Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte, inputarme Probenvorbereitung für die Einzelkernsequenzierung, einschließlich der Dissektion von Maus-Superior-Cervix- und Sternganglien, Zelldissoziation, Kryokonservierung, Nukleusisolierung und Hashtag-Barcoding.

Zusammenfassung

Das kardiale autonome Nervensystem ist entscheidend für die Kontrolle der Herzfunktion wie Herzfrequenz und Herzkontraktilität und ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Normalerweise gibt es ein Gleichgewicht zwischen diesen beiden Zweigen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Herzerkrankungen wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz und Bluthochdruck können jedoch den Umbau von Zellen induzieren, die an der Herzinnervation beteiligt sind, was mit einem nachteiligen klinischen Ergebnis verbunden ist.

Obwohl es riesige Datenmengen für die histologische Struktur und Funktion des kardialen autonomen Nervensystems gibt, ist seine molekularbiologische Architektur in Gesundheit und Krankheit in vielerlei Hinsicht immer noch rätselhaft. Neuartige Technologien wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) versprechen die genetische Charakterisierung von Geweben bei Einzelzellauflösung. Die relativ große Größe der Neuronen kann jedoch die standardisierte Verwendung dieser Techniken behindern. Hier nutzt dieses Protokoll die tröpfchenbasierte Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), eine Methode zur Charakterisierung der biologischen Architektur von kardialen sympathischen Neuronen in Gesundheit und Krankheit. Es wird gezeigt, dass ein schrittweiser Ansatz snRNA-seq der bilateralen oberen zervikalen (SCG) und stellaten Ganglien (StG) durchführt, die von erwachsenen Mäusen seziert wurden.

Diese Methode ermöglicht eine langfristige Probenkonservierung und hält eine angemessene RNA-Qualität aufrecht, wenn Proben von mehreren Individuen / Experimenten nicht innerhalb kurzer Zeit auf einmal gesammelt werden können. Die Barkodierung der Kerne mit Hashtag-Oligos (HTOs) ermöglicht das Demultiplexing und die Rückverfolgung verschiedener ganglionärer Proben nach der Sequenzierung. Nachfolgende Analysen zeigten eine erfolgreiche Kernerfassung von neuronalen, satellitengestützten Glia- und Endothelzellen der sympathischen Ganglien, wie durch snRNA-seq validiert. Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen schrittweisen Ansatz für snRNA-seq von sympathischen extrinsischen Herzganglien, eine Methode, die das Potenzial für eine breitere Anwendung in Studien der Innervation anderer Organe und Gewebe hat.

Einleitung

Das autonome Nervensystem (ANS) ist ein entscheidender Teil des peripheren Nervensystems, das die Homöostase des Körpers aufrechterhält, einschließlich der Anpassung an Umweltbedingungen und Pathologie¹. Es ist an der Regulierung mehrerer Organsysteme im ganzen Körper beteiligt, wie z. B. des Herz-Kreislauf-, Atemwegs-, Verdauungs- und endokrinen Systems. Die ANS ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Spinaläste der Synapse des sympathischen Nervensystems in Ganglien der sympathischen Kette, bilateral in einer paravertebralen Position gelegen. Die bilateralen Hals- und Thoraxganglien, insbesondere das StG, sind wichtige Bes....

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt alle Schritte, die für den snRNA-seq von murinen zervikalen und/oder zervikothorakalen (stellaten) Ganglien erforderlich sind. Weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse (15 Wochen alt, n = 2 für jedes Geschlecht) wurden verwendet. Eine zusätzliche Wnt1-Cre;mT/mG-Maus wurde verwendet, um die Ganglien zu Dissektionszwecken zu visualisieren^17,18. Diese zusätzliche Maus wurde durch die Kreuzung einer B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-Maus und einer B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-Maus erzeugt. Alle Tierversuche wurden gemäß dem vom NIH veröffentlichten und von der Tierethikkom....

Ergebnisse

Qualitätskontrollanalyse der Einzelkern-cDNA-Bibliotheksvorbereitung und snRNA-seq
Repräsentative Ergebnisse beschreiben Sequenzierungsergebnisse von 10.000 erfassten Kernen in einem einzigen Pool mit einer Genexpressionsbibliothek mit 25.000 Lesevorgängen / Kern und einer Hashtag-Bibliothek mit 5.000 Lesevorgängen / Kernen. Abbildung 3B zeigt die Qualitätskontrollergebnisse des 1. Strangs cDNA, der Genexpressionsbibliothek (GEX) und der HTO-Bibliothek, die mit dem B.......

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben, das sich auf i) die Dissektion von adulten Maus-Superior-zervikalen und stellaten sympathischen Ganglien, ii) die Isolierung und Kryokonservierung der Ganglienzellen, iii) Nukleusisolierung und iv) Nukleus-Barcoding mit HTO-Markierung für Multiplexing-Zwecke und snRNA-seq konzentriert.

Mit diesem Protokoll können sympathische Ganglienzellen leicht erhalten werden, indem einzelne Ganglien unter Verwendung von häufig verwendetem Trypsin und K.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0.4% trypan blue dye	Bio-Rad	1450021
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Collagenase type 2	Worthington	LS004176	use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	67685
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)	Biowest	S1810-500
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)	Sigma-Aldrich	74385	Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)	Invitrogen	AM9937	Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)	Invitrogen	AM9937	ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20	Merck Millipore	822184	ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody	Biolegend	682205	Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody	Biolegend	682207	Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody	Biolegend	682209	Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody	Biolegend	682225	Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody	Biolegend	682227	Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody	Biolegend	682229	Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody	Biolegend	682231	Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody	Biolegend	682233	Hashtag antibody
TruStain FcX (human)	Biolegend	422302	FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer	Merck	Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38	Eppendorf	EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish	Corning	351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Fine science tools	11252-40
Hardened Fine Scissors	Fine science tools	14091-09
Ice Pan, rectangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Leica		Microscope
Moria MC50 Scissors	Fine science tools	15370-50
Noyes Spring Scissors	Fine science tools	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Olympus		Microscope
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Preseparation Filters (30 µm)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath	GFL	1083
Silicon plate	RubberBV	3530	Dissection board
Software and packages
Cell ranger	V4.0.0
R programming	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #007576
C57BL/6J mice	Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE