Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte, inputarme Probenvorbereitung für die Einzelkernsequenzierung, einschließlich der Dissektion von Maus-Superior-Cervix- und Sternganglien, Zelldissoziation, Kryokonservierung, Nukleusisolierung und Hashtag-Barcoding.

Zusammenfassung

Das kardiale autonome Nervensystem ist entscheidend für die Kontrolle der Herzfunktion wie Herzfrequenz und Herzkontraktilität und ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Normalerweise gibt es ein Gleichgewicht zwischen diesen beiden Zweigen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Herzerkrankungen wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz und Bluthochdruck können jedoch den Umbau von Zellen induzieren, die an der Herzinnervation beteiligt sind, was mit einem nachteiligen klinischen Ergebnis verbunden ist.

Obwohl es riesige Datenmengen für die histologische Struktur und Funktion des kardialen autonomen Nervensystems gibt, ist seine molekularbiologische Architektur in Gesundheit und Krankheit in vielerlei Hinsicht immer noch rätselhaft. Neuartige Technologien wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) versprechen die genetische Charakterisierung von Geweben bei Einzelzellauflösung. Die relativ große Größe der Neuronen kann jedoch die standardisierte Verwendung dieser Techniken behindern. Hier nutzt dieses Protokoll die tröpfchenbasierte Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), eine Methode zur Charakterisierung der biologischen Architektur von kardialen sympathischen Neuronen in Gesundheit und Krankheit. Es wird gezeigt, dass ein schrittweiser Ansatz snRNA-seq der bilateralen oberen zervikalen (SCG) und stellaten Ganglien (StG) durchführt, die von erwachsenen Mäusen seziert wurden.

Diese Methode ermöglicht eine langfristige Probenkonservierung und hält eine angemessene RNA-Qualität aufrecht, wenn Proben von mehreren Individuen / Experimenten nicht innerhalb kurzer Zeit auf einmal gesammelt werden können. Die Barkodierung der Kerne mit Hashtag-Oligos (HTOs) ermöglicht das Demultiplexing und die Rückverfolgung verschiedener ganglionärer Proben nach der Sequenzierung. Nachfolgende Analysen zeigten eine erfolgreiche Kernerfassung von neuronalen, satellitengestützten Glia- und Endothelzellen der sympathischen Ganglien, wie durch snRNA-seq validiert. Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen schrittweisen Ansatz für snRNA-seq von sympathischen extrinsischen Herzganglien, eine Methode, die das Potenzial für eine breitere Anwendung in Studien der Innervation anderer Organe und Gewebe hat.

Einleitung

Das autonome Nervensystem (ANS) ist ein entscheidender Teil des peripheren Nervensystems, das die Homöostase des Körpers aufrechterhält, einschließlich der Anpassung an Umweltbedingungen und Pathologie¹. Es ist an der Regulierung mehrerer Organsysteme im ganzen Körper beteiligt, wie z. B. des Herz-Kreislauf-, Atemwegs-, Verdauungs- und endokrinen Systems. Die ANS ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Spinaläste der Synapse des sympathischen Nervensystems in Ganglien der sympathischen Kette, bilateral in einer paravertebralen Position gelegen. Die bilateralen Hals- und Thoraxganglien, insbesondere das StG, sind wichtige Bestandteile, die an der kardialen sympathischen Innervation beteiligt sind. In Krankheitszuständen, wie z.B. Herzischämie, kann es zu neuronalem Umbau kommen, was zu einem sympathischen Overdrive^{führt 2}. Der neuronale Umbau wurde in mehreren histologischen Studien am Menschen und mehreren anderen Tierarten^nachgewiesen 3,4,5,6. Eine detaillierte biologische Charakterisierung des kardialen Ischämie-induzierten neuronalen Remodells bei kardialen sympathischen Ganglien fehlt derzeit, und die grundlegenden biologischen Eigenschaften spezialisierter neuronaler Zelltypen oder Subtypen innerhalb des kardialen sympathischen Nervensystems (SNS) sind in Gesundheit und Krankheit noch nicht vollständig bestimmt⁷.

Neuartige Technologien wie scRNA-seq haben Gateways für die genetische Charakterisierung kleiner Gewebe auf Einzelzellebene ^8,9 geöffnet. Die relativ große Größe der Neuronen kann jedoch den optimierten Einsatz dieser Einzelzelltechniken beim Menschen behindern¹⁰. Darüber hinaus erfordert die Einzelzellsequenzierung einen hohen Zelldurchsatz, um aufgrund eines hohen Verlusts im Sequenzierungsprozess eine ausreichende Zellzahl wiederherzustellen. Dies könnte sich bei der Untersuchung kleiner Gewebe, die in einer Sitzung schwer zu erfassen sind und mehrere Proben erfordern, um genügend einzelne Zellen für die Sequenzierung einzuführen, als Herausforderung erweisen. Die kürzlich entwickelte tröpfchenbasierte snRNA-seq-Technologie (d.h. die 10x Chromium-Plattform) ermöglicht die Untersuchung biologischer Unterschiede zwischen einzelnen Kernen^11,12. snRNA-seq hat einen Vorteil gegenüber scRNA-seq für große Zellen (>30 μm), die möglicherweise nicht in Gelperlen in Emulsionen (GEMs) eingefangen werden, sowie eine verbesserte Kompatibilität bei extensiver Dissoziation und/oder längerer Konservierung^13,14,15.

Heterogenität, die Anzahl der neuronalen Zellen und andere im kardialen SNS angereicherte Zellen sind wichtige Aspekte für die Charakterisierung des ANS in Gesundheits- und Krankheitszuständen. Darüber hinaus trägt die organ- oder regionsspezifische Innervation durch jedes sympathische Ganglion zur Komplexität des SNS bei. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zervikale, stellare und thorakale Ganglien der sympathischen Kette verschiedene Regionen des Herzens innervieren¹⁶. Daher ist es notwendig, eine Einzelkernanalyse von Ganglienzellen durchzuführen, die aus einzelnen Ganglien stammen, um ihre biologische Architektur zu untersuchen.

Tröpfchenbasiertes snRNA-seq ermöglicht eine transkriptomweite Expressionsprofilierung für einen Pool von Tausenden von Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig mit geringeren Kosten als plattenbasierte Sequenzierungsplattformen. Dieser Ansatz ermöglicht es, dass tröpfchenbasierte snRNA-seq besser für die zelluläre Phänotypklassifizierung und die Identifizierung neuer Subpopulationen von Zellen innerhalb des SCG und des StG geeignet ist. Insbesondere bietet dieses Protokoll einen prägnanten schrittweisen Ansatz für die Identifizierung, Isolierung und Einzelkern-RNA-Sequenzierung von sympathischen extrinsischen Herzganglien, eine Methode, die das Potenzial für eine breite Anwendung in Studien zur Charakterisierung von Ganglien hat, die andere verwandte Organe und Gewebe in Gesundheit und Krankheit.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt alle Schritte, die für den snRNA-seq von murinen zervikalen und/oder zervikothorakalen (stellaten) Ganglien erforderlich sind. Weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse (15 Wochen alt, n = 2 für jedes Geschlecht) wurden verwendet. Eine zusätzliche Wnt1-Cre;mT/mG-Maus wurde verwendet, um die Ganglien zu Dissektionszwecken zu visualisieren^17,18. Diese zusätzliche Maus wurde durch die Kreuzung einer B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-Maus und einer B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-Maus erzeugt. Alle Tierversuche wurden gemäß dem vom NIH veröffentlichten und von der Tierethikkommission der Universität Leiden genehmigten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt (Lizenznummer AVD1160020185325, Leiden, Niederlande). In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten, Software und Tieren, die im Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitungen

HINWEIS: Alle Schritte werden in einem Zellkultur-Durchflussschrank durchgeführt.

1. Reinigen Sie die Pinzette und die Schere, indem Sie die Instrumente 20 Minuten lang in 70% Ethanol tauchen.
2. Bereiten Sie das Ganglienmedium vor, das aus neurobasalem Medium besteht, ergänzt mit B-27 plus (1x), L-Glutamin (2 mM) und 1% antibiotisch-antimykotisch. Das Ganglienmedium bei Raumtemperatur vorwärmen.
3. Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) und 1.400 E/ml Kollagenase Typ 2 gelöst im Ganglienmedium.
4. Bereiten Sie frischen, kalten (4 °C) Zellwaschpuffer (0,4% Rinderserumalbumin [BSA]) und Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM_{MgCl 2} und 0,1% nichtionisches Detergenzium, 40 E/ml RNAse in nukleasefreiem Wasser) für die Zellkernisolierung vor.
5. Bereiten Sie den Kernwaschpuffer vor (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] mit 2,0% BSA und 0,2 U / μL RNase-Hemmer).
6. ST-Färbepuffer (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,₂% BSA, 0,02% Tween-20 in nukleasefreiem Wasser).

2. Dissektion von adulten Maus-Hirnganglien (SCG)

1. Euthanasiere die Mäuse und halte sie auf Eis.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden insgesamt 4 C57BL6/J-Mäuse durch CO2-Erstickung eingeschläfert. Alternativ kann Isofluran gefolgt von einer Exsanguination verwendet werden, wenn eine große Menge Blut für andere Studienzwecke gesammelt werden muss.
2. Befestigen Sie die Maus mit Stiften auf einer Seziertafel und übergießen Sie sie mit 70% Ethanol, um die Ausbreitung des Fells zu minimieren (Rasieren ist nicht erforderlich).
3. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop die Haut der Halsregion, indem Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt machen, bewegen Sie die submandibulären Drüsen zur Seite und entfernen Sie den Musculus sternomastoideus, um die gemeinsame Halsschlagader und ihre Verzweigung freizulegen und zu lokalisieren (Abbildung 1A, B, siehe Pfeil).
4. Sezieren Sie die Verzweigung der rechten und linken Halsschlagader und das daran befestigte Gewebe. Geben Sie jedes sezierte Stück Gewebe in eine separate 3,5 cm große Petrischale, die kaltes PBS enthält.
5. Suchen Sie nach dem SCG, das an der Carotis-Bifurkation befestigt ist. Reinigen Sie das SCG weiter, indem Sie die Arterie und anderes anhaftendes Gewebe in der Petrischale entfernen (Abbildung 1E).

3. Dissektion von adulten Maus-Sternganglien (StG)

1. Um das StG zu sezieren, machen Sie einen Mittellinienschnitt im Bauch, gefolgt von der Öffnung des Zwerchfells und der ventralen Brustwand.
2. Entfernen Sie das Herz und die Lunge, um den dorsalen Thorax freizulegen. Suchen Sie nach dem linken und rechten StG anterolateral zum Musculus colli longus (MCL) auf Höhe der ersten Rippe (Abbildung 1C, D, gekennzeichnet durch gestrichelte Linien).
3. Sezieren Sie die linke und rechte StG mit einer Pinzette und geben Sie sie separat auf 3,5 cm große Petrischalen mit kaltem PBS (Abbildung 1F).
   ​

4. Isolierung und Kryokonservierung von Ganglienzellen der Maus

Die Schritte 4 bis 6 sind in Abbildung 2 zusammengefasst.

1. Übertragen Sie vorsichtig alle einzelnen SCG und StG in separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Pinzette.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um die Ganglien zu übertragen, da die Ganglien dazu neigen, an der Wand aus Kunststoffpipettenspitzen zu haften.
2. 500 μL 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben und in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C für 40 min inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die Verdauung und die anschließende Zellfreisetzung in der Kollagenase-Typ-2-Lösung zu erleichtern.
3. Bereiten Sie für jede Probe ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Ganglienmedium vor. Lassen Sie die Ganglien sich am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen absetzen. Sammeln Sie den Überstand, der sehr wenige Ganglienzellen enthält, übertragen Sie den Überstand auf die vorbereiteten 15-ml-Röhrchen und markieren Sie jede Röhre. Alternativ, um etwas Zeit zu sparen, aspirieren Sie den Trypsin-EDTA-Überstand ohne Sammlung, da nur sehr wenige dissoziierte Zellen darin nachgewiesen werden können.
   HINWEIS: Eine kleine Menge Trypsin-EDTA-Lösung (~ 10-30 μL) kann im Mikrozentrifugenröhrchen verbleiben, um die Entfernung der Ganglien zu vermeiden. Vermeiden Sie Pipettieren bei diesem Schritt, da dies die Ganglien schädigen und danach zu einer geringen Produktion von Ganglienzellen führen kann.
4. 500 μL Kollagenase Typ 2 Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben und in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 °C für 35-40 min inkubieren. Versuchen Sie, das Ganglion nach 35 min wieder auszusetzen; Wenn das Ganglion noch intakt ist und nicht dissoziiert, verlängern Sie die Inkubationszeit oder erhöhen Sie die Konzentration der Kollagenase-Typ-2-Lösung nach Bedarf.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Gangliengröße variieren.
5. Resuspendieren Sie die Ganglien in Kollagenaselösung, indem Sie ~ 10 Mal auf und ab pipettieren oder bis Gewebeklumpen nicht mehr erkannt werden.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension auf die zuvor verwendete 15-ml-Röhre, die das Ganglienkulturmedium und die Trypsin-EDTA-Suspension aus demselben Ganglien enthält. Drehen Sie die Zellsuspension mit einer schwingenden Eimerrotorzentrifuge für 10 min, 300 × g bei Raumtemperatur herunter. Verwerfen Sie vorsichtig den Zellüberstand.
   HINWEIS: Da die ganglionären Zellen von einem einzelnen Ganglion dissoziiert sind, kann das Zellpellet zu klein sein, um es mit dem Auge zu erkennen; Eine kleine Menge Überstand kann in der Röhre verbleiben, um eine versehentliche Entfernung des Zellpellets zu vermeiden.
7. Resuspendieren Sie die Ganglienzellen in 270 μL fetalem Rinderserum (FBS, niedriges Endotoxin) und übertragen Sie jede Zell-FBS-Suspension in eine 1 ml Kryoviale.
8. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie 5 μL der ganglionären Zellsuspension mit 5 μL 0,4% trypanblauem Farbstoff und laden Sie die Mischung in ein Hämozytometer. Zählen Sie die Gesamtzahl und die Anzahl der lebenden Zellen unter einem Mikroskop.
   HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit (Lebendzellanzahl/Gesamtzellzahl = Lebensfähigkeit) liegt bei diesem Dissoziationsprotokoll normalerweise über 90%. Die Anzahl der lebenden Zellen eines einzelnen Ganglis (entweder SCG oder StG) liegt normalerweise im Bereich von 9.000-60.000 Zellen, wenn das Ganglion von einer Maus im Alter von 12 bis 16 Wochen isoliert wird.
9. Fügen Sie 30 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jeder Zell-FBS-Suspension in den Kryozellen hinzu, mischen Sie gut und geben Sie die Kryovials in einen Zellgefrierbehälter, der bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Lagern Sie den mit Kryo beladenen Behälter über Nacht bei -80 ° C und geben Sie die Kryoviale am nächsten Tag zur Langzeitkonservierung vor der Sequenzierung in flüssigen Stickstoff um.

5. Nukleus-Isolierung

HINWEIS: Linkes und rechtes SCG, das aus vier Mäusen (insgesamt 8 Proben) isoliert wurde, wurde als Beispiel für die folgende Nukleusisolierung und Sequenzierungsvorbereitung verwendet. Halten Sie alles während des gesamten Eingriffs auf Eis. Aufgrund der Unsichtbarkeit von kleinen Kernpellets wird eine Zentrifuge mit schwingenden Eimern dringend empfohlen, um die Entfernung von Überständen während des gesamten Verfahrens zu erleichtern.

1. Bereiten Sie 15 ml-Röhrchen mit einem Sieb (30 μm) oben vor und spülen Sie das Sieb mit 1 ml des Ganglienmediums vor.
2. Entnehmen Sie die Kryoviten aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie sofort in einem Wasserbad bei 37 °C auf. Wenn ein kleines Pellet Eis im Kryo verbleibt, nehmen Sie die Kryoviale aus dem Wasserbad.
3. Erholen Sie die Ganglienzellen, indem Sie 1 ml des Ganglienmediums in jedes Kryo fallen lassen, während Sie vorsichtig von Hand schütteln. Optional: Um die Zellwiederherstellung zu bewerten, mischen Sie die Zellsuspension nach der Wiederherstellung und nehmen Sie 5 μL Zellsuspension für die Lebendzellzählung heraus, wie in Schritt 4.8 beschrieben.
4. Jede Ganglienzellsuspension wird auf ein separates Sieb (vorbereitet in Schritt 5.1) geladen und jedes Sieb mit 4-5 ml Ganglienmedium abgespült.
5. Zentrifen Sie die gespannte Zellsuspension für 5 min bei 300 × g, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie die Zellen in 50 μL Zellwaschpuffer.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein niedrig bindendes DNA/RNA 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Zellsuspension bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
8. Entfernen Sie 45 μL des Überstandes, ohne den Boden des Röhrchens zu berühren, um ein Lösen des Zellpellets zu vermeiden.
9. Fügen Sie 45 μL gekühlten Lysepuffer hinzu und pipettieren Sie vorsichtig mit einer 200 μL Pipettenspitze auf und ab.
10. Inkubieren Sie die Zellen für 8 min auf Eis.
11. Fügen Sie jedem Röhrchen 50 μL kalten Kernwaschpuffer hinzu. Nicht mischen.
12. Die Kernsuspension wird bei 600 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
13. Entfernen Sie 95 μL des Überstandes, ohne das Kernpellet zu stören.
14. 45 μL gekühlter Kernwaschpuffer in das Pellet geben. Optional: Nehmen Sie 5 μL Kernsuspension, mischen Sie mit 5 μL von 0,4% Trypanblau, um zu zählen, und überprüfen Sie die Qualität der Kerne unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometer.
15. Die Kernsuspension wird bei 600 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
16. Entfernen Sie den Überstand, ohne den Boden des Rohres zu berühren, um ein Verschieben des Kernpellets zu vermeiden.

6. Nucleus Barcoding mit Hashtag-Oligos (HTOs) und Multiplexing

HINWEIS: HTO-Färbeschritte wurden modifiziert und optimiert für die nukleare Markierung sehr geringer Mengen von (ganglionischen) Kernen gemäß der vorherigen Anwendung in kortikalem Gewebe durch Gaublomme et ^al.15.

1. 50 μL ST-SB-Puffer in das Kernpellet geben, 8-10 Mal vorsichtig pipettieren, bis die Kerne vollständig resuspendiert sind.
2. 5 μL Fc-Blocking-Reagenz pro 50 μL der ST-SB/Nuklei-Mischung zugeben und 10 min auf Eis inkubieren.
3. Fügen Sie 1 μL (0,5 μg) Einzelkern-Hashtag-Antikörper pro Röhrchen des ST-SB/Nuklei-Mixes hinzu und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
   HINWEIS: Eine kürzere Inkubationszeit führt zu einer geringeren Effizienz der Hashtag-Kennzeichnung, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen.
4. Fügen Sie 100 μL ST-SB zu jedem Röhrchen hinzu. Nicht mischen.
5. Die Kernsuspension wird 5 min, 600 × g bei 4 °C zentrifugiert.
6. Entfernen Sie 145 μL des Überstands, ohne das Kernpellet zu stören.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6.4 und 6.5. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich, ohne den Boden des Rohres zu berühren, um ein Verschieben des Kernpellets zu vermeiden.
8. Resuspendiert das Kernpellet in 50 μL ST-SB und mischen Sie die Kerne vorsichtig.
9. Nehmen Sie 5 μL der Kernsuspension und mischen Sie sie mit 5 μL 0,4% Trypanblau, um die Kerne unter einem Mikroskop zu zählen. Siehe Abbildung 3A für ein repräsentatives Bild von Kernen, die mit Trypanblau vermischt und in ein Hämozytometer geladen werden.
10. Die Kernsuspension wird 5 min bei 600 × g bei 4 °C zentrifugiert.
11. Resuspendieren Sie die Kerne in ST-SB, um eine Zielkernkonzentration von 1.000-3.000 Kernen / μL für jede Probe gemäß der entsprechenden Kernzahl zu erreichen.
12. Poolen Sie die Proben, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erhalten.
    HINWEIS: Zum Beispiel wurden in diesem Experiment 8 Proben gleichmäßig gepoolt, um insgesamt 25.000 Kerne zu erhalten, um sofort zu 10x Genomics Chromium und snRNA-seq zu gelangen. Die Kernzahl liegt normalerweise im Bereich von 6.000-40.000 Zellen, wenn das Ganglion von einer Maus im Alter von 12 bis 16 Wochen isoliert wird. Nur etwa die Hälfte der insgesamt belasteten Kerne kann durch tröpfchenbasierten snRNA-seq erfasst werden. Zum Beispiel wurde ein 25.000-Kern-Gemisch vorbereitet, um die Aufnahme von 10.000 Kernen zu gewährleisten, die für die weitere Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung benötigt werden.

Ergebnisse

Qualitätskontrollanalyse der Einzelkern-cDNA-Bibliotheksvorbereitung und snRNA-seq
Repräsentative Ergebnisse beschreiben Sequenzierungsergebnisse von 10.000 erfassten Kernen in einem einzigen Pool mit einer Genexpressionsbibliothek mit 25.000 Lesevorgängen / Kern und einer Hashtag-Bibliothek mit 5.000 Lesevorgängen / Kernen. Abbildung 3B zeigt die Qualitätskontrollergebnisse des 1. Strangs cDNA, der Genexpressionsbibliothek (GEX) und der HTO-Bibliothek, die mit dem B...

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben, das sich auf i) die Dissektion von adulten Maus-Superior-zervikalen und stellaten sympathischen Ganglien, ii) die Isolierung und Kryokonservierung der Ganglienzellen, iii) Nukleusisolierung und iv) Nukleus-Barcoding mit HTO-Markierung für Multiplexing-Zwecke und snRNA-seq konzentriert.

Mit diesem Protokoll können sympathische Ganglienzellen leicht erhalten werden, indem einzelne Ganglien unter Verwendung von häufig verwendetem Trypsin und K...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0.4% trypan blue dye	Bio-Rad	1450021
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Collagenase type 2	Worthington	LS004176	use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	67685
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)	Biowest	S1810-500
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)	Sigma-Aldrich	74385	Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)	Invitrogen	AM9937	Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)	Invitrogen	AM9937	ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194	ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20	Merck Millipore	822184	ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody	Biolegend	682205	Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody	Biolegend	682207	Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody	Biolegend	682209	Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody	Biolegend	682225	Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody	Biolegend	682227	Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody	Biolegend	682229	Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody	Biolegend	682231	Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody	Biolegend	682233	Hashtag antibody
TruStain FcX (human)	Biolegend	422302	FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer	Merck	Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38	Eppendorf	EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish	Corning	351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Fine science tools	11252-40
Hardened Fine Scissors	Fine science tools	14091-09
Ice Pan, rectangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Leica		Microscope
Moria MC50 Scissors	Fine science tools	15370-50
Noyes Spring Scissors	Fine science tools	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Olympus		Microscope
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Preseparation Filters (30 µm)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath	GFL	1083
Silicon plate	RubberBV	3530	Dissection board
Software and packages
Cell ranger	V4.0.0
R programming	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse	The Jackson Laboratory	JAX stock #007576
C57BL/6J mice	Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE