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요약

이 프로토콜은 우수한 자궁경부 및 성상 신경절, 세포 해리, 동결보존, 핵 분리 및 해시태그 바코딩을 포함하는 단일 핵 시퀀싱을 위한 상세하고 낮은 입력 샘플 준비를 설명합니다.

초록

심장 자율 신경계는 심박수 및 심장 수축과 같은 심장 기능을 제어하는 데 중요하며 교감 신경과 부교감 신경 가지로 나뉩니다. 일반적으로 항상성을 유지하기 위해이 두 가지 사이에는 균형이 있습니다. 그러나 심근 경색, 심부전 및 고혈압과 같은 심장 질환 상태는 불리한 임상 결과와 관련된 심장 신경 과민에 관여하는 세포의 리모델링을 유도 할 수 있습니다.

심장 자율 신경계의 조직 학적 구조와 기능에 대한 방대한 양의 데이터가 있지만, 건강과 질병에서의 분자 생물학적 구조는 여전히 많은 측면에서 수수께끼입니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)과 같은 새로운 기술은 단일 세포 분해능에서 조직의 유전 적 특성화에 대한 약속을 지닙니다. 그러나, 상대적으로 큰 크기의 뉴런은 이들 기술의 표준화된 사용을 방해할 수 있다. 여기서, 이 프로토콜은 건강 및 질병에서 심장 교감 신경세포의 생물학적 구조를 특성화하는 방법인 액적 기반 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 이용한다. 단계적 접근법이 성인 마우스로부터 해부된 양측 우월한 자궁경부(SCG) 및 성상 신경절(StG)의 snRNA-seq를 수행하는 것으로 입증된다.

이 방법은 장기간 시료 보존을 가능하게 하여 단기간 내에 여러 개인/실험의 샘플을 한꺼번에 수집할 수 없을 때 적절한 RNA 품질을 유지합니다. 해시태그 올리고(HTO)로 핵을 바코딩하면 역다중화 및 시퀀싱 후 별개의 신경절 샘플의 추적이 가능합니다. 후속 분석은 snRNA-seq에 의해 검증 된 교감 신경절의 신경, 위성 신경교 및 내피 세포의 성공적인 핵 포획을 밝혀 냈습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 교감신경성 외인성 심장 신경절의 snRNA-seq 에 대한 단계적 접근법을 제공하며, 이는 다른 기관 및 조직의 신경과민에 대한 연구에서 보다 광범위하게 응용될 수 있는 잠재력을 갖는 방법이다.

서문

자율 신경계 (ANS)는 환경 조건 및 병리학에 대한 적응을 포함하여 신체 항상성을 유지하는 말초 신경계의 중요한 부분입니다1. 그것은 심혈관, 호흡기, 소화 및 내분비 시스템과 같은 신체 전체의 여러 장기 시스템의 조절에 관여합니다. ANS는 교감 신경과 부교감 신경으로 나뉩니다. 교감 신경계의 척추 분지는 교감 신경절의 신경절에서 시냅스, 부추 동맥 위치에 양측으로 위치. 양측 자궁 경부 및 흉부 신경절, 특히 StG는 심장 교감 신경에 참여하는 중요한 구성 요소입니다. 심장 허혈과 같은 질병 상태에서, 뉴런 리모델링이 발생할 수 있고, 교감신경성 과잉구동(sympathetic overdrive)을 초래한다2. 뉴런 리모델링은 인간 및 몇몇 다른 동물 종 3,4,5,6에서 다수의 조직학적 연구에서 입증되었다. 심장 교감신경절에서 심장 허혈 유발 뉴런 리모델링의 상세한 생물학적 특성화는 현재 결여되어 있으며, 심장 교감신경계(SNS) 내의 특수화된 뉴런 세포 유형 또는 아형의 근본적인 생물학적 특성은 건강 및 질환에서 아직 완전히 결정되지 않았다7.

scRNA-seq와 같은 새로운 기술은 단일 세포 수준 8,9에서 작은 조직의 유전 적 특성화를위한 게이트웨이를 열었습니다. 그러나, 비교적 큰 크기의 뉴런은 인간(10)에서 이러한 단세포 기술의 최적화된 사용을 방해할 수 있다. 또한, 단일 세포 시퀀싱은 시퀀싱 과정에서 높은 손실로 인해 충분한 세포 수를 회수하기 위해 높은 처리량의 세포를 필요로 한다. 이것은 한 세션에서 포착하기 어렵고 시퀀싱을 위해 충분한 단일 세포를 도입하기 위해 여러 샘플이 필요한 작은 조직을 연구 할 때 어려울 수 있습니다. 최근에 개발된 액적 기반 snRNA-seq 기술(즉, 10x 크롬 플랫폼)은 단일 핵11,12 사이의 생물학적 차이에 대한 연구를 가능하게 한다. snRNA-seq 는 에멀젼 (GEMs)의 겔 비드에서 포획되지 않을 수 있는 큰 세포 (>30 μm)에 대한 scRNA-seq 보다 유리할 뿐만 아니라 광범위한 해리 및/또는 연장된 보존과의 향상된 상용성13,14,15를 보유한다.

이질성, 신경 세포의 수, 및 심장 SNS에 풍부해진 다른 세포는 건강 및 질병 상태에서 ANS의 특성화를 위한 중요한 측면이다. 또한, 각 교감신경절에 의한 기관 또는 부위별 신경과민은 SNS의 복잡성에 기여한다. 더욱이, 교감 신경계의 자궁 경부, 별자리 및 흉부 신경절은 심장의 다른 영역(16)을 신경질적으로 하는 것으로 나타났다. 따라서, 그들의 생물학적 구조를 연구하기 위해 개별 신경절로부터 유래된 신경절 세포의 단핵 분석을 수행할 필요가 있다.

액적-기반 snRNA-seq 는 플레이트 기반 시퀀싱 플랫폼보다 저렴한 비용으로 한 번에 여러 샘플로부터 수천 개의 세포 풀에 대한 전사체 전체 발현 프로파일링을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 액적 기반 snRNA-seq 가 SCG 및 StG 내의 세포의 세포 표현형 분류 및 새로운 하위집단 확인에 더 적합할 수 있게 한다. 주목할 만하게, 이 프로토콜은 교감신경 외인성 심장 신경절의 식별, 분리 및 단핵 RNA 시퀀싱을 위한 간결한 단계적 접근법을 제공하며, 이는 다른 관련 기관 및 조직을 신경과민하는 신경절의 특성화에 대한 연구에서 광범위한 응용을 위한 잠재력을 갖는 방법이다. 건강과 질병.

프로토콜

이 프로토콜은 뮤린 자궁 경부 및 / 또는 자궁 경부 흉부 (스텔레이트) 신경절의 snRNA-seq에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 암컷 및 수컷 C57BL/6J 마우스(15주령, 각 성별에 대해 n=2)를 사용하였다. 1개의 추가적인 Wnt1-Cre;mT/mG 마우스가 해부 목적을 위해 신경절을 시각화하는데 사용되었다(17,18). 이 추가 마우스는 B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 마우스와 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 마우스의 교배에 의해 생성되었다. 모든 동물 실험은 NIH가 발표하고 라이덴 대학의 동물 윤리위원회 (라이센스 번호 AVD1160020185325, Leiden, 네덜란드)의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.

1. 준비

주: 모든 단계는 세포 배양 흐름 캐비닛에서 수행됩니다.

  1. 기구를 70% 에탄올에 20분 동안 담가 포셉과 가위를 청소합니다.
  2. B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) 및 1 % 항생제 - Antimycotic으로 보충 된 Neurobasal Medium으로 구성된 신경절 배지를 준비하십시오. 실온에서 신경절 배지를 미리 따뜻하게하십시오.
  3. 소화액을 준비하십시오: 신경절 배지에 용해된 0.25% 트립신-EDTA(1:1) 및 1,400 U/mL 콜라게나제 타입 2.
  4. 핵 분리를 위해 신선하고 차가운 (4°C) 세포 세척 완충액 (0.4% 소 혈청 알부민 [BSA]) 및 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl2, 3 mMMgCl2 및 0.1% 비이온성 세제, 뉴클레아제가 없는 물에서 40 U/mL RNAse)을 준비한다.
  5. 핵 세척 완충액(2.0% BSA 및 0.2U/μL RNase 억제제가 있는 1x 인산염 완충 식염수[PBS])을 준비합니다.
  6. ST 염색 완충액 (ST-SB) (뉴클레아제 비함유 물에서 10 mM 트리스-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mMCaCl2, 2% BSA, 0.02% 트윈-20)을 제조하였다.

2. 성인 마우스 우수한 자궁 경부 신경절 (SCG)의 해부

  1. 생쥐를 안락사시키고 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 현재 연구에서, 총 4마리의 C57BL6/J 마우스가CO2 질식에 의해 안락사되었다. 대안으로, 이소플루란은 다른 연구 목적을 위해 다량의 혈액을 채취해야 할 때 삼출 후 사용될 수 있다.
  2. 핀이있는 해부 보드에 마우스를 고정하고 모피의 분산을 최소화하기 위해 70 % 에탄올로 도사용하십시오 (면도는 필요하지 않음).
  3. 입체 현미경으로 가위로 중간 선을 자르고 턱밑 땀샘을 옆으로 움직여 목 부위의 피부를 열고 스테로이드 근육을 제거하여 일반적인 경동맥과 그 분기를 노출시키고 찾습니다 (그림 1A, B, 화살표 참조).
  4. 오른쪽과 왼쪽 경동맥 분기와 그것에 부착 된 조직을 해부하십시오. 해부된 각 조직 조각을 차가운 PBS를 함유하는 분리된 3.5 cm 페트리 접시에 옮긴다.
  5. 경동맥 분기에 부착된 SCG를 찾으십시오. SCG를 페트리 접시에서 동맥 및 다른 부착 조직을 제거하여 추가로 청소한다(도 1E).

3. 성인 마우스 별자리 신경절 (StG)의 해부

  1. StG를 해부하려면 복부에서 중간 선을 자른 다음 횡격막과 복부 흉부 벽을 엽니 다.
  2. 심장과 폐를 제거하여 등쪽 흉부를 노출시킵니다. 첫 번째 리브의 수준에서 근육 콜리 경도 (MCL)에 대한 왼쪽 및 오른쪽 StG 전측성을 찾습니다 (그림 1C, D, 파선으로 표시).
  3. 포셉으로 왼쪽 및 오른쪽 StG를 모두 해부하고 차가운 PBS가 들어 있는 3.5cm 페트리 접시에 별도로 옮깁니다(그림 1F).
    ​

4. 마우스 신경절 세포의 분리 및 냉동 보존

단계 4-6은 도 2에 요약되어 있다.

  1. 모든 개별 SCG 및 StG를 조심스럽게 옮겨 포셉으로 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 분리합니다.
    참고 : 신경절이 플라스틱 피펫 팁의 벽에 부착되기 쉽기 때문에 피펫 팁을 사용하여 신경절을 옮기지 마십시오.
  2. 500 μL의 0.25% 트립신-EDTA 용액을 각각의 미세원심분리 튜브에 첨가하고, 37°C의 진탕 수조에서 40분 동안 인큐베이션한다.
    참고: 이 단계는 콜라게나제 타입 2 용액에서 이후 소화 및 세포 방출을 촉진하기 위한 것이다.
  3. 각 샘플에 대해 5 mL의 신경절 배지를 함유하는 15 mL 튜브를 제조하였다. 신경절이 마이크로 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록하십시오. 극소수의 신경절 이온성 세포를 포함하는 상청액을 수집하고, 상청액을 준비된 15 mL 튜브로 옮기고, 각 튜브에 라벨을 붙인다. 대안적으로, 약간의 시간을 절약하기 위해, 극소수의 해리된 세포가 그것에서 검출될 수 있기 때문에 트립신-EDTA 상청액을 수집하지 않고 흡인한다.
    참고 : 신경절의 제거를 피하기 위해 소량의 트립신 - EDTA 용액 (~ 10-30 μL)을 마이크로 원심분리 튜브에 남겨 둘 수 있습니다. 이 단계에서 피펫팅은 신경절을 손상시키고 나중에 신경절 세포의 낮은 출력을 초래할 수 있기 때문에 피펫팅을 피하십시오.
  4. 500 μL의 콜라게나제 타입 2 용액을 각각의 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 35-40분 동안 37°C의 진탕 수조에서 인큐베이션한다. 35 분 후에 신경절을 다시 일시 중지하십시오. 신경절이 여전히 손상되지 않고 해리되지 않으면 배양 시간을 연장하거나 필요에 따라 콜라게나제 유형 2 용액의 농도를 증가시킵니다.
    참고 : 잠복기 시간은 신경절 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
  5. 콜라게나제 용액에 신경절을 ~10회 위아래로 피펫팅하거나 조직 덩어리가 더 이상 검출되지 않을 때까지 재현탁시킨다.
  6. 세포 현탁액을 동일한 신경절로부터 신경절 배양 배지 및 트립신-EDTA 현탁액이 들어있는 이전에 사용된 15 mL 튜브로 옮긴다. 세포 현탁액을 스윙 버킷 로터 원심분리기로 10분 동안 스핀다운하고, 실온에서 300 × g 을 스핀다운한다. 세포 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    참고 : 신경절 이온성 세포는 단일 신경절에서 해리되기 때문에 세포 펠릿이 너무 작아서 눈으로 감지 할 수 없습니다. 소량의 상층액은 세포 펠릿의 우발적 인 제거를 피하기 위해 튜브에 남아있을 수 있습니다.
  7. 신경절이온성 세포를 270 μL의 소 태아 혈청 (FBS, 저 내독소)에 재현탁시키고, 각 세포-FBS 현탁액을 1 mL 동결 내로 옮긴다.
  8. 세포를 계수하기 위해, 5 μL의 신경절이온성 세포 현탁액을 5 μL의 0.4% 트리판 블루 염료와 혼합하고, 혼합물을 혈구측정기에 로딩한다. 현미경으로 전체 및 라이브 셀 수를 계산하십시오.
    참고: 세포 생존력(살아있는 세포 수/총 세포 수 = 생존력%)은 일반적으로 이 해리 프로토콜에서 90% 이상입니다. 단일 신경절 (SCG 또는 StG)의 살아있는 세포 수는 신경절이 12 주에서 16 주 사이에 된 마우스에서 분리 될 때 일반적으로 9,000-60,000 세포 범위 내에 속합니다.
  9. 30 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각각의 세포-FBS 현탁액에 첨가하고, 잘 혼합하고, cryovials를 실온에서 유지되는 세포 동결 용기로 옮긴다. 냉동 로딩된 용기를 하룻밤 동안 -80°C에서 보관하고, 시퀀싱 전에 장시간 보존을 위해 다음날 냉동 액체를 액체 질소로 옮긴다.

5. 핵 분리

참고: 네 마리의 마우스(총 8개의 샘플에서)로부터 분리된 좌측 및 우측 SCG를 다음의 핵 분리 및 시퀀싱 제제에서 예로서 사용하였다. 전체 절차 중에 모든 것을 얼음 위에 보관하십시오. 작은 핵 펠릿이 보이지 않기 때문에 전체 절차 전반에 걸쳐 상층액 제거를 용이하게하기 위해 스윙 버킷이있는 원심 분리기를 적극 권장합니다.

  1. 위에 스트레이너 (30 μm)가있는 15 mL 튜브를 준비하고 1 mL의 신경절 배지로 스트레이너를 미리 헹구십시오.
  2. 액체 질소로부터 cryovials를 꺼내고 즉시 37 °C의 수조에서 해동시킨다. 작은 얼음 알갱이가 냉동 장치에 남아 있으면 냉동 장치를 수조에서 꺼내십시오.
  3. 신경절 배지 1 mL를 각 냉동 상태로 떨어뜨리면서 손으로 조심스럽게 흔들면서 신경절 세포를 회수한다. 선택사항: 세포 회복을 평가하기 위해, 회수 후 세포 현탁액을 혼합하고, 단계 4.8에 기재된 바와 같이, 살아있는 세포 계수를 위해 5 μL의 세포 현탁액을 취한다.
  4. 각 신경절이온성 세포 현탁액을 별도의 스트레이너(단계 5.1에서 제조)에 로딩하고 각 스트레이너를 4-5 mL의 신경절 배지로 헹구십시오.
  5. 변형된 세포 현탁액을 300 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포를 50 μL의 세포 세척 완충액에 재현탁시켰다.
  6. 세포 현탁액을 저결합 DNA/RNA 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.
  7. 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
  8. 세포 펠릿이 이탈되는 것을 피하기 위해 튜브의 바닥에 닿지 않고 상청액 45 μL를 제거하십시오.
  9. 45μL의 냉각된 용해 버퍼를 첨가하고 200μL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫을 만듭니다.
  10. 세포를 얼음 위에서 8분 동안 인큐베이션한다.
  11. 50 μL의 차가운 핵 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하십시오. 혼합하지 마십시오.
  12. 핵 현탁액을 4°C에서 5분 동안 600 × g 에서 원심분리한다.
  13. 핵 펠릿을 파괴하지 않고 95 μL의 상청액을 제거한다.
  14. 냉각된 핵 세척 완충액 45 μL를 펠렛에 첨가한다. 선택 사항: 5 μL의 핵 현탁액을 취하고, 0.4% 트리판 블루의 5 μL와 혼합하여 계수하고, 혈구계로 현미경으로 핵의 품질을 점검하십시오.
  15. 핵 현탁액을 4°C에서 5분 동안 600 × g 에서 원심분리한다.
  16. 핵 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥을 만지지 않고 상층액을 제거하십시오.

6. 해시태그 올리고(HTO)를 사용한 핵 바코딩 및 멀티플렉싱

참고: HTO 염색 단계는 Gaublomme et al.15에 의해 피질 조직에서의 이전 적용에 따라 매우 낮은 양의 (신경절성) 핵의 핵 표지를 위해 변형되고 최적화되었다.

  1. 50 μL의 ST-SB 완충액을 핵 펠릿에 첨가하고, 핵이 완전히 재현탁될 때까지 부드럽게 피펫을 8-10회 첨가한다.
  2. ST-SB/핵 믹스 50μL당 5μL의 Fc 블로킹 시약을 첨가하고, 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션한다.
  3. ST-SB/핵 믹스의 튜브 당 1 μL (0.5 μg)의 단일 핵 해시태그 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    참고 : 인큐베이션 시간이 짧아지면 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 해시 태그 라벨링의 효율성이 낮아집니다.
  4. 100 μL의 ST-SB를 각 튜브에 첨가한다. 혼합하지 마십시오.
  5. 핵 현탁액을 4°C에서 5분, 600 × g 동안 원심분리한다.
  6. 핵 펠릿을 파괴하지 않고 상청액 145 μL를 제거한다.
  7. 6.4단계와 6.5단계를 반복합니다. 핵 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥에 닿지 않고 가능한 한 상층액을 제거하십시오.
  8. 핵 펠릿을 50 μL의 ST-SB에 재현탁시키고, 핵을 부드럽게 혼합한다.
  9. 핵 현탁액 5 μL를 취하여 0.4% 트리판 블루의 5 μL와 혼합하여 현미경으로 핵을 계수한다. 트리판 블루와 혼합되고 혈구측정기에 로딩된 핵의 대표적인 이미지에 대해서는 도 3A 를 참조한다.
  10. 핵 현탁액을 4°C에서 600 × g 에서 5분 동안 원심분리한다.
  11. ST-SB에 핵을 재현탁하여 해당 핵 수에 따라 각 샘플에 대해 1,000-3,000 핵/μL의 표적 핵 농도를 달성하십시오.
  12. 원하는 수의 셀을 얻기 위해 샘플을 풀링합니다.
    참고: 예를 들어, 이 실험에서, 8개의 샘플을 동등하게 풀링하여 총 25,000개의 핵을 달성하여 10x 게놈 크롬 및 snRNA-seq 후 즉시 진행하였다. 핵 수는 신경절이 12 주에서 16 주 사이에 된 마우스에서 분리 될 때 일반적으로 6,000-40,000 세포의 범위에 속합니다. 총 로딩된 핵의 약 절반만이 액적-기반 snRNA-seq에 의해 포획될 수 있다. 예를 들어, 10,000개의 핵의 포획을 보장하기 위해 25,000개의 핵 혼합물이 준비되었으며, 이는 추가적인 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 필요하다.

결과

단핵 cDNA 라이브러리 제제 및 snRNA-seq의 품질관리 분석
대표적인 결과는 25,000개의 판독/핵 유전자 발현 라이브러리와 5,000개의 판독/핵 해시태그 라이브러리가 있는 단일 풀에서 10,000개의 포획된 핵의 시퀀싱 결과를 설명합니다. 도 3B 는 Bioanalyzer로 체크한1st 가닥 cDNA, 유전자 발현(GEX) 라이브러리, 및 HTO 라이브러리의 품질 관리 결과를 도시한다. HTO 유?...

토론

여기서, 상세한 프로토콜은 i) 우수한 자궁경부 및 성상 교감신경절의 해부, ii) 신경절이온성 세포의 분리 및 동결보존, iii) 핵 단리, 및 iv) 핵-다중화 목적을 위한 HTO 표지를 이용한 바코딩 및 snRNA-seq에 초점을 맞추는 것을 기술한다.

이 프로토콜로, 교감 신경절 이온성 세포는 일반적으로 사용되는 트립신과 콜라게나제를 사용하여 개별 신경절을 해리시킴으로써 쉽게 얻을 수...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, the Netherlands)에게 실험 설계 및 유용한 토론에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 Emile J. de Meijer (인간 유전학과, LUMC, Leiden, 네덜란드)에게 단일 핵 RNA 분리 및 시퀀싱을위한 라이브러리 준비에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 네덜란드 과학 연구기구 (NWO) [016.196.346 ~ M.R.M.J.]의 지원을 받습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0.4% trypan blue dyeBio-Rad1450021
Antibiotic-AntimycoticGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Collagenase type 2WorthingtonLS004176use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich67685
Ethanol absolute ≥99.5%VWRVWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)BiowestS1810-500
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLCell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)Sigma-Aldrich74385Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)InvitrogenAM9937Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma-Aldrich59222CNucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLNucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)InvitrogenAM9937ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5MSigma-Aldrich59222CST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 AntibodyBiolegend682205Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 AntibodyBiolegend682207Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 AntibodyBiolegend682209Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 AntibodyBiolegend682225Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 AntibodyBiolegend682227Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 AntibodyBiolegend682229Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 AntibodyBiolegend682231Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 AntibodyBiolegend682233Hashtag antibody
TruStain FcX (human)Biolegend422302FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line HemacytometerMerckZ359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38Eppendorf EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing ContainerCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tubeEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dishCorning351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific10773501
Forceps Dumont #5Fine science tools11252-40
Hardened Fine ScissorsFine science tools14091-09
 Ice Pan, rectangular 4 L OrangeCorningCLS432106-1EA
Leica MS5LeicaMicroscope
Moria MC50 ScissorsFine science tools15370-50
Noyes Spring ScissorsFine science tools15012-12
Olympus CK2 ULWCDOlympusMicroscope
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
Preseparation Filters (30 µm)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Shaking water bathGFL1083
Silicon plateRubberBV3530Dissection board
Software and packages
Cell rangerV4.0.0
R programmingV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouseThe Jackson LaboratoryJAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouseThe Jackson LaboratoryJAX stock #007576
C57BL/6J miceCharles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

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