用于泪腺干细胞的三维无血清培养系统

摘要

用于成体泪腺（LG）干细胞的三维无血清培养方法对于诱导LG类器官形成并分化为腺泡或导管状细胞已经确立。

摘要

基于泪腺（LG）干细胞的治疗是治疗泪腺疾病的有希望的策略。然而，缺乏可靠的无血清培养方法来获得足够数量的LG干细胞（LGSC）是进一步研究和应用的一个障碍。用于成人小鼠LGSC的三维（3D），无血清培养方法已经建立并在此处显示。LGSC可以连续传代并诱导分化为腺泡或导管样细胞。

对于LGSC原代培养，用分散酶，胶原酶I和胰蛋白酶 - EDTA消化来自6-8周龄小鼠的LGs。将总共1×10⁴ 个单细胞接种到24孔板的每个孔中的80μL基质凝胶泪腺干细胞培养基（LGSCM）基质中，并用20μL基质凝胶-LGSCM基质预涂。将混合物在37°C下孵育20分钟后固化，并加入600μLLGSCM。

对于LGSC维持，通过分散酶和胰蛋白酶- EDTA将培养7天的LGSC分解成单细胞。根据LGSC原代培养中使用的方法植入和培养单个细胞。LGSC可以传代40次以上，并连续表达干细胞/祖细胞标志物Krt14，Krt5，P63和巢蛋白。在LGSCM中培养的LGSC具有自我更新能力，可以在 体外 和 体内分化成腺泡或导管样细胞。

引言

泪腺干细胞（LGSC）维持泪腺（LG）细胞更新，是腺泡和导管细胞的来源。因此，LGSC移植被认为是治疗严重炎症损伤和水缺乏性干眼病（ADD）^{的替代方法1，2，3}。Tiwari等人使用胶原蛋白I和基质凝胶分离和培养原代LG细胞，并补充了几种生长因子;然而，LG细胞不能连续培养⁴。使用二维（2D）培养，由You等人⁵和阿克曼等人分离出小鼠LG衍生的干细胞。⁶、发现表达干细胞/祖细胞标记基因的Oct4、Sox2、纳米和巢蛋白，并可进行传代培养。然而，没有明确的迹象表明这些细胞可以分化成腺泡或导管细胞，也没有移植实验来验证体内的分化潜力。

最近，通过流式细胞术从小鼠LG中分离出c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/^Sca1-/CD34^-/CD45^- 细胞，发现其表达LG祖细胞标志物，如Pax6和Runx1， 并在体外分化成导管和阿西尼。在具有ADDD的小鼠中，用这些细胞进行原位注射可以修复受损的LG并恢复LG²的分泌功能。然而，通过这种方法分离的干细胞数量很少，并且没有合适的培养条件来扩增分离的LGSC。综上所述，需要建立适当的培养体系，以有效分离和培养具有稳定和持续扩增的LGS成体LGSC，以研究LGSC在ADD处理中的应用。

来自干细胞或多能干细胞的类器官是一组在组织学上与相关器官相似的细胞，可以维持自己的更新。在Sato等人于2009年⁷成功培养小鼠肠道类器官后，基于佐藤的培养系统，连续培养来自其他器官的类器官，如胆囊⁸，肝脏⁹，胰腺^10，胃11，乳房¹²，肺¹³，前列腺¹⁴和唾液腺¹⁵.由于成体干细胞在类器官培养中分化前的比例很高，因此三维（3D）类器官培养方法被认为是LG成体干细胞分离和培养的最佳选择。

本研究通过优化3D无血清培养方法建立了成年小鼠LGSC培养系统。结果表明，从正常和ADD小鼠培养的LGSC显示出稳定的自我更新和增殖能力。移植到添加的小鼠LG后，LGSC定植受损的LG并改善了泪液的产生。此外，从ROSA26^{mT / mG} 小鼠中分离红色荧光LGSC并进行培养。本研究为LGSC 体外 富集和LGSC自体移植在临床应用中的附加治疗提供了可靠的参考。

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研究方案

该协议中的所有实验都遵循中山大学动物试验伦理委员会的动物护理指南。所有与细胞相关的操作都将在单元操作室的超洁净工作台上进行。所有使用二甲苯的操作都将在通风橱中进行。

1. 初级培养

1. 低压合成材料隔离
   1. 获取6-8周龄的BALB / c雄性小鼠，并切开耳朵后面的皮肤以暴露LG及其周围的结缔组织。在镊子的帮助下通过钝性解剖剥离结缔组织并去除LG。
   2. 用4 mL无菌10 mM PBS溶液冲洗LFG两次，以去除6厘米培养皿中的血液。将LG浸入装有4 mL 75%乙醇的6厘米培养皿中10秒，然后立即用10 mM PBS冲洗两次。
2. 获得LG的单细胞
   1. 使用HEPES缓冲溶液（50 mM肝素/KOH，在超纯水中pH 7.4; 150mM NaCl）制备25 U / mL分散酶。用超纯水制备0.1%胶原酶I溶液。
   2. 将LG切成小片段（约1mm³），将其转移到无菌的15mL离心管中，并在37°C下用500μL 25 U / mL分散酶和500μL0.1%胶原酶I处理组织1小时。
   3. 使用10mM PBS制备胰蛋白酶 - EDTA溶液（0.05克/升胰蛋白酶，0.04克/升EDTA）。用1mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37°C下处理步骤1.2.2中的LG片段10分钟，并通过反复移液将片段解离成单个细胞。
   4. 通过70μm过滤器过滤悬浮液，将滤液收集到无菌的15mL离心管中，并以150× g 离心5分钟。
   5. 离心后，取出上清液，加入10 mL 10 mM PBS洗涤细胞沉淀，离心悬浮液。
   6. 重复步骤1.2.5，除去上清液，加入1mL DMEM / F12（杜尔贝科修饰的鹰培养基和汉姆的F-12的1:1混合物）以重悬细胞沉淀。
3. 原代菌种
   1. 制备含有DMEM / F12，1x N2补充剂，1x B27补充剂，2mM谷氨酰胺替代品，0.1mMNEA（非必需氨基酸），50ng / mL鼠表皮生长因子（EGF），100ng / mL成纤维细胞生长因子10（FGF10），10ng / mL Wnt3A和10μM Y-27632（岩石抑制剂）的泪腺干细胞培养基（LGSCM）。
   2. 在24孔板的孔中心加入20μL基质凝胶- LGSCM基质（基质凝胶:LGSCM = 1:1）。使用移液器吸头将其膨胀到圆形（直径6-8mm），并将混合物在37°C下孵育20分钟以预涂孔。
   3. 使用细胞计数器确定细胞数量，并将40μLLGSCM与总共1×10⁴ 个细胞加入40μL基质凝胶中。用移液管轻轻混合，得到基质凝胶-LGSCM混合物（基质凝胶:LGSCM= 1:1）。
   4. 在步骤1.3.2中，使用移液管小心地将80μL混合物滴在24孔板的每个孔的预涂区域上。
   5. 将混合物在37°C下孵育20分钟，并加入600μLLGSCM。
   6. 每两天更换一次每个孔中的培养基。培养7天后，在倒置显微镜下寻找直径为100-300μm的LGSC球体（目镜:10x，物镜:4x）。
      注意:LGSC 总共可以培养超过 14 天。
4. 按照上述步骤分离和培养ROSA26^{mT / mG} 小鼠和DED小鼠（NOD / ShiLtJ）的初级LGSC。

2. 线路电缆的维护和通过

1. 从球体培养井中取出培养基。
2. 通过在20μL10 U / mL分散酶和100μL 10mM PBS中在37°C下孵育30分钟来分解培养7天的LGSC球。
3. 将悬浮液转移到15mL离心管中，并以150× g 离心4分钟。取出上清液。
4. 在37°C下用1mL 0.05%胰蛋白酶- EDTA处理球体5分钟。 加入1mL 0.05%胰蛋白酶抑制剂（TI）并反复移液以中和胰蛋白酶并将球体解离成单个细胞。
5. 以150× g 离心5分钟，除去上清液以获得沉淀中的LGSC。加入1毫升LGSCM以重悬LGSC沉淀。
6. 按照步骤1.3.1至1.3.6中所述对单个细胞进行平板。

3. 表面活性物质的鉴别

1. 程序1:使用LGSC培养系统将LGSC的培养时间从7天延长至14天，以进行随机分化。
2. 步骤2:在LGSC培养开始时将基质凝胶- LGSCM混合物的比例从1:1更改为1:2，用于导管细胞的分化。将LGSC种子到基质中进行诱导14天（参见步骤1.3）。
3. 程序3:传代后，用LGSCM-10%胎牛血清（FBS）混合物代替LGSCM，用于腺泡细胞的分化。诱导分化 14 天。

4. LG组织脱水

1. 获得LG组织（步骤1.1.1）并用4mL无菌10mM PBS溶液在6cm培养皿中冲洗LG2分钟。将组织移动到10%福尔马林溶液中以固定24小时。
2. 用10mM PBS冲洗固定组织2分钟以除去福尔马林，并将组织转移到组织包埋盒中。将包埋盒放入自动脱水机中。
3. 使用自动脱水机使组织脱水如下:70%乙醇，2小时;80%乙醇，2小时;90%乙醇，30分钟;95%乙醇，30分钟;无水乙醇，30分钟;无水乙醇，2小时;无水乙醇:100%二甲苯（1:1）混合物，30分钟;100%二甲苯，30分钟;100%二甲苯， 2小时;100%二甲苯:石蜡（1:1）混合物，30分钟;石蜡，2小时;石蜡，3小时。

5. LG类器官/球体脱水

1. 在1.5mL微量离心管中获得LG类器官/球体（步骤2.1-2.3），并用1mL无菌10mM PBS溶液冲洗LG类器官/球体2分钟。
2. 以100× g 离心1分钟并除去上清液。
3. 按如下方式制备4%多聚甲醛（PFA）溶液:将20g PFA加入400 mL 10 mM PBS和40μL1 M NaOH的混合物中，充分摇动溶液，并在65°C水浴中加热2小时，直到PFA完全溶解。冷却至室温后，使用10 mM PBS将体积增加到500 mL并将其储存在4°C。
4. 将1mL 4%PFA加入具有类器官/球形颗粒的微量离心管中，并将管放入4°C冰箱中至少24小时以进行固定。
5. 固定后，以100× g 离心1分钟并除去上清液。将1mL 10 mM PBS加入具有类器官/球形沉淀的微量离心管中，并通过移液2分钟轻轻混合以冲洗掉PFA。重复此步骤两次。
6. 以100× g 离心1分钟并除去上清液。
7. 热包埋水凝胶溶解并加入50-60μL包埋水凝胶到类器官/球形颗粒中并混合。将混合物以液滴的形式移液到石蜡膜上，并等待5分钟，使其在室温下固化。
8. 将凝胶与类器官/球体在新的1.5 mL微量离心管中脱水，如下所示。
   1. 向管中加入1mL 50%乙醇，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤，依次将乙醇浓度更改为70%，80%，90%，95%。
   2. 向管中加入1mL无水乙醇，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤。
   3. 向管中加入1mL 0.5mL无水乙醇和0.5mL 100%二甲苯的混合物，在室温下等待30分钟，并通过移液从管中取出液体。
   4. 向管中加入1mL 100%二甲苯，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤。
      注意:步骤5.8.5-5.8.6必须在65°C的金属浴中进行。
   5. 向管中加入1mL 0.5mL石蜡和0.5mL 100%二甲苯的混合物，在65°C下等待30分钟，并通过移液从管中取出液体。
   6. 向管中加入1mL石蜡，在65°C下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤并将处理时间延长至1小时。

6. 石蜡包埋和切片

1. 石蜡包埋
   1. 在包埋之前，打开包埋机并预热以融化石蜡罐中的石蜡。
   2. 将脱水组织或类器官/球凝胶放入包埋铁盒的凹槽中，并将铁盒放入包埋机的石蜡中。
   3. 取下塑料盖，将塑料嵌入盒放在铁盒上以覆盖它。将嵌入的铁盒移到冷却台上。
   4. 石蜡在包埋盒中凝结成块后，将其从铁盒中取出并直接切片或暂时储存在4°C冰箱中。
2. 石蜡切片
   1. 在石蜡切片之前，预组装石蜡切片机，并将蒸馏水加入切片机的水槽中进行预热。当水温上升到42°C时开始切片。
   2. 将样品固定在石蜡切片机的样品槽上。在切片过程中将切片厚度调整为5μm。
   3. 连续切除样品。将完全平铺的部分固定在切片机罐中的防滑滑块上。
   4. 切片后，将贴有样品组织的载玻片置于37°C的生化培养箱中干燥24小时。暂时将载玻片存放在4°C的冰箱中。

7. 苏木精和曙红染色

1. 将石蜡切片在60°C下熔化30分钟，将切片浸泡在100%二甲苯中15分钟，然后重复。
2. 在振荡器上用无水乙醇处理切片5分钟。
3. 在振荡器上用90%乙醇，80%乙醇和70%乙醇处理切片，每次3分钟。
4. 在摇床上用去离子水连续处理切片5分钟和2分钟。
5. 用4mg / mL苏木精溶液在湿盒子上染色切片5分钟。在自来水中冲洗切片10分钟。
6. 首先用去离子水在摇床上搅拌切片2分钟，然后用0.5%-1%曙红搅拌1分钟。
7. 连续用70%乙醇，80%乙醇和90%乙醇在摇床上搅拌切片3分钟（每个）。用无水乙醇在摇床上搅拌切片5分钟。
8. 将切片浸泡在100%二甲苯中15分钟，然后重复浸泡。
9. 使用移液管或滴管向载玻片中加入3-4滴中性香脂，并用盖玻片慢慢覆盖。在室温下风干载玻片。

8. 免疫组化 （IHC） 染色

1. 将石蜡切片在60°C下熔化30分钟，将切片浸泡在100%二甲苯中10分钟，然后重复此步骤两次。
2. 首先用无水乙醇，90%乙醇和80%乙醇连续搅拌振荡器上的切片2分钟（每个），然后用去离子水搅拌3分钟。用去离子水重复搅拌两次。
3. 首先用20mL的30%H_{2 O 2}和180mL甲醇的混合物搅拌振荡器上的切片10分钟，然后去离子水搅拌5分钟。重复此步骤三次。
4. 将切片转移到预沸的柠檬酸缓冲液中（1L去离子水与3g Na₃C₆H₅O_{7.2H 2}O和0.4g C₆H₈O₇，pH 6.0），微波10分钟以使其保持在亚临界沸点，并在室温下冷却30分钟。在摇床上用去离子水搅拌切片5分钟。重复此步骤三次。
5. 用10 mM PBS在摇床上搅拌切片5分钟，然后重复此步骤三次。用憎水标记物将组织区域封闭在湿盒子上，加入一滴即用型非免疫山羊血清以覆盖样品，并将其置于室温下1小时。
6. 取出血清，向样品中加入一抗（参见 材料表），并在4°C下孵育过夜。 取出一抗，在振荡器上用10mM PBS搅拌切片5分钟，并用10mM PBS重复该搅拌步骤三次。
7. 加入二抗（参见 材料表）以覆盖样品，并在室温下在湿盒上孵育30分钟。用10 mM PBS在摇床上搅拌切片5分钟，并重复搅拌步骤三次。
8. 加入新鲜制备的0.03-0.05%3，3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液，以覆盖湿盒上的样品并染色30-90秒。用自来水冲洗切片10分钟。
   注意:通过在光学显微镜下观察直到出现黄色来控制染色时间。
9. 加入4mg / mL苏木精溶液覆盖样品，在湿盒上染色5分钟，然后用自来水冲洗切片10分钟。
10. 在振荡器上用80%乙醇，90%乙醇和无水乙醇搅拌切片2分钟，连续，并将切片浸泡在100%二甲苯中30分钟。
11. 使用移液管或滴管向载玻片中加入3-4滴中性香脂，并用盖玻片慢慢覆盖。在室温下风干载玻片。

9. 类器官/球体的全球免疫荧光染色

注意:将用4%PFA溶液固定的类器官/球体收集在1.5 mL微量离心管中（参见步骤5.1至5.4）。按如下方式进行荧光标记。

1. 通过将1mL 30%蔗糖溶液加入管中并使其在4°C的冰箱中孵育过夜，使类器官/球体脱水。
2. 向管中加入100μLPST溶液（10mM PBS溶液与0.1%Triton X-100）以冲洗类器官/球体5分钟，将管以100× g 离心1分钟，并收集沉淀。重复此步骤三次。
3. 向管中加入0.5-1 mL即用型非免疫山羊血清，并在室温下密封1小时。将管以100× g 离心1分钟并收集沉淀。
4. 加入几滴稀释的一抗，仅覆盖沉淀，并在4°C的冰箱中孵育48小时。将管以100× g 离心1分钟并收集沉淀。
5. 重复步骤 9.2。
6. 向管中加入几滴荧光二抗和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，仅覆盖沉淀并在4°C的冰箱中孵育24小时，避免光照。
7. 重复步骤9.2，避开光线。
8. 向管中加入100μLPBST溶液，并将其暂时储存在远离光线的4°C冰箱中。使用光片扫描显微镜观察和拍摄类器官/球体。

10. LGSC pLX-樱桃转染

注:慢病毒颗粒的生产必须在BSL2生物安全级别的生物安全柜和洁净工作台中进行。

1. 将慢病毒包装细胞293T培养在DMEM + 10%FBS的6孔板中，在37°C，5%CO₂ 下3-5天，以达到80%的细胞汇合度。
2. 将慢病毒载体 pLX-mCherry 转染到 LGSC 中。
   注意:试剂制备适用于6孔板的一孔。
   1. 准备两个无菌的1.5 mL离心管，并向每个管中加入250μL DMEM / F12。
   2. 向一个管中加入7.5μL转染试剂，并通过移液将试剂充分混合。
   3. 将不含内毒素和匹配的慢病毒包装质粒的pLX-mCherry质粒加入另一管中，并加入转染试剂（2μL / μg质粒）。
   4. 在两个离心管中混合液体，让混合物在室温下静置5分钟。
   5. 除去293T细胞的培养基，并将步骤10.2.4中的混合物加入到293T细胞中。8小时后将培养基改为新鲜的DMEM + 10%FBS。
   6. 48小时后，首次收集病毒上清液并通过0.45μm过滤器过滤。72小时后，第二次收集病毒上清液，并再次通过0.45μm过滤器过滤。
      注意:将两种过滤的上清液储存在冰上，直到慢病毒转导。
3. 从二苯乙烯醚小鼠（NOD/氧化痣）获得LGSC（参见步骤1）。
4. 加入1mL预收集的pLX-mCherry慢病毒上清液以重悬细胞。
5. 将离心管放在CO₂ 培养箱中的振荡器上，温度为37°C。 以100rpm的速度摇晃它，以最大化慢病毒和细胞之间的接触。8小时后，将混合物以250× g 离心4分钟并除去上清液。
6. 加入1 mL DMEM / F12以重悬细胞沉淀。使用细胞计数器确定细胞数量，并将总共1个×10⁴ 个细胞接种到100μL基质凝胶-LGSCM基质（基质凝胶:LGSCM = 1:1）中，每个孔板预涂有20μL基质凝胶-LGSCM基质（参见步骤1.3.2）。
7. 培养7天后（参见步骤1），在荧光显微镜下选择具有红色荧光的球体以扩大培养物。

11. 原位移植

注意:所有外科手术都在SPF手术室进行，所有手术器械都经过消毒。

1. 从具有红色荧光（td-番茄）或樱桃转染7天的ROSA26^{mT / mG} 小鼠中获取LGSC球（参见步骤1）。
2. 使用前将含有基质凝胶和 DMEM/F12 混合物的 1.5 mL 微量离心管冷却至冰上。将LGSC球消化成单个细胞，并将细胞以2×10⁶ 个细胞/ mL的密度重悬于管中。
3. 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（50mg / kg）麻醉NOD / ShiLtJ小鼠。
   注意:NOD / ShiLtJ小鼠是具有特发性附加症状的理想模型，包括泪液分泌减少，炎症浸润和眼眶溃疡。
4. 麻醉后，在眼睛上使用生理盐水或兽医软膏以防止干燥，然后用眼用剪刀在麻醉小鼠的耳朵后面（眼睛附近）的皮肤上做一个5-8毫米的切口，以暴露LG。
   注意:碘伏应严格用于切口周围的消毒。
5. 将2×10⁴ 个细胞注入左侧LG中，并将没有细胞的混合物（参见步骤11.2）注入右侧LG作为对照。
6. 注射后，用眼用镊子将LG恢复到其原始位置并缝合伤口。喂养小鼠2个月并观察治疗效果。
   注:保持架垫材料在操作后也必须严格灭菌，垫子材料应每天更换一次。缝合伤口后，曲马多可以以2.5mg / kg的标准剂量选择性地注射到小鼠的尾静脉中，以实现镇痛。
7. 在实验后2个月麻醉这些小鼠（见步骤11.3）。拍摄眼部区域的症状。
   1. 在麻醉期间，寻找以下症状:颈部和肢体肌肉松弛;深呼吸，缓慢和稳定;瞳孔缩小;角膜反射消失。
   2. 在麻醉和手术期间，将小鼠的体温保持在37°C。 手术后，在小鼠的饮用水中加入适当的抗生素，以降低伤口感染的风险。不要让小鼠无人看管，直到它们恢复足够的意识来维持胸骨卧位。在完全康复之前，不要将接受过手术的小鼠送回其他小鼠的陪伴下。
   3. 拍摄眼部区域的症状后，打开ImageJ软件，单击 文件|打开|徒手选择，按住鼠标左键，然后选择图像 中的眼眶溃疡区域 。点击 分析|测量 以获得溃疡的相对面积。
8. 将酚红棉线放在麻醉小鼠的侧囊上10秒;测量并记录棉线变色部分的长度。撕裂测量后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
9. 解剖小鼠并获取用于IHC分析的LG。

12. 核糖核酸分离

注意:在实验之前，将离心机预冷至4°C，并保证所有试剂和消耗品均不受RNAse污染。

1. 在微量离心管中收集LGSC或LG片段。加入1mL细胞裂解缓冲液，通过涡旋振荡完全裂解细胞或组织。
2. 加入0.2mL氯仿，并在涡旋振荡1分钟后在室温下静置10分钟。在4°C下离心15分钟，12，000× g。
   注意:离心后，液体分为三层，RNA处于最上层透明的水相。
3. 小心地移液最上层的透明水相，并将其转移到新的1.5 mL无RNAse离心管中。
4. 加入等体积的异丙醇，轻轻混合。让混合物在室温下静置10分钟，然后在4°C，12，000× g下离心15分钟。
5. 除去上清液，加入1mL 75%乙醇。倒置管以洗涤沉淀并在4°C，7，500× g下离心5分钟。重复此步骤。
6. 小心地取出上清液，将离心管放入超洁净工作台中干燥约20分钟。
   注意:当白色颗粒变得半透明时，继续下一步。在冰上进行所有操作。
7. 加入20μL无RNAse水以完全溶解沉淀。使用分光光度计测量RNA浓度（参见 材料表）并将RNA溶液储存在-80°C。

13. 聚合酶链反应

1. 逆转录反应
   1. 将1μg总RNA（根据RNA溶液的浓度计算添加的RNA溶液的体积）加入PCR反应管中，并在65°C下孵育5分钟以进行变性。
   2. 将其放在冰上1分钟，然后加入无酶水，直到总体积达到12μL.加入4μL的4x DNA预混液，并在37°C下孵育5分钟。
   3. 将试管放在冰上，加入4μL 5x RT预混液，轻轻混合。设置以下PCR设置:37°C持续15分钟，50°C持续5分钟，98°C持续5分钟，4°C持续1分钟。
   4. 将其储存在-20°C或逆转录反应完成后继续下一步。
2. 聚合酶链反应
   1. 在PCR管中制备PCR反应如下:14.1μL无酶水，2μLdNTP，2μL10x缓冲液，0.8μL引物（10μM，0.4μL正向引物和0.4μL反向引物，参见 材料表），1μL逆转录cDNA（参考步骤13.1）和0.1μLTaq酶。
   2. 将制备的PCR反应置于PCR装置中进行PCR。有关 PCR 程序，请参阅 Taq 酶试剂盒的说明（参见 材料表）。
3. 琼脂糖凝胶电泳
   1. 使用分析天平称量242克Tris和37.2克Na₂EDTA·2H₂O，并将它们加入1升烧杯中。向烧杯中加入约800 mL去离子水和57.1 mL冰醋酸，充分混合，向1L中加入去离子水，得到50x TAE缓冲液，并在室温下储存。
      注意:使用前用去离子水稀释50x TAE缓冲液。
   2. 使用分析天平称量1.2g琼脂糖，并将其加入含有80 mL 1x TAE缓冲液的锥形烧瓶中。在微波炉中反复加热，直到完全溶解。
   3. 在流动的自来水中冷却烧瓶，直到溶液温度降至60°C。 加入8μL核酸染色剂，充分混合后将溶液倒入糊化罐中，放置梳子，并在室温下静置30分钟。
   4. 拉出梳子并将PCR产物加载到制备的琼脂糖凝胶中。在120 V下进行电泳30分钟。
   5. 将凝胶放入ECL凝胶成像系统中并拍照。

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结果

建立 3D、无血清培养系统
本研究开发了含有EGF、Wnt3A、FGF10和Y-27632的小鼠LGSC，并通过3D培养方法成功分离和培养LGSC（图1A）。使用该方法已经建立了来自C57BL / 6小鼠，NOD / ShiLtJ小鼠，BALB / c小鼠和ROSA26^{mT / mG}小鼠的LGSC的成功3D，无血清培养系统¹⁶。对于雄性小鼠，通过解离从两个LG获得1.5-2×^{10 6}个细胞。培养一周后，在培养开始?...

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讨论

有完善的泪液干细胞分离和 体外 培养方法，用于泪液干细胞培养和LG损伤修复。沙托斯等人¹⁷ 和阿克曼等人。⁶ .分别通过2D培养方法成功培养和传代大鼠和小鼠的泪液干细胞，使得可以移植泪液干细胞用于ADDD的治疗。对2D培养的LGs的干细胞¹⁸ 和间充质干细胞^19，20 的研究表明，移植这些...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG	Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance	Sartorius
Automatic dehydrator	Thermo
Blood counting chamber	BLAU
Cell Counter	CountStar
CO2 constant temperature incubator	Thermo
ECL Gel imaging system	GE healthcare
Electric bath for water bath	Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus	BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument	Roche
Frozen tissue slicer	Lecia
Horizontal centrifuge	CENCE
Inverted fluorescence microscope	Nikon
Inverted microscope	Olympus
Laser lamellar scanning micrograph	Carl Zeiss
Liquid nitrogen container	Thermo
Low temperature high speed centrifuge	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Microwave oven	Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo	measure RNA concentration
Paraffin slicing machine	Thermo
PCR Amplifier	Eppendorf
pH value tester	Sartorius
4 °C Refrigerator	Haier
Thermostatic culture oscillator	ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument	Thermo
-80°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
-20°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
Ultra pure water purification system	ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodium	Sigma	57-33-0
Cell Culture
B27	Gibco	17504044
Collagenase I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Foetal Bovine Serum	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Human FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Murine Noggin	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
Murine EGF	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondin 1	PeproTech	120-38
Trypsin Inhibitor (TI)	Sigma	T6522	Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-21202	Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-21206	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-10037	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-10042	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody	Abcam	ab104751	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody	Abcam	ab11512	Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody	Abcam	ab181595	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody	Abcam	ab15580	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody	Abcam	ab125096	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody	Abcam	ab167453	Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Citric Acid	Sangon Biotech	201-069-1
DAB Kit (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Formalin	Sangon Biotech	A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)	Abcam	ab6789	Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)	Abcam	ab6721	Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin	BASO	517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chemistry	KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution	Guangzhou Chemistry	7722-84-1
Methanol	Guangzhou Chemistry	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Neutral balsam	SHANGHAI YIYANG	YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum	BOSTER	AR0009
Paraffin	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldehyde	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chemistry	57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sangon Biotech	200-675-3
Sucrose	Guangzhou Chemistry	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound	SAKURA	SAKURA.4583
Triton X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xylene	Guangzhou Chemistry	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose	Sigma	9012-36-6
Alcohol	Guangzhou Chemistry	64-17-5
Chloroform	Guangzhou Chemistry	865-49-6
Ethidium Bromide	Sangon Biotech	214-984-6
Isopropyl Alcohol	Guangzhou Chemistry	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	-
Taq DNA Polymerase	TAKARA	R10T1
Goldview (nucleic acid stain)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar	OXID	-
Ampicillin	Sigma	69-52-3
Chloramphenicol	Sigma	56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit	Thermo	A36227
Kanamycin	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit	Thermo	L3000015
LR Reaction Kit	Thermo	11791019
Plasmid Extraction Kit	TIANGEN	DP103
Trans5α Chemically Competent Cell	TRANSGEN	CD201-01
Trytone	OXID	-
Yeast Extract	OXID	-
Primers and Sequence	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT	Synbio Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University