Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Resumen

El método tridimensional de cultivo sin suero para células madre adultas de la glándula lagrimal (LG) está bien establecido para la inducción de la formación y diferenciación de organoides LG en células acinares o similares a las ductales.

Resumen

La terapia basada en células madre de la glándula lagrimal (LG) es una estrategia prometedora para las enfermedades de la glándula lagrimal. Sin embargo, la falta de un método de cultivo confiable y libre de suero para obtener un número suficiente de células madre LG (LGSC) es un obstáculo para futuras investigaciones y aplicaciones. El método de cultivo tridimensional (3D), libre de suero para LGSC de ratones adultos está bien establecido y se muestra aquí. Las LGSC podrían ser continuamente pasajeras e inducidas a diferenciarse a células acinares o similares a las ductales.

Para el cultivo primario lgsc, los LGs de ratones de 6-8 semanas de edad fueron digeridos con dispasa, colagenasa I y tripsina-EDTA. Un total de 1 × 10⁴ células individuales fueron sembradas en 80 μL de matriz de células madre de células madre de gel-glándula lagrimal (LGSCM) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM. La mezcla se solidificó después de la incubación durante 20 min a 37 °C, y se agregaron 600 μL de LGSCM.

Para el mantenimiento de LGSC, los LGSC cultivados durante 7 días se desagregaron en células individuales por dispasa y tripsina-EDTA. Las células individuales fueron implantadas y cultivadas de acuerdo con el método utilizado en el cultivo primario LGSC. Las LGSC podrían pasar más de 40 veces y expresar continuamente los marcadores de células madre/progenitoras Krt14, Krt5, P63 y nestina. Las LGSC cultivadas en LGSCM tienen capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en células acinares o ductales in vitro e in vivo.

Introducción

Las células madre de la glándula lagrimal (LGSC) mantienen la renovación celular de la glándula lagrimal (LG) y son la fuente de células acinares y ductales. Por lo tanto, el trasplante lgsc se considera un enfoque alternativo para tratar el daño inflamatorio severo y la enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa (AÑAD)^1,2,3. Se han aplicado varios métodos de cultivo para enriquecer LGSCs. Tiwari et al. separaron y cultivaron células primarias de LG utilizando colágeno I y gel de matriz complementado con varios factores de crecimiento; sin embargo, las células LG no pudieron ser cultivadas continuamente⁴. Utilizando cultivo bidimensional (2D), las células madre derivadas de LG de ratón fueron aisladas por You et ^al.5 y Ackermann et al. ⁶, se encontró que expresa los genes marcadores de células madre / progenitoras, Oct4, Sox2, Nanog y nestina, y podría ser subcultivado. Sin embargo, no hay indicios claros de que estas células puedan diferenciarse en células acinares o ductales, y no existe un experimento de trasplante para verificar el potencial de diferenciación in vivo.

Recientemente, las células c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45^- se aislaron de LIG de ratón mediante citometría de flujo, se encontró que expresaban marcadores de células progenitoras LG, como Pax6 y Runx1, y se diferenciaron en conductos y acini in vitro. En ratones con ADD, la inyección ortotópica con estas células podría reparar las GL dañadas y restaurar la función secretora de las^{GL 2}. Sin embargo, el número de células madre aisladas por este método fue pequeño, y no hay condiciones de cultivo adecuadas para expandir las LGSC aisladas. En resumen, es necesario establecer un sistema de cultivo adecuado para aislar y cultivar eficazmente las LGSC adultas con expansión estable y continua para el estudio de las LGSC en el tratamiento de la ADICIÓN.

Los organoides derivados de células madre o células madre pluripotentes son un grupo de células que son histológicamente similares a los órganos relacionados y pueden mantener su propia renovación. Después de que el organoide del intestino de ratón fue cultivado con éxito por Sato et al. en 2009⁷, se cultivaron organoides de otros órganos en sucesión, según el sistema de cultivo de Sato, como la vesícula biliar⁸, el hígado⁹, el páncreas¹⁰, el estómago¹¹, la mama¹², el pulmón¹³, la próstata¹⁴ y la glándula salival¹⁵ . Debido a la alta proporción de células madre adultas antes de la diferenciación celular en cultivo organoide, el método de cultivo organoide tridimensional (3D) se considera óptimo para el aislamiento y cultivo de células madre adultas de LG.

En el presente estudio se estableció un sistema de cultivo LGSC de ratón adulto mediante la optimización del método de cultivo 3D, libre de suero. Está comprobado que las LGSC cultivadas tanto en ratones normales como en ratones ADDED mostraron una capacidad estable de autorrenovación y proliferación. Después del trasplante en los GL de ratón ADDED, los LGSC colonizaron los LGs deteriorados y mejoraron la producción de lágrimas. Además, se aislaron LGSC fluorescentes rojos de ratones ROSA26^mT/mG y se cultivaron. Este trabajo proporciona una referencia confiable para el enriquecimiento LGSC in vitro y el autoinjerto LGSC en aplicación clínica para la terapia CON ADD.

Protocolo

Todos los experimentos en este protocolo siguieron las pautas de cuidado animal del Comité Ético de Ensayos con Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Todas las operaciones relacionadas con la célula deben realizarse en el banco de trabajo ultralimpio en la sala de operaciones de la celda. Todas las operaciones con xileno deben llevarse a cabo en campanas extractoras.

1. Cultura primaria LGSC

1. Aislamiento LG
   1. Obtenga un ratón macho BALB / c de 6 a 8 semanas de edad y corte la piel detrás de la oreja para exponer el LG y el tejido conectivo que lo rodea. Despegue el tejido conectivo mediante disección roma con la ayuda de pinzas y retire el LG.
   2. Enjuague los LG dos veces con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM para eliminar la sangre en un plato de 6 cm. Sumergir los LGs en un plato de 6 cm con 4 mL de etanol al 75% durante 10 s y enjuagar con 10 mM PBS dos veces inmediatamente.
2. Obtener células individuales de LG
   1. Utilice la solución tampón HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl en agua ultrapura) para preparar 25 U/mL de dispasa. Prepare la solución de colagenasa I al 0,1% con agua ultrapura.
   2. Cortar los LGs en pequeños fragmentos (aproximadamente 1 mm³), transferirlos a un tubo centrífugo estéril de 15 ml y tratar los tejidos con 500 μL de 25 U/mL de dispasa y 500 μL de colagenasa I al 0,1% durante 1 h a 37 °C.
   3. Utilice PBS de 10 mM para preparar la solución de tripsina-EDTA (0,05 g/L de tripsina, 0,04 g/L de EDTA). Trate los fragmentos de LG del paso 1.2.2 con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 10 min a 37 °C y disocie los fragmentos en células individuales mediante pipeteo repetidamente.
   4. Filtre la suspensión a través de un filtro de 70 μm, recoja el filtrado en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 5 min.
   5. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agregue 10 ml de PBS de 10 mM para lavar el pellet celular y centrífuga la suspensión.
   6. Repita el paso 1.2.5, retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F12 (mezcla 1:1 del medio Eagle modificado de Dulbecco y el F-12 de Ham) para resuspendir los gránulos celulares.
3. Cultura primaria LGSC
   1. Prepare el medio de células madre de la glándula lagrimal (LGSCM) que contiene DMEM / F12, 1x suplemento de N2, 1x suplemento de B27, sustituto de glutamina de 2 mM, NEAA de 0.1 mM (aminoácidos no esenciales), factor de crecimiento epidérmico murino (EGF) de 50 ng / ml, factor de crecimiento de fibroblastos de 100 ng / ml 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A y 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK).
   2. Agregue 20 μL de matriz gel-matriz LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1) en el centro del pozo de una placa de 24 pocillos. Use una punta de pipeta para expandirla a un círculo (6-8 mm de diámetro) e incube la mezcla durante 20 min a 37 ° C para recubrir previamente el pozo.
   3. Utilice un contador celular para determinar el número de células y agregue 40 μL de LGSCM con un total de 1 × 10⁴ células en 40 μL del gel de matriz. Mézclelos suavemente con una pipeta para obtener una mezcla de gel de matriz-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1).
   4. Use una pipeta para dejar caer cuidadosamente 80 μL de la mezcla sobre el área prerecubierta en cada pocillo de la placa de 24 pocillos en el paso 1.3.2.
   5. Incubar la mezcla durante 20 min a 37 °C y añadir 600 μL de LGSCM.
   6. Cambie el medio de cultivo en cada pozo una vez cada dos días. Después de 7 días de cultivo, busque esferas LGSC que tengan un diámetro de 100-300 μm bajo el microscopio invertido (ocular: 10x, objetivo: 4x).
      NOTA: Las LGSC se pueden cultivar durante más de 14 días en total.
4. Aislar y cultivar LGSCs primarios de ratones ROSA26^mT/mG y ratones DED (NOD/ShiLtJ) siguiendo los pasos descritos anteriormente.

2. Mantenimiento y paso lgSC

1. Eliminar bien el medio de cultivo de la esfera de cultivo.
2. Desagregar las esferas LGSC cultivadas durante 7 días mediante incubación en 20 μL de 10 U/mL de dispasa y 100 μL de 10 mM PBS durante 30 min a 37 °C.
3. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 4 min. Retire el sobrenadante.
4. Tratar las esferas con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 °C. Agregue 1 ml de inhibidor de tripsina (TI) al 0.05% y pipetee repetidamente para neutralizar la tripsina y disociar las esferas en células individuales.
5. Centrifugar a 150 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante para obtener LGSCs en el pellet. Agregue 1 ml de LGSCM para resuspendir el pellet LGSC.
6. Coloque las celdas individuales como se describe en los pasos 1.3.1 a 1.3.6.

3. Diferenciación LGSC

1. Procedimiento 1: Extender el tiempo de cultivo de lgsCs de 7 a 14 días con el sistema de cultivo LGSC para diferenciación aleatoria.
2. Procedimiento 2: Cambiar la proporción de la mezcla de gel de matriz-LGSCM de 1:1 a 1:2 al comienzo del cultivo LGSC para la diferenciación de células ductales. Sembrar los LGSC en la matriz para la inducción durante 14 días (consulte el paso 1.3).
3. Procedimiento 3: Después del paso, reemplace el LGSCM con la mezcla de suero bovino fetal (FBS) LGSCM-10% para la diferenciación de las células acinares. Inducir la diferenciación durante 14 días.

4. Deshidratación del tejido LG

1. Obtenga tejidos LG (paso 1.1.1) y enjuague los GL con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM en un plato de 6 cm durante 2 min. Mueva los tejidos a una solución de formalina al 10% para su fijación durante 24 h.
2. Enjuague los tejidos fijos con PBS de 10 mM durante 2 minutos para eliminar la formalina y transfiera el tejido a una caja de incrustación de tejido. Coloque la caja de incrustación en el deshidratador automático.
3. Utilice el deshidratador automático para deshidratar los tejidos de la siguiente manera: 70% de etanol, 2 h; 80% etanol, 2 h; 90% etanol, 30 min; 95% etanol, 30 min; etanol absoluto, 30min; etanol absoluto, 2 h; etanol absoluto: mezcla 100% xileno (1: 1), 30 min; 100% xileno, 30 min; 100% xileno, 2 h; 100% xileno: mezcla de parafina (1: 1), 30 min; parafina, 2 h; parafina, 3 h.

5. Deshidratación de organoides/esferas LG

1. Obtenga organoides/esferas LG (pasos 2.1-2.3) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y enjuague los organoides/esferas LG con 1 ml de solución estéril de PBS de 10 mM durante 2 min.
2. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
3. Prepare la solución de paraformaldehído al 4% (PFA) de la siguiente manera: agregue 20 g de PFA a una mezcla de 400 ml de PBS de 10 mM y 40 μL de 1 M de NaOH, agite bien la solución y caliéntela en un baño de agua de 65 ° C durante 2 h hasta que el PFA se disuelva por completo. Después de enfriar a temperatura ambiente, use PBS de 10 mM para compensar el volumen a 500 ml y guárdelo a 4 ° C.
4. Agregue 1 ml de PFA al 4% en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y coloque el tubo en un refrigerador de 4 °C durante al menos 24 h para su fijación.
5. Después de la fijación, centrífuga a 100 × g durante 1 min y retire el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS de 10 mM en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y mezcle suavemente mediante pipeteo durante 2 minutos para enjuagar el PFA. Repita este paso dos veces.
6. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
7. Hidrogel de incrustación de calor para disolver y agregar 50-60 μL de hidrogel de incrustación al pellet organoide/esfera y mezclar. Pipetear la mezcla sobre la parapelícula en forma de gota y espere 5 minutos para que se solidifique a temperatura ambiente.
8. Deshidrate el gel con los organoides/esferas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de la siguiente manera.
   1. Agregue 1 ml de etanol al 50% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso cambiando la concentración de etanol a 70%, 80%, 90%, 95% sucesivamente.
   2. Agregue 1 ml de etanol absoluto al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
   3. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de etanol absoluto y 0,5 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
   4. Agregue 1 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
      NOTA: Los pasos 5.8.5-5.8.6 deben realizarse en un baño de metal a 65 °C.
   5. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de parafina y 0,5 ml de xileno al tubo, espere 30 min a 65 °C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
   6. Agregue 1 ml de parafina al tubo, espere 30 minutos a 65 ° C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso y extienda el tiempo de procesamiento a 1 h.

6. Incrustación y seccionamiento de parafina

1. Incrustación de parafina
   1. Antes de incrustar, encienda la máquina de incrustación y precaliente para derretir la cera de parafina en el tanque de parafina.
   2. Coloque el tejido deshidratado o el gel organoide/esfera en la ranura de la caja de hierro incrustante y coloque la caja de hierro en la parafina de la máquina de incrustación.
   3. Retire la tapa de plástico y coloque la caja de incrustación de plástico en la caja de hierro para cubrirla. Mueva la caja de hierro incrustante a una mesa de enfriamiento.
   4. Después de que la parafina se haya condensado en bloques en la caja de incrustación, retírela de la caja de hierro y córtela directamente o guárdela temporalmente en un refrigerador de 4 ° C.
2. Seccionamiento de parafina
   1. Antes de cortar parafina, preensamble la cortadora de parafina y agregue agua destilada al fregadero de la cortadora para precalentarla. Comience a cortar cuando la temperatura del agua aumente a 42 ° C.
   2. Fije la muestra en la ranura de muestra de la cortadora de parafina. Ajuste el grosor de la sección a 5 μm durante el corte.
   3. Seccionar la muestra continuamente. Fije la sección completamente embaldosada en la corredera antideslizante en el tanque de la cortadora.
   4. Después de la sección, coloque los portaobjetos fijados con tejido de muestra en una incubadora bioquímica a 37 °C para secar durante 24 h. Guarde temporalmente los toboganes en un refrigerador a 4 °C.

7. Tinción de hematoxilina y eosina

1. Derretir las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remojar las secciones en 100% xileno durante 15 min y repetir.
2. Trate las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
3. Trate las secciones con 90% de etanol, 80% de etanol y 70% de etanol en un agitador, cada uno durante 3 min.
4. Tratar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min y 2 min sucesivamente.
5. Manche las secciones en una caja húmeda durante 5 min con 4 mg/ml de solución de hematoxilina. Enjuague las secciones en agua corriente durante 10 min.
6. Agitar las secciones en un agitador primero con agua desionizada durante 2 min y luego con 0.5% -1% de eosina durante 1 min.
7. Agitar las secciones con 70% de etanol, 80% de etanol y 90% de etanol en un agitador durante 3 min (cada uno) sucesivamente. Agitar las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
8. Remoje las secciones en 100% xileno durante 15 min y repita el remojo.
9. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

8. Tinción inmunohistoquímica (IHC)

1. Derrita las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remoje las secciones en 100% xileno durante 10 min y repita este paso dos veces.
2. Agite las secciones en un agitador primero con etanol absoluto, etanol al 90% y etanol al 80% durante 2 minutos (cada uno), sucesivamente, y luego con agua desionizada durante 3 minutos. Repita la agitación con agua desionizada dos veces.
3. Agitar las secciones en un agitador primero con una mezcla de 20 mL de 30% H₂O₂ y 180 mL de metanol durante 10 min y luego agua desionizada durante 5 min. Repita este paso tres veces.
4. Transfiera las secciones al tampón de ácido cítrico precocido (1 L de agua desionizada con 3 g de Na₃C₆H₅O_{7.2H 2}O y 0.4 g C₆H₈O₇, pH 6.0), microondas durante 10 min para mantenerlas en el punto de ebullición subcrítico y enfríe a temperatura ambiente durante 30 min. Agitar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min. Repita este paso tres veces.
5. Agite las secciones con PBS de 10 mM en una coctelera durante 5 minutos y repita este paso tres veces. Encierre el área de tejido en la caja húmeda con un marcador repelente al agua, agregue una gota de suero de cabra no inmune listo para usar para cubrir las muestras y colóquelas a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Retire el suero, agregue anticuerpos primarios a las muestras (consulte la Tabla de materiales) e incube durante la noche a 4 ° C. Retire el anticuerpo primario, agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita este paso de agitación con PBS de 10 mM tres veces.
7. Agregue anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales) para cubrir las muestras e incube en una caja húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita el paso de agitación tres veces.
8. Agregue la solución recién preparada de 0.03-0.05% de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para cubrir las muestras en la caja húmeda y manchar durante 30-90 s. Enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
   NOTA: Controle el tiempo de tinción observando bajo un microscopio de luz hasta que aparezca el color amarillo.
9. Agregue 4 mg/ml de solución de hematoxilina para cubrir las muestras, manche durante 5 minutos en una caja húmeda y enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
10. Agitar las secciones en un agitador con 80% de etanol, 90% de etanol y etanol absoluto durante 2 min cada uno, sucesivamente, y remojar las secciones en 100% de xileno durante 30 min.
11. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

9. Tinción global de inmunofluorescencia de organoides/esferas

NOTA: Recoja los organoides/esferas fijados con una solución de PFA al 4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (consulte los pasos 5.1 a 5.4). Realice el etiquetado de fluorescencia de la siguiente manera.

1. Deshidrate los organoides/esferas añadiendo 1 ml de solución de sacarosa al 30% al tubo e incube durante la noche en un refrigerador a 4 °C.
2. Añadir 100 μL de solución de PBST (solución de PBS de 10 mM con Tritón X-100 al 0,1%) al tubo para enjuagar los organoides/esferas durante 5 min, centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min, y recoger el pellet. Repita este paso tres veces.
3. Agregue 0.5-1 ml de suero de cabra no inmune listo para usar al tubo y séllelo a temperatura ambiente durante 1 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
4. Agregue varias gotas de anticuerpo primario diluido para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 ° C durante 48 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
5. Repita el paso 9.2.
6. Agregue varias gotas de un anticuerpo secundario fluorescente y una solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) al tubo para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 °C durante 24 h, evitando la luz.
7. Repita el paso 9.2, evitando la luz.
8. Añadir 100 μL de solución de PBST al tubo y almacenarlo temporalmente en un frigorífico de 4 °C, lejos de la luz. Observe y fotografíe los organoides/esferas utilizando el microscopio de barrido de láminas de luz.

10. Transfección LGSC pLX-mCherry

NOTA: La producción de partículas lentivirales debe realizarse en un gabinete de bioseguridad y un banco limpio a nivel de bioseguridad BSL2.

1. Cultive la célula de empaquetamiento del lentivirus 293T en una placa de 6 pocillos con DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂ durante 3-5 días para alcanzar el 80% de confluencia celular.
2. Transfectar el vector de lentivirus pLX-mCherry en LGSCs.
   NOTA: La preparación del reactivo está indicada para un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   1. Prepare dos tubos centrífugos estériles de 1,5 ml y agregue 250 μL de DMEM/F12 a cada tubo.
   2. Agregue 7.5 μL de reactivo de transfección a un tubo y mezcle bien el reactivo mediante pipeteo.
   3. Añadir 2 μg de plásmido pLX-mCherry sin endotoxina y plásmido de empaquetamiento de lentivirus en otro tubo, y añadir el reactivo de transfección (2 μL/μg de plásmido).
   4. Mezcle el líquido en ambos tubos de centrífuga y deje reposar las mezclas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   5. Retire el medio de cultivo de las células 293T y agregue la mezcla desde el paso 10.2.4 hasta las células 293T. Cambie el medio de cultivo a DMEM fresco + 10% FBS después de 8 h.
   6. Después de 48 h, recoja el sobrenadante del virus por primera vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm. Después de 72 h, recoja el sobrenadante del virus por segunda vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm nuevamente.
      NOTA: Guarde ambos sobrenadantes filtrados en hielo hasta la transducción del lentivirus.
3. Obtenga los LGSC de ratones DED (NOD/ShiLtJ) (consulte el paso 1).
4. Agregue 1 ml del sobrenadante premontado pLX-mCherry lentivirus para resuspend las células.
5. Coloque el tubo de la centrífuga en un agitador en la incubadora de CO₂ a 37 °C. Agítelo a 100 rpm para maximizar el contacto entre el lentivirus y las células. Después de 8 h, centrifugar la mezcla a 250 × g durante 4 min y retirar el sobrenadante.
6. Añadir 1 ml de DMEM/F12 para resuspendir el pellet celular. Utilice un contador celular para determinar el número de células y sembrar un total de 1 × 10⁴ células en 100 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM (ver paso 1.3.2).
7. Después de 7 días de cultivo (ver paso 1), seleccione esferas que exhiban fluorescencia roja bajo un microscopio de fluorescencia para expandir el cultivo.

11. Trasplante ortotópico LGSC

NOTA: Todas las operaciones quirúrgicas se realizan en una sala de operaciones de SPF y todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan.

1. Obtener las esferas LGSC de ratones ROSA26^mT/mG con fluorescencia roja (td-Tomate) o transfección mCherry cultivada durante 7 días (ver paso 1).
2. Enfríe un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga una mezcla 1:1 de gel de matriz y DMEM/F12 sobre hielo antes de usarlo. Digiera las esferas LGSC en células individuales y resuspenda las células a una densidad de 2 × 10⁶ células / ml en el tubo.
3. Anestesiar a los ratones NOD/ShiLtJ mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
   NOTA: El ratón NOD / ShiLtJ es un modelo ideal con síntomas idiopáticos añadidos, que incluyen secreción lagrimal reducida, infiltración inflamatoria y ulceración orbitaria.
4. Después de la anestesia, use solución salina o ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad, y luego use tijeras oftálmicas para hacer un corte de 5-8 mm en la piel detrás de la oreja (cerca del ojo) de los ratones anestésicos para exponer los GL.
   NOTA: El yodóforo debe usarse estrictamente para la desinfección alrededor de la incisión.
5. Inyecte 2 × 10⁴ celdas en el LG del lado izquierdo e inyecte la mezcla sin células (consulte el paso 11.2) en el LG del lado derecho como control.
6. Después de la inyección, restaure los LG a sus posiciones originales con fórceps oftálmicos y suture la herida. Alimente a los ratones durante 2 meses y observe el efecto del tratamiento.
   NOTA: El material del cojín de la jaula también debe esterilizarse estrictamente después de la operación, y el material del cojín debe reemplazarse una vez al día. Después de suturar la herida, el tramadol se puede inyectar selectivamente en la vena de la cola de los ratones a la dosis estándar de 2,5 mg / kg para lograr la analgesia.
7. Anestesiar a estos ratones 2 meses después del experimento (ver paso 11.3). Filmar los síntomas de la región ocular.
   1. Durante la anestesia, busque los siguientes síntomas: relajación muscular del cuello y las extremidades; respiración profunda, lenta y constante; estrechamiento de la pupila; desaparición del reflejo corneal.
   2. Durante la anestesia y la operación, mantenga la temperatura corporal de los ratones a 37 ° C. Después de la cirugía, agregue antibióticos apropiados al agua potable para ratones para reducir el riesgo de infección de la herida. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. No devuelva los ratones que se han sometido a cirugía a la compañía de otros ratones hasta que se recuperen por completo.
   3. Después de filmar los síntomas de la región ocular, abra el software ImageJ, haga clic en Archivo | Abrir | Selecciones a mano alzada, mantenga presionado el botón izquierdo del mouse y seleccione el área de ulceración orbitaria en la imagen. Haga clic en Analizar | Medida para obtener el área relativa de ulceración.
8. Coloque el hilo de algodón rojo fenol en el canto lateral de los ratones anestésicos durante 10 s; medir y registrar la longitud de la parte descolorida del hilo de algodón. Eutanasiar a los ratones por dislocación de la vértebra cervical después de la medición del desgarro.
9. Diseccionar los ratones y obtener los LGs para el análisis de IHC.

12. Aislamiento de ARN

NOTA: Antes del experimento, preenfríe la centrífuga a 4 °C y garantice que todos los reactivos y consumibles estén libres de contaminación por RNAse.

1. Recoja LGSC o fragmentos de LG en un tubo de microcentrífuga. Agregue 1 ml de tampón de lisis celular y lisar completamente las células o tejidos por oscilación de vórtice.
2. Agregue 0.2 ml de cloroformo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos después de la oscilación del vórtice durante 1 minuto. Centrifugadora durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
   NOTA: Después de la centrifugación, el líquido se divide en tres capas, y el ARN se encuentra en la fase acuosa transparente superior.
3. Pipetee cuidadosamente la fase acuosa transparente superior y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga libre de RNAse de 1,5 ml.
4. Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico y mezclar suavemente. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min y luego centrífuga durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
5. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de etanol al 75%. Invierta el tubo para lavar el pellet y centrífuga durante 5 min a 4 °C, 7.500 × g. Repita este paso.
6. Retire el sobrenadante con cuidado y coloque el tubo de la centrífuga en el banco de trabajo ultralimpio para secarlo durante unos 20 minutos.
   NOTA: Continúe con el siguiente paso cuando el pellet blanco se vuelva translúcido. Realizar todas las operaciones sobre hielo.
7. Agregue 20 μL de agua libre de RNAse para disolver el pellet por completo. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) y almacene la solución de ARN a -80 °C.

13. PCR

1. Reacción de transcripción inversa
   1. Añadir 1 μg de ARN total (calcular el volumen de la solución de ARN añadida según la concentración de la solución de ARN) en el tubo de reacción de PCR e incubar a 65 °C durante 5 min para la desnaturalización.
   2. Póngalo en hielo durante 1 minuto y luego agregue agua libre de enzimas hasta que el volumen total alcance los 12 μL. Agregue 4 μL de 4x DNA Master Mix e incube a 37 ° C durante 5 min.
   3. Coloque el tubo en hielo, agregue 4 μL de 5x RT Master Mix y mézclelo suavemente. Ajuste los siguientes ajustes de PCR: 37 °C durante 15 min, 50 °C durante 5 min, 98 °C durante 5 min, 4 °C durante 1 min.
   4. Guárdelo a -20 °C o continúe con el siguiente paso después de que se complete la reacción de transcripción inversa.
2. Reacción por PCR
   1. Prepare la reacción de PCR en el tubo de PCR de la siguiente manera: 14,1 μL de agua libre de enzimas, 2 μL de dNTP, 2 μL de 10x Buffer, 0,8 μL de Primer (10 μM, 0,4 μL de Forward Primer y 0,4 μL de Reverse Primer, consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de cDNA de transcripción inversa (consulte el paso 13.1) y 0.1 μL de enzima Taq.
   2. Coloque la reacción de PCR preparada en el aparato de PCR para PCR. Consulte las instrucciones del kit de enzimas Taq para el procedimiento de PCR (consulte la Tabla de materiales).
3. Electroforesis en gel de agarosa
   1. Utilice una balanza analítica para pesar 242 g de Tris y 37,2 g de Na₂EDTA·2H₂O y agréguelos a un vaso de precipitados de 1 L. Agregue ~ 800 ml de agua desionizada y 57.1 ml de ácido acético glacial al vaso de precipitados, mezcle bien, agregue agua desionizada a 1 L para obtener un tampón TAE 50x y guárdelo a temperatura ambiente.
      NOTA: Diluya el tampón TAE 50x con agua desionizada antes de su uso.
   2. Utilice una balanza analítica para pesar 1,2 g de agarosa y agréguela a un matraz cónico que contenga 80 ml de 1 tampón TAE. Calentar repetidamente en el horno de microondas hasta que se disuelva por completo.
   3. Enfríe el matraz con agua corriente del grifo hasta que la temperatura de la solución baje a 60 °C. Agregue 8 μL de tinción de ácido nucleico, vierta la solución en el tanque gelatinizante después de mezclar bien, coloque el peine y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Saque el peine y cargue los productos de PCR en el gel de agarosa preparado. Realizar electroforesis a 120 V durante 30 min.
   5. Coloque el gel en el sistema de imágenes ECL Gel y fotografíe.

Resultados

Establecer un sistema de cultivo 3D sin suero
En este estudio, se desarrolló LGSCM que contiene EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSC de ratón, y los LGSC se aislaron y cultivaron con éxito mediante un método de cultivo 3D (Figura 1A). Un exitoso sistema de cultivo 3D, libre de suero de LGSCs de ratones C57BL / 6, ratones NOD / ShiLtJ, ratones BALB / c y ratones ROSA26^{mT / mG} se ha establecido utilizando este método¹⁶. Para un rató...

Discusión

Existen métodos bien establecidos para el aislamiento y el cultivo in vitro de células madre lagrimales para el cultivo de células madre lagrimales y la reparación de lesiones LG. Shatos et ^al.17 y Ackermannet al. ⁶ células madre lagrimales cultivadas y subcultivadas con éxito de ratas y ratones mediante métodos de cultivo 2D, respectivamente, lo que permite trasplantar células madre lagrimales para el tratamiento del TDA. Los estudios sobre célul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG	Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance	Sartorius
Automatic dehydrator	Thermo
Blood counting chamber	BLAU
Cell Counter	CountStar
CO2 constant temperature incubator	Thermo
ECL Gel imaging system	GE healthcare
Electric bath for water bath	Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus	BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument	Roche
Frozen tissue slicer	Lecia
Horizontal centrifuge	CENCE
Inverted fluorescence microscope	Nikon
Inverted microscope	Olympus
Laser lamellar scanning micrograph	Carl Zeiss
Liquid nitrogen container	Thermo
Low temperature high speed centrifuge	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Microwave oven	Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo	measure RNA concentration
Paraffin slicing machine	Thermo
PCR Amplifier	Eppendorf
pH value tester	Sartorius
4 °C Refrigerator	Haier
Thermostatic culture oscillator	ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument	Thermo
-80°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
-20°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
Ultra pure water purification system	ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodium	Sigma	57-33-0
Cell Culture
B27	Gibco	17504044
Collagenase I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Foetal Bovine Serum	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Human FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Murine Noggin	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
Murine EGF	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondin 1	PeproTech	120-38
Trypsin Inhibitor (TI)	Sigma	T6522	Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-21202	Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-21206	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-10037	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-10042	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody	Abcam	ab104751	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody	Abcam	ab11512	Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody	Abcam	ab181595	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody	Abcam	ab15580	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody	Abcam	ab125096	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody	Abcam	ab167453	Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Citric Acid	Sangon Biotech	201-069-1
DAB Kit (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Formalin	Sangon Biotech	A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)	Abcam	ab6789	Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)	Abcam	ab6721	Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin	BASO	517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chemistry	KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution	Guangzhou Chemistry	7722-84-1
Methanol	Guangzhou Chemistry	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Neutral balsam	SHANGHAI YIYANG	YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum	BOSTER	AR0009
Paraffin	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldehyde	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chemistry	57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sangon Biotech	200-675-3
Sucrose	Guangzhou Chemistry	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound	SAKURA	SAKURA.4583
Triton X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xylene	Guangzhou Chemistry	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose	Sigma	9012-36-6
Alcohol	Guangzhou Chemistry	64-17-5
Chloroform	Guangzhou Chemistry	865-49-6
Ethidium Bromide	Sangon Biotech	214-984-6
Isopropyl Alcohol	Guangzhou Chemistry	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	-
Taq DNA Polymerase	TAKARA	R10T1
Goldview (nucleic acid stain)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar	OXID	-
Ampicillin	Sigma	69-52-3
Chloramphenicol	Sigma	56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit	Thermo	A36227
Kanamycin	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit	Thermo	L3000015
LR Reaction Kit	Thermo	11791019
Plasmid Extraction Kit	TIANGEN	DP103
Trans5α Chemically Competent Cell	TRANSGEN	CD201-01
Trytone	OXID	-
Yeast Extract	OXID	-
Primers and Sequence	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT	Synbio Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University