağlamsa ve ayrışmazsa, inkübasyon süresini uzatın veya gerektiğinde kollajenaz tip 2 çözeltisinin konsantrasyonunu artırın.
   NOT: Kuluçka süresi ganglion boyutuna bağlı olarak değişebilir.
5. Gangliyonları kollajenaz çözeltisinde ~ 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek veya doku kümeleri artık tespit edilinceye kadar yeniden askıya alın.
6. Hücre süspansiyonunu, gangliyon kültür ortamını ve tripsin-EDTA süspansiyonunu aynı gangliondan içeren daha önce kullanılan 15 mL tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu sallanan kova rotorlu santrifüjle oda sıcaklığında 10 dakika, 300 × g boyunca döndürün. Hücre süpernatını dikkatlice atın.
   NOT: Gangliyonik hücreler tek bir gangliondan ayrıştığından, hücre peleti gözle tespit edilemeyecek kadar küçük olabilir; hücre peletinin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için tüpte az miktarda süpernatant bırakılabilir.
7. Gangliyonik hücreleri 270 μL fetal sığır serumunda (FBS, düşük endotoksin) yeniden askıya alın ve her hücre-FBS süspansiyonunu 1 mL kriyovyal içine aktarın.
8. Hücreleri saymak için, gangliyonik hücre süspansiyonunun 5 μL'sini% 0.4 tripan mavisi boya ile 5 μL'lik karıştırın ve karışımı bir hemositometreye yükleyin. Toplam ve canlı hücre sayılarını mikroskop altında sayın.
   NOT: Hücre canlılığı (canlı hücre sayısı / toplam hücre sayısı = canlılık), bu ayrışma protokolü ile genellikle% 90'ın üzerindedir. Tek bir ganglionun (SCG veya StG) canlı hücre sayısı, gangliyon 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 9.000-60.000 hücre aralığındadır.
9. Kriyovallerdeki her hücre-FBS süspansiyonuna 30 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin, iyice karıştırın ve kriyovyalleri oda sıcaklığında tutulan bir hücre dondurma kabına aktarın. Kriyovsal yüklü kabı gece boyunca -80 ° C'de saklayın ve dizilemeden önce uzun süre korunmak için kriyovyalleri ertesi gün sıvı nitrojene aktarın.

5. Çekirdek izolasyonu

NOT: Dört fareden izole edilen sol ve sağ SCG (toplam 8 örnek), aşağıdaki çekirdek izolasyonu ve dizileme hazırlığında örnek olarak kullanılmıştır. Tüm prosedür boyunca her şeyi buz üzerinde tutun. Küçük çekirdek peletlerinin görünmezliği nedeniyle, tüm prosedür boyunca süpernatant giderimini kolaylaştırmak için sallanan kovalara sahip bir santrifüj şiddetle tavsiye edilir.

1. Üstüne bir süzgeç (30 μm) ile 15 mL tüpler hazırlayın ve süzgeci ganglion ortamın 1 mL'si ile hazırlayın.
2. Kriyovalleri sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 ° C'de bir su banyosunda çözün. Kriyovalde küçük bir buz topağı bırakıldığında, kriyovyalleri su banyosundan çıkarın.
3. Gangliyonik hücreleri, gangliyon ortamının 1 mL'sini her kriyovyalin içine bırakarak ve elle dikkatlice sallayarak geri kazanın. İsteğe bağlı: Hücre iyileşmesini değerlendirmek için, iyileşmeden sonra hücre süspansiyonunu karıştırın ve adım 4.8'de açıklandığı gibi canlı hücre sayımı için 5 μL hücre süspansiyonu alın.
4. Her gangliyonik hücre süspansiyonunu ayrı bir süzgeç üzerine yükleyin (adım 5.1'de hazırlanmış) ve her süzgeci 4-5 mL ganglion ortamı ile durulayın.
5. Süzülmüş hücre süspansiyonunu 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 50 μL hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın.
6. Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı bir DNA / RNA 0.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
7. Hücre süspansiyonunu 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
8. Hücre peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantın 45 μL'sini çıkarın.
9. 45 μL soğutulmuş Lizis Arabelleği ekleyin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın.
10. Hücreleri buz üzerinde 8 dakika boyunca inkübe edin.
11. Her tüpe 50 μL soğuk çekirdek yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmayın.
12. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
13. Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 95 μL'sini çıkarın.
14. Pelet üzerine 45 μL soğutulmuş çekirdek yıkama tamponu ekleyin. İsteğe bağlı: 5 μL çekirdek süspansiyonu alın, saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre ile mikroskop altında çekirdeklerin kalitesini kontrol edin.
15. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
16. Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantı çıkarın.

6. Hashtag oligos (HTO'lar) ve çoklama ile çekirdek barkodlama

NOT: HTO boyama basamakları, Gaublomme ve ^ark.15 tarafından kortikal dokuda önceki uygulamaya göre çok düşük miktarlarda (ganglionik) çekirdeğin nükleer etiketlenmesi için modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir.

1. Çekirdek peletine 50 μL ST-SB tamponu ekleyin, çekirdekler tamamen yeniden askıya alınana kadar 8-10 kez hafifçe pipet çekin.
2. ST-SB / çekirdek karışımının 50 μL'si başına 5 μL Fc Bloke edici reaktif ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
3. ST-SB / çekirdek karışımının tüpü başına 1 μL (0,5 μg) tek çekirdekli hashtag antikoru ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Daha kısa inkübasyon süresi, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, hashtag etiketlemenin daha düşük verimliliğine yol açar.
4. Her tüpe 100 μL ST-SB ekleyin. Karıştırmayın.
5. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika, 600 × g santrifüj yapın.
6. Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 145 μL'sini çıkarın.
7. 6.4 ve 6.5 numaralı adımları yineleyin. Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için süpernatantı tüpün dibine dokunmadan mümkün olduğunca çıkarın.
8. Çekirdek peletini 50 μL ST-SB içinde yeniden askıya alın ve çekirdekleri yavaşça karıştırın.
9. Çekirdek süspansiyonunun 5 μL'sini alın ve çekirdekleri mikroskop altında saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Tripan mavisi ile karıştırılmış ve bir hemositometreye yüklenen çekirdeklerin temsili bir görüntüsü için Şekil 3A'ya bakınız.
10. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 600 × g'da 5 dakika santrifüj yapın.
11. Karşılık gelen çekirdek sayısına göre her numune için 1.000-3.000 nüklei/μL'lik bir hedef çekirdek konsantrasyonu elde etmek için ST-SB'deki çekirdekleri yeniden askıya alın.
12. İstenilen hücre sayısına ulaşmak için örnekleri bir araya getirin.
    NOT: Örneğin, bu deneyde, 8 örnek, hemen ardından 10x Genomik Krom ve snRNA-sek'e geçmek için toplam 25.000 çekirdeğe ulaşmak için eşit olarak bir araya getirildi. Çekirdek sayısı, ganglion 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 6.000-40.000 hücre aralığına düşer. Toplam yüklü çekirdeklerin sadece yarısı damlacık bazlı snRNA-seq ile yakalanabilir. Örneğin, daha fazla kütüphane hazırlama ve dizileme için gerekli olan 10.000 çekirdeğin yakalanmasını sağlamak için 25.000 çekirdek karışımı hazırlanmıştır.

Sonuçlar

Tek çekirdekli cDNA kütüphanesi hazırlığı ve snRNA-seq kalite kontrol analizi
Temsili sonuçlar, 25.000 okuma / çekirdek gen ekspresyon kütüphanesi ve 5.000 okuma / çekirdek hashtag kütüphanesi ile tek bir havuzda yakalanan 10.000 çekirdeğin dizileme sonuçlarını açıklamaktadır. Şekil 3B , Biyoanalizör ile kontrol edilen 1. iplik cDNA, gen ekspresyonu (GEX) kütüphanesi ve HTO kütüphanesinin kalite kontrol sonuçlarını göstermektedir^.

Tartışmalar

Burada, i) yetişkin fare üstün servikal ve sempatik gangliyonlarının diseksiyonu, ii) gangliyonik hücrelerin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu, iii) çekirdek izolasyonu ve iv) çoklama amacıyla HTO etiketleme ile nükleus barkodlaması ve snRNA-sek konularına odaklanan ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Bu protokolle, yaygın olarak kullanılan tripsin ve kollajenaz kullanılarak bireysel gangliyonların ayrıştırılmasıyla sempatik gangliyonik hücreler kolayca elde edil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0.4% trypan blue dye	Bio-Rad	1450021
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Collagenase type 2	Worthington	LS004176	use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	67685
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)	Biowest	S1810-500
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)	Sigma-Aldrich	74385	Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)	Invitrogen	AM9937	Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)	Invitrogen	AM9937	ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20	Merck Millipore	822184	ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody	Biolegend	682205	Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody	Biolegend	682207	Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody	Biolegend	682209	Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody	Biolegend	682225	Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody	Biolegend	682227	Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody	Biolegend	682229	Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody	Biolegend	682231	Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody	Biolegend	682233	Hashtag antibody
TruStain FcX (human)	Biolegend	422302	FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer	Merck	Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38	Eppendorf	EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish	Corning	351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Fine science tools	11252-40
Hardened Fine Scissors	Fine science tools	14091-09
Ice Pan, rectangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Leica		Microscope
Moria MC50 Scissors	Fine science tools	15370-50
Noyes Spring Scissors	Fine science tools	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Olympus		Microscope
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Preseparation Filters (30 µm)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath	GFL	1083
Silicon plate	RubberBV	3530	Dissection board
Software and packages
Cell ranger	V4.0.0
R programming	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #007576
C57BL/6J mice	Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE