Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

Résumé

La méthode de culture tridimensionnelle sans sérum pour les cellules souches de la glande lacrymale adulte (LG) est bien établie pour l’induction de la formation d’organoïdes LG et la différenciation en cellules acineuses ou canalaires.

Résumé

La thérapie à base de cellules souches de la glande lacrymale (LG) est une stratégie prometteuse pour les maladies de la glande lacrymale. Cependant, l’absence d’une méthode de culture fiable et sans sérum pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches LG (LGSC) est un obstacle à la poursuite de la recherche et de l’application. La méthode de culture tridimensionnelle (3D) sans sérum pour les LGSC de souris adultes est bien établie et montrée ici. Les LGSC pourraient être continuellement passés et induits à se différencier en cellules acineuses ou canalaires.

Pour la culture primaire lgsc, les LG de souris âgées de 6 à 8 semaines ont été digérées avec de la dispase, de la collagénase I et de la trypsine-EDTA. Au total, 1 × 10⁴ cellules uniques ont été ensemencées dans 80 μL de matrice gel-milieu de cellules souches de glande lacrymale (LGSCM) dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, prélaquée avec 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM. Le mélange a été solidifié après incubation pendant 20 min à 37 °C, et 600 μL de LGSCM ajoutés.

Pour l’entretien des LGSC, les LGSC cultivés pendant 7 jours ont été désagrégés en cellules individuelles par dispase et trypsine-EDTA. Les cellules individuelles ont été implantées et cultivées selon la méthode utilisée dans la culture primaire LGSC. Les LGSC pourraient être passés plus de 40 fois et exprimer en continu les marqueurs de cellules souches / progénitrices Krt14, Krt5, P63 et nestin. Les LGSC cultivés dans LGSCM ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires in vitro et in vivo.

Introduction

Les cellules souches des glandes lacrymales (LGSC) maintiennent le renouvellement cellulaire des glandes lacrymales (LG) et sont la source de cellules acineuses et canalaires. Par conséquent, la transplantation de LGSC est considérée comme une approche alternative pour traiter les lésions inflammatoires graves et la sécheresse oculaire aqueusement déficiente (ADD)^1,2,3. Plusieurs méthodes de culture ont été appliquées pour enrichir les LGSC. Tiwari et al. ont séparé et cultivé des cellules LG primaires à l’aide de collagène I et de gel matriciel complété par plusieurs facteurs de croissance; cependant, les cellules LG n’ont pas pu être cultivées en continu⁴. En utilisant une culture bidimensionnelle (2D), des cellules souches dérivées de LG de souris ont été isolées par You et ^al.5 et Ackermann et al. ⁶, qui exprime les gènes marqueurs des cellules souches /progénitrices, Oct4, Sox2, Nanog et nestin, et pourrait être sous-cultivé. Cependant, il n’y a pas d’indication claire que ces cellules peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires, et il n’y a pas d’expérience de transplantation pour vérifier le potentiel de différenciation in vivo.

Récemment, des cellules c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45^- ont été isolées à partir de LG de souris par cytométrie en flux, s’exprimant des marqueurs de cellules progénitrices LG, tels que Pax6 et Runx1, et différenciées en canaux et acini in vitro. Chez les souris atteintes d’ADD, l’injection orthotopique avec ces cellules pourrait réparer les LG endommagés et restaurer la fonction sécrétoire des LG². Cependant, le nombre de cellules souches isolées par cette méthode était faible et il n’existe pas de conditions de culture appropriées pour l’expansion des LGSC isolés. En résumé, un système de culture approprié doit être mis en place pour isoler et cultiver efficacement les LGSC adultes avec une expansion stable et continue pour l’étude des LGSC dans le traitement de l’ADD.

Les organoïdes dérivés de cellules souches ou de cellules souches pluripotentes sont un groupe de cellules qui sont histologiquement similaires aux organes apparentés et peuvent maintenir leur propre renouvellement. Après que l’organoïde de l’intestin de souris a été cultivé avec succès par Sato et al. en 2009⁷, des organoïdes d’autres organes ont été cultivés successivement, sur la base du système de culture de Sato, tels que la vésicule biliaire⁸, le foie⁹, le pancréas¹⁰, l’estomac¹¹, le sein¹², le poumon¹³, la prostate¹⁴ et la glande salivaire¹⁵ . En raison de la forte proportion de cellules souches adultes avant la différenciation cellulaire en culture organoïde, la méthode de culture organoïde tridimensionnelle (3D) est considérée comme optimale pour l’isolement et la culture de cellules souches adultes de LG.

Un système de culture LGSC de souris adultes a été établi dans la présente étude en optimisant la méthode de culture 3D sans sérum. Il est prouvé que les LGSC cultivés à partir de souris normales et ajoutées ont montré une capacité stable d’auto-renouvellement et de prolifération. Après la transplantation dans les LG de souris ADDED, les LGSC ont colonisé les LG altérés et amélioré la production de larmes. De plus, des LGSC fluorescents rouges ont été isolés à partir de souris ROSA26^mT/mG et cultivés. Ce travail fournit une référence fiable pour l’enrichissement en LGSC in vitro et l’autogreffe LGSC en application clinique pour la thérapie ADDED.

Protocole

Toutes les expériences de ce protocole ont suivi les directives de soins aux animaux du Comité d’éthique sur les essais sur les animaux de l’Université Sun Yat-sen. Toutes les opérations liées aux cellules doivent être effectuées sur l’établi ultrapropre dans la salle d’opération de la cellule. Toutes les opérations utilisant du xylène doivent être effectuées dans des hottes.

1. Culture primaire LGSC

1. Isolation LG
   1. Obtenez une souris mâle BALB/c de 6 à 8 semaines et coupez la peau derrière l’oreille pour exposer le LG et le tissu conjonctif qui l’entoure. Décollez le tissu conjonctif par dissection contondante à l’aide d’une pince à épiler et retirez le LG.
   2. Rincez les LG deux fois avec 4 mL de solution stérile de PBS de 10 mM pour éliminer le sang dans un plat de 6 cm. Immerger les LG dans un plat de 6 cm avec 4 mL d’éthanol à 75% pendant 10 s et rincer deux fois immédiatement avec du PBS de 10 mM.
2. Obtenir des cellules uniques de LG
   1. Utiliser la solution tampon HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4 ; 150 mM de NaCl dans de l’eau ultrapure) pour préparer 25 U/mL de dispase. Préparer la solution de collagénase I à 0,1% avec de l’eau ultrapure.
   2. Couper les LG en petits fragments (environ 1 mm³), les transférer dans un tube centrifuge stérile de 15 mL et traiter les tissus avec 500 μL de dispase 25 U/mL et 500 μL de collagénase I pendant 1 h à 37 °C.
   3. Utiliser 10 mM de PBS pour préparer une solution de trypsine-EDTA (0,05 g/L de trypsine, 0,04 g/L d’EDTA). Traiter les fragments LG de l’étape 1.2.2 avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 10 min à 37 °C et dissocier les fragments en cellules individuelles en pipetant à plusieurs reprises.
   4. Filtrer la suspension à travers un filtre de 70 μm, recueillir le filtrat dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL et centrifuger à 150 × g pendant 5 min.
   5. Après centrifugation, retirer le surnageant, ajouter 10 mL de PBS de 10 mM pour laver la pastille de cellule et centrifuger la suspension.
   6. Répétez l’étape 1.2.5, retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de DMEM/F12 (mélange 1:1 du milieu Eagle modifié de Dulbecco et du F-12 de Ham) pour remettre en suspension les pastilles cellulaires.
3. Culture primaire LGSC
   1. Préparer le milieu de cellules souches de la glande lacrymale (LGSCM) contenant du DMEM/F12, 1x supplément de N2, 1x supplément de B27, 2 mM de substitut de glutamine, 0,1 mM de NEA (acides aminés non essentiels), 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique murin (EGF), 100 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 10 (FGF10), 10 ng/mL de Wnt3A et 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK).
   2. Ajouter 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM (gel matriciel : LGSCM = 1:1) au centre du puits d’une plaque de 24 puits. Utilisez une pointe de pipette pour l’étendre à un cercle (6-8 mm de diamètre) et incuber le mélange pendant 20 min à 37 °C pour prélaquer le puits.
   3. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules et ajoutez 40 μL de LGSCM avec un total de 1 × 10⁴ cellules dans 40 μL du gel matriciel. Mélangez-les doucement avec une pipette pour obtenir un mélange matrice gel-LGSCM (gel matriciel : LGSCM= 1:1).
   4. Utilisez une pipette pour laisser tomber soigneusement 80 μL du mélange sur la zone prélaquée dans chaque puits de la plaque de 24 puits à l’étape 1.3.2.
   5. Incuber le mélange pendant 20 min à 37 °C et ajouter 600 μL de LGSCM.
   6. Changez le milieu de culture dans chaque puits une fois tous les deux jours. Après 7 jours de culture, recherchez des sphères LGSC de 100 à 300 μm de diamètre au microscope inversé (oculaire: 10x, objectif: 4x).
      REMARQUE: Les LGSC peuvent être cultivés pendant plus de 14 jours au total.
4. Isoler et mettre en culture des LGSC primaires de souris ROSA26^mT/mG et de souris DED (NOD/ShiLtJ) en suivant les étapes décrites ci-dessus.

2. Entretien et passage lgSC

1. Retirez bien le milieu de culture de la culture de la sphère.
2. Désagréger les sphères LGSC cultivées pendant 7 jours par incubation dans 20 μL de dispase 10 U/mL et 100 μL de PBS 10 mM pendant 30 min à 37 °C.
3. Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et centrifuger à 150 × g pendant 4 min. Retirez le surnageant.
4. Traiter les sphères avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 1 mL d’inhibiteur de la trypsine (TI) à 0,05 % et pipeter à plusieurs reprises pour neutraliser la trypsine et dissocier les sphères en cellules individuelles.
5. Centrifuger à 150 × g pendant 5 min et retirer le surnageant pour obtenir des LGSC dans la pastille. Ajouter 1 mL de LGSCM pour remettre en suspension la pastille LGSC.
6. Plaquez les cellules individuelles comme décrit aux étapes 1.3.1 à 1.3.6.

3. Différenciation LGSC

1. Procédure 1: Prolonger le temps de culture des LGSC de 7 à 14 jours avec le système de culture LGSC pour une différenciation aléatoire.
2. Procédure 2: Modifier le rapport du mélange matrice gel-LGSCM de 1:1 à 1:2 au début de la culture LGSC pour la différenciation des cellules canalaires. Ensemencez les LGSC dans la matrice pour l’induction pendant 14 jours (voir l’étape 1.3).
3. Procédure 3: Après le passage, remplacez le LGSCM par le mélange de sérum fœtal bovin (FBS) LGSCM-10% pour la différenciation des cellules acineuses. Induire une différenciation pendant 14 jours.

4. Déshydratation des tissus LG

1. Obtenir des tissus LG (étape 1.1.1) et rincer les LG avec 4 mL de solution stérile de PBS de 10 mM dans un plat de 6 cm pendant 2 min. Déplacer les tissus vers une solution de formol à 10% pour la fixation pendant 24 h.
2. Rincez les tissus fixes avec 10 mM de PBS pendant 2 min pour enlever le formol et transférez le tissu dans une boîte d’incorporation de tissus. Placez la boîte d’intégration dans le déshydrateur automatique.
3. Utilisez le déshydrateur automatique pour déshydrater les tissus comme suit: 70% d’éthanol, 2 h; 80% d’éthanol, 2 h; 90% d’éthanol, 30 min; 95% d’éthanol, 30 min; éthanol absolu, 30min; éthanol absolu, 2 h; éthanol absolu: mélange 100% xylène (1: 1), 30 min; 100% xylène, 30 min; 100% xylène, 2 h; 100% xylène: mélange de paraffine (1: 1), 30 min; paraffine, 2 h; paraffine,3 h.

5. Déshydratation organoïde/sphère LG

1. Obtenir les organoïdes/sphères LG (étapes 2.1-2.3) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et rincer les organoïdes/sphères LG avec 1 mL de solution stérile de PBS de 10 mM pendant 2 min.
2. Centrifuger à 100 × g pendant 1 min et retirer le surnageant.
3. Préparer la solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % comme suit : ajouter 20 g de PFA à un mélange de 400 mL de 10 mM de PBS et 40 μL de 1 M de NaOH, bien agiter la solution et chauffer au bain-marie à 65 °C pendant 2 h jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous. Après refroidissement à température ambiante, utilisez 10 mM de PBS pour porter le volume à 500 mL et le stocker à 4 °C.
4. Ajouter 1 mL de PFA à 4 % dans le tube de microcentrifugation avec la pastille organoïde/sphère et placer le tube dans un réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 24 h pour la fixation.
5. Après fixation, centrifuger à 100 × g pendant 1 min et retirer le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS de 10 mM dans le tube de microcentrifugation avec la pastille organoïde/sphère et mélanger doucement par pipetage pendant 2 min pour rincer le PFA. Répétez cette étape deux fois.
6. Centrifuger à 100 × g pendant 1 min et retirer le surnageant.
7. Incorporer à la chaleur l’hydrogel pour dissoudre et ajouter 50 à 60 μL d’hydrogel d’incorporation à la pastille organoïde/sphère et mélanger. Pipettez le mélange sur le parafilm sous forme de gouttelette et attendez 5 min pour qu’il se solidifie à température ambiante.
8. Déshydratez le gel avec les organoïdes/sphères dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL comme suit.
   1. Ajouter 1 mL d’éthanol à 50 % dans le tube, attendre 30 min à température ambiante et retirer le liquide du tube par pipetage. Répétez cette étape en changeant successivement la concentration d’éthanol à 70%, 80%, 90%, 95%.
   2. Ajouter 1 mL d’éthanol absolu au tube, attendre 30 min à température ambiante et retirer le liquide du tube par pipetage. Répétez cette étape.
   3. Ajouter 1 mL d’un mélange de 0,5 mL d’éthanol absolu et 0,5 mL de xylène à 100 % dans le tube, attendre 30 min à température ambiante et retirer le liquide du tube par pipetage.
   4. Ajouter 1 mL de xylène à 100% dans le tube, attendre 30 min à température ambiante et retirer le liquide du tube par pipetage. Répétez cette étape.
      REMARQUE: Les étapes 5.8.5 à 5.8.6 doivent être effectuées dans un bain métallique à 65 ° C.
   5. Ajouter 1 mL d’un mélange de 0,5 mL de paraffine et 0,5 mL de xylène à 100 % dans le tube, attendre 30 min à 65 °C et retirer le liquide du tube par pipetage.
   6. Ajouter 1 mL de paraffine au tube, attendre 30 min à 65 °C et retirer le liquide du tube par pipetage. Répétez cette étape et prolongez le temps de traitement à 1 h.

6. Intégration et sectionnement de la paraffine

1. Intégration de paraffine
   1. Avant l’encastrement, allumez la machine d’encastrement et préchauffez-la pour faire fondre la cire de paraffine dans le réservoir de paraffine.
   2. Placez le tissu déshydraté ou le gel organoïde/sphère dans la rainure de la boîte en fer d’intégration et mettez la boîte en fer dans la paraffine de la machine d’encastrement.
   3. Retirez le couvercle en plastique et placez la boîte d’encastrement en plastique sur la boîte en fer pour la couvrir. Déplacez la boîte de fer d’intégration sur une table de refroidissement.
   4. Une fois que la paraffine s’est condensée en blocs dans la boîte d’encastrement, retirez-la de la boîte en fer et coupez-la directement en tranches ou conservez-la temporairement dans un réfrigérateur à 4 °C.
2. Sectionnement de paraffine
   1. Avant de trancher la paraffine, préasassemblez la trancheuse à paraffine et ajoutez de l’eau distillée à l’évier de la trancheuse pour le préchauffage. Commencez à trancher lorsque la température de l’eau atteint 42 °C.
   2. Fixez l’échantillon sur la fente d’échantillon de la trancheuse de paraffine. Réglez l’épaisseur de la section à 5 μm pendant le tranchage.
   3. Coupez l’échantillon en continu. Fixez la section entièrement carrelée sur la glissière antidérapante dans le réservoir de la trancheuse.
   4. Après le sectionnement, placer les lames fixées avec l’échantillon de tissu dans un incubateur biochimique à 37 °C pour séchage pendant 24 h. Conserver temporairement les lames au réfrigérateur à 4 °C.

7. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

1. Faire fondre les sections de paraffine à 60 °C pendant 30 min, faire tremper les sections dans du xylène à 100 % pendant 15 min et répéter.
2. Traiter les sections avec de l’éthanol absolu sur un shaker pendant 5 min.
3. Traiter les sections avec 90% d’éthanol, 80% d’éthanol et 70% d’éthanol sur un shaker, chacune pendant 3 min.
4. Traiter les sections avec de l’eau désionisée sur un shaker pendant 5 min et 2 min successivement.
5. Tacher les sections sur une boîte humide pendant 5 min avec une solution d’hématoxyline de 4 mg/mL. Rincez les sections à l’eau courante pendant 10 min.
6. Agiter les sections sur un shaker d’abord avec de l’eau désionisée pendant 2 min, puis avec 0,5% -1% d’éosine pendant 1 min.
7. Agiter les sections avec 70% d’éthanol, 80% d’éthanol et 90% d’éthanol sur un agitateur pendant 3 min (chacune) successivement. Agiter les sections avec de l’éthanol absolu sur un agitateur pendant 5 min.
8. Faire tremper les sections dans du xylène à 100% pendant 15 min et répéter le trempage.
9. Utilisez une pipette ou un compte-gouttes pour ajouter 3 à 4 gouttes de baume neutre à la glissière et couvrez-la lentement avec une glissière de couverture. Séchez les glissières à température ambiante.

8. Coloration immunohistochimique (IHC)

1. Faire fondre les sections de paraffine à 60 °C pendant 30 min, faire tremper les sections dans du xylène à 100 % pendant 10 min et répéter cette étape deux fois.
2. Agiter les sections sur un agitateur d’abord avec de l’éthanol absolu, de l’éthanol à 90% et de l’éthanol à 80% pendant 2 min (chacune), successivement, puis avec de l’eau désionisée pendant 3 min. Répétez l’agitation avec de l’eau désionisée deux fois.
3. Agiter les sections sur un agitateur d’abord avec un mélange de 20 mL de 30%_H2O2et 180 mL de méthanol pendant 10 min puis de l’eau désionisée pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
4. Transférer les sections dans un tampon d’acide citrique préboilé (1 L d’eau désionisée avec₃g de Na 3 C₆H₅O_{7,2H 2}O et 0,4 g C₆H₈O₇, pH 6,0), micro-ondes pendant 10 min pour les maintenir au point d’ébullition sous-critique et refroidir à température ambiante pendant 30 min. Agiter les sections avec de l’eau désionisée sur un shaker pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
5. Agiter les sections avec 10 mM pbS sur un agitateur pendant 5 min, et répéter cette étape trois fois. Entourez la zone tissulaire de la boîte humide d’un marqueur hydrofuge, ajoutez une goutte de sérum de chèvre non immun prêt à l’emploi pour couvrir les échantillons et placez-les à température ambiante pendant 1 h.
6. Retirer le sérum, ajouter des anticorps primaires aux échantillons (voir le tableau des matériaux) et les incuber pendant la nuit à 4 °C. Retirez l’anticorps primaire, agitez les sections avec 10 mM de PBS sur un agitateur pendant 5 min et répétez cette étape d’agitation avec 10 mM de PBS trois fois.
7. Ajouter un anticorps secondaire (voir la table des matériaux) pour couvrir les échantillons et les incuber sur une boîte humide pendant 30 min à température ambiante. Agiter les sections avec 10 mM de PBS sur un agitateur pendant 5 min et répéter l’étape d’agitation trois fois.
8. Ajouter la solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) fraîchement préparée à 0,03-0,05% pour couvrir les échantillons sur la boîte humide et tacher pendant 30-90 s. Rincez les sections à l’eau courante pendant 10 min.
   REMARQUE: Contrôlez le temps de coloration en observant au microscope optique jusqu’à ce que la couleur jaune apparaisse.
9. Ajouter 4 mg/mL de solution d’hématoxyline pour couvrir les échantillons, tacher pendant 5 min sur une boîte humide et rincer les sections à l’eau courante pendant 10 min.
10. Agiter les sections sur un agitateur avec 80% d’éthanol, 90% d’éthanol et éthanol absolu pendant 2 min chacune, successivement, et faire tremper les sections dans du xylène à 100% pendant 30 min.
11. Utilisez une pipette ou un compte-gouttes pour ajouter 3 à 4 gouttes de baume neutre à la glissière et couvrez-la lentement avec une glissière de couverture. Séchez les glissières à température ambiante.

9. Coloration globale par immunofluorescence des organoïdes/sphères

REMARQUE : Recueillir les organoïdes/sphères fixés avec une solution de PFA à 4 % dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (voir les étapes 5.1 à 5.4). Effectuez l’étiquetage de fluorescence comme suit.

1. Déshydrater les organoïdes/sphères en ajoutant 1 mL de solution de saccharose à 30 % au tube et l’incuber pendant la nuit au réfrigérateur à 4 °C.
2. Ajouter 100 μL de solution PBST (solution PBS 10 mM avec 0,1% de Triton X-100) au tube pour rincer les organoïdes/sphères pendant 5 min, centrifuger le tube à 100 × g pendant 1 min, et recueillir la pastille. Répétez cette étape trois fois.
3. Ajouter 0,5 à 1 mL de sérum de chèvre non immun prêt à l’emploi dans le tube et le sceller à température ambiante pendant 1 h. Centrifuger le tube à 100 × g pendant 1 min et recueillir la pastille.
4. Ajouter plusieurs gouttes d’anticorps primaire dilué pour simplement couvrir la pastille et incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant 48 h. Centrifuger le tube à 100 × g pendant 1 min et recueillir la pastille.
5. Répétez l’étape 9.2.
6. Ajouter plusieurs gouttes d’un anticorps secondaire fluorescent et une solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) au tube pour simplement couvrir la pastille et incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant 24 h, en évitant la lumière.
7. Répétez l’étape 9.2 en évitant la lumière.
8. Ajouter 100 μL de solution pbST au tube et le conserver temporairement dans un réfrigérateur à 4 °C, à l’abri de la lumière. Observez et photographiez les organoïdes/sphères à l’aide du microscope à balayage à feuille de lumière.

10. Transfection LGSC pLX-mCherry

REMARQUE: La production de particules lentivirales doit être effectuée dans une armoire de biosécurité et un banc propre au niveau de biosécurité BSL2.

1. Cultiver la cellule d’emballage du lentivirus 293T dans une plaque à 6 puits avec DMEM + 10% FBS à 37 °C, 5% CO₂ pendant 3-5 jours pour atteindre 80% de confluence cellulaire.
2. Transfecter le vecteur lentivirus pLX-mCherry en LGSC.
   REMARQUE: La préparation du réactif est indiquée pour un puits d’une plaque de 6 puits.
   1. Préparer deux tubes centrifuges stériles de 1,5 mL et ajouter 250 μL de DMEM/F12 à chaque tube.
   2. Ajouter 7,5 μL de réactif de transfection dans un tube et bien mélanger le réactif par pipetage.
   3. Ajouter 2 μg de plasmide pLX-mCherry sans endotoxine et le plasmide d’emballage de lentivirus correspondant dans un autre tube, et ajouter le réactif de transfection (2 μL/μg de plasmide).
   4. Mélanger le liquide dans les deux tubes de centrifugeuse et laisser reposer les mélanges pendant 5 min à température ambiante.
   5. Retirer le milieu de culture des cellules 293T et ajouter le mélange de l’étape 10.2.4 aux cellules 293T. Changer le milieu de culture en DMEM frais + 10% FBS après 8 h.
   6. Après 48 h, collectez le surnageant du virus pour la première fois et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 μm. Après 72 h, collectez le surnageant du virus pour la deuxième fois et filtrez-le à nouveau à travers un filtre de 0,45 μm.
      REMARQUE: Conservez les deux surnageants filtrés sur de la glace jusqu’à la transduction du lentivirus.
3. Obtenez les LGSC de souris DED (NOD/ShiLtJ) (voir étape 1).
4. Ajouter 1 mL du surnageant du lentivirus pLX-mCherry précolté pour remettre les cellules en suspension.
5. Placer le tube de centrifugeuse sur un agitateur dans l’incubateur à CO₂ à 37 °C. Agitez-le à 100 tr/min pour maximiser le contact entre le lentivirus et les cellules. Après 8 h, centrifuger le mélange à 250 × g pendant 4 min et retirer le surnageant.
6. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 pour remettre en suspension la pastille de cellule. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules et ensemencez un total de 1 × 10⁴ cellules en 100 μL de matrice gel-LGSCM (gel matriciel : LGSCM = 1:1) dans chaque puits d’une plaque de 24 puits prélaquée de 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM (voir étape 1.3.2).
7. Après 7 jours de culture (voir étape 1), sélectionnez des sphères présentant une fluorescence rouge sous un microscope à fluorescence pour étendre la culture.

11. Transplantation orthotopique LGSC

REMARQUE: Toutes les opérations chirurgicales sont effectuées dans une salle d’opération SPF et tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés.

1. Obtenir les sphères LGSC de souris ROSA26^mT/mG à fluorescence rouge (td-Tomato) ou à transfection mCherry cultivées pendant 7 jours (voir étape 1).
2. Refroidir un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant un mélange 1:1 de gel matriciel et de DMEM/F12 sur de la glace avant utilisation. Digérer les sphères LGSC en cellules individuelles et remettre les cellules en suspension à une densité de 2 × 10⁶ cellules/mL dans le tube.
3. Anesthésier les souris NOD/ShiLtJ par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg).
   REMARQUE: La souris NOD / ShiLtJ est un modèle idéal avec des symptômes idiopathiques AJOUTÉS, y compris une réduction de la sécrétion lacrymale, une infiltration inflammatoire et une ulcération orbitaire.
4. Après l’anesthésie, utilisez une solution saline ou une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse, puis utilisez des ciseaux ophtalmiques pour faire une coupe de 5 à 8 mm dans la peau derrière l’oreille (près de l’œil) des souris anesthésiques pour exposer les LG.
   REMARQUE: Iodophor doit être strictement utilisé pour la désinfection autour de l’incision.
5. Injectez 2 × 10⁴ cellules dans le LG du côté gauche et injectez le mélange sans cellules (voir l’étape 11.2) dans le LG du côté droit comme contrôle.
6. Après l’injection, rétablissez les LG à leur position d’origine avec une pince ophtalmique et suturez la plaie. Nourrissez les souris pendant 2 mois et observez l’effet du traitement.
   REMARQUE: Le matériau du coussin de la cage doit également être strictement stérilisé après l’opération et le matériau du coussin doit être remplacé une fois par jour. Après avoir guéri la plaie, le tramadol peut être injecté sélectivement dans la veine caudale de souris à la dose standard de 2,5 mg / kg pour obtenir une analgésie.
7. Anesthésiez ces souris 2 mois après l’expérience (voir étape 11.3). Filmez les symptômes de la région oculaire.
   1. Pendant l’anesthésie, recherchez les symptômes suivants: relaxation musculaire du cou et des membres; respiration profonde, lente et régulière; rétrécissement de la pupille; disparition du réflexe cornéen.
   2. Pendant l’anesthésie et l’opération, maintenir la température corporelle des souris à 37 °C. Après la chirurgie, ajoutez des antibiotiques appropriés à l’eau potable pour les souris afin de réduire le risque d’infection de la plaie. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale. Ne retournez pas les souris qui ont subi une intervention chirurgicale à la compagnie d’autres souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.
   3. Après avoir filmé les symptômes de la région oculaire, ouvrez le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier | Ouvrir | Sélections à main levée, maintenez le bouton gauche de la souris enfoncé et sélectionnez la zone d’ulcération orbitale dans l’image. Cliquez sur Analyser | Mesure pour obtenir la zone relative d’ulcération.
8. Mettre le fil de coton rouge phénol sur le canthus latéral des souris anesthésiques pendant 10 s; mesurer et enregistrer la longueur de la partie décolorée du fil de coton. Euthanasier les souris par luxation des vertèbres cervicales après mesure des déchirures.
9. Disséquez les souris et obtenez les LG pour l’analyse IHC.

12. Isolement de l’ARN

REMARQUE: Avant l’expérience, prérefroidir la centrifugeuse à 4 ° C et garantir que tous les réactifs et consommables sont exempts de contamination par l’ARN.

1. Collectez les LGSC ou les fragments de LG dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 1 mL de tampon de lyse cellulaire et lyser complètement les cellules ou les tissus par oscillation vortex.
2. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et laisser reposer à température ambiante pendant 10 min après l’oscillation du vortex pendant 1 min. Centrifugeuse pendant 15 min à 4 °C, 12 000 × g.
   REMARQUE: Après centrifugation, le liquide est divisé en trois couches et l’ARN est dans la phase aqueuse transparente la plus élevée.
3. Pipeter soigneusement la phase aqueuse transparente supérieure et la transférer dans un nouveau tube de centrifugeuse sans ARNis de 1,5 mL.
4. Ajouter un volume égal d’alcool isopropylique et mélanger doucement. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant 10 min, puis centrifuger pendant 15 min à 4 °C, 12 000 × g.
5. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol à 75 %. Inverser le tube pour laver la pastille et centrifuger pendant 5 min à 4 °C, 7 500 × g. Répétez cette étape.
6. Retirez soigneusement le surnageant et placez le tube de centrifugeuse dans l’établi ultrapropre pour le sécher pendant environ 20 min.
   REMARQUE: Passez à l’étape suivante lorsque la pastille blanche devient translucide. Effectuer toutes les opérations sur la glace.
7. Ajouter 20 μL d’eau sans ARNi pour dissoudre complètement la pastille. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux) et stocker la solution d’ARN à -80 °C.

13. PCR

1. Réaction de transcription inverse
   1. Ajouter 1 μg d’ARN total (calculer le volume de la solution d’ARN ajoutée en fonction de la concentration de la solution d’ARN) dans le tube de réaction PCR et incuber à 65 °C pendant 5 min pour la dénaturation.
   2. Mettez-le sur de la glace pendant 1 min, puis ajoutez de l’eau sans enzyme jusqu’à ce que le volume total atteigne 12 μL. Ajoutez 4 μL de 4x DNA Master Mix et incubez-le à 37 °C pendant 5 min.
   3. Mettez le tube sur de la glace, ajoutez 4 μL de 5x RT Master Mix et mélangez-le doucement. Réglez les paramètres PCR suivants : 37 °C pendant 15 min, 50 °C pendant 5 min, 98 °C pendant 5 min, 4 °C pendant 1 min.
   4. Conservez-le à -20 °C ou passez à l’étape suivante une fois la réaction de transcription inverse terminée.
2. Réaction pcr
   1. Préparez la réaction de PCR dans le tube de PCR comme suit : 14,1 μL d’eau sans enzyme, 2 μL de dNTP, 2 μL de 10x Buffer, 0,8 μL d’Amorce (10 μM, 0,4 μL d’Amorce avant et 0,4 μL d’Amorce inverse, voir la Table des matériaux), 1 μL d’ADNc de transcription inverse (voir l’étape 13.1) et 0,1 μL d’enzyme Taq.
   2. Placez la réaction PCR préparée dans l’appareil PCR pour PCR. Reportez-vous aux instructions du kit d’enzymes Taq pour la procédure de PCR (voir le tableau des matériaux).
3. Électrophorèse sur gel d’agarose
   1. Utiliser une balance analytique pour peser 242 g de Tris et 37,2 g de Na₂EDTA·2H₂O et les ajouter à un bécher de 1 L. Ajouter ~800 mL d’eau désionisée et 57,1 mL d’acide acétique glacial au bécher, bien mélanger, ajouter de l’eau désionisée à 1 L pour obtenir un tampon TAE 50x et le stocker à température ambiante.
      REMARQUE: Diluer le tampon TAE 50x avec de l’eau désionisée avant utilisation.
   2. Utilisez une balance analytique pour peser 1,2 g d’agarose et ajoutez-la à une fiole conique contenant 80 mL de tampon TAE 1x. Chauffez-le à plusieurs reprises dans le four à micro-ondes jusqu’à dissolution complète.
   3. Refroidir la fiole sous l’eau courante du robinet jusqu’à ce que la température de la solution tombe à 60 °C. Ajouter 8 μL de colorant d’acide nucléique, verser la solution dans le réservoir de gélatinisation après avoir bien mélangé, placer le peigne et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
   4. Retirez le peigne et chargez les produits PCR dans le gel d’agarose préparé. Effectuer une électrophorèse à 120 V pendant 30 min.
   5. Placez le gel dans le système d’imagerie ECL Gel et photographiez.

Résultats

Établir un système de culture 3D sans sérum
Dans cette étude, lgSCM contenant EGF, Wnt3A, FGF10 et Y-27632 pour les LGSC de souris a été développé, et les LGSC ont été isolés et cultivés avec succès par une méthode de culture 3D (Figure 1A). Un système de culture 3D sans sérum de LGSC de souris C57BL/6, de souris NOD/ShiLtJ, de souris BALB/c et de souris ROSA26^mT/mG a été établi à l’aide de cette méthode¹⁶. Pour un...

Discussion

Il existe des méthodes bien établies pour l’isolement et la culture in vitro de cellules souches lacrymales pour la culture de cellules souches lacrymales et la réparation des lésions LG. Shatos et ^al.17 et Ackermannet al. ⁶ cellules souches lacrymales cultivées et sous-cultivées avec succès de rats et de souris par des méthodes de culture 2D, respectivement, permettant de transplanter des cellules souches lacrymales pour le traitement de l’ADD...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG	Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance	Sartorius
Automatic dehydrator	Thermo
Blood counting chamber	BLAU
Cell Counter	CountStar
CO2 constant temperature incubator	Thermo
ECL Gel imaging system	GE healthcare
Electric bath for water bath	Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus	BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument	Roche
Frozen tissue slicer	Lecia
Horizontal centrifuge	CENCE
Inverted fluorescence microscope	Nikon
Inverted microscope	Olympus
Laser lamellar scanning micrograph	Carl Zeiss
Liquid nitrogen container	Thermo
Low temperature high speed centrifuge	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Microwave oven	Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo	measure RNA concentration
Paraffin slicing machine	Thermo
PCR Amplifier	Eppendorf
pH value tester	Sartorius
4 °C Refrigerator	Haier
Thermostatic culture oscillator	ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument	Thermo
-80°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
-20°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
Ultra pure water purification system	ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodium	Sigma	57-33-0
Cell Culture
B27	Gibco	17504044
Collagenase I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Foetal Bovine Serum	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Human FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Murine Noggin	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
Murine EGF	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondin 1	PeproTech	120-38
Trypsin Inhibitor (TI)	Sigma	T6522	Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-21202	Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-21206	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-10037	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-10042	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody	Abcam	ab104751	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody	Abcam	ab11512	Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody	Abcam	ab181595	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody	Abcam	ab15580	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody	Abcam	ab125096	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody	Abcam	ab167453	Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Citric Acid	Sangon Biotech	201-069-1
DAB Kit (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Formalin	Sangon Biotech	A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)	Abcam	ab6789	Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)	Abcam	ab6721	Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin	BASO	517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chemistry	KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution	Guangzhou Chemistry	7722-84-1
Methanol	Guangzhou Chemistry	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Neutral balsam	SHANGHAI YIYANG	YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum	BOSTER	AR0009
Paraffin	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldehyde	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chemistry	57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sangon Biotech	200-675-3
Sucrose	Guangzhou Chemistry	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound	SAKURA	SAKURA.4583
Triton X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xylene	Guangzhou Chemistry	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose	Sigma	9012-36-6
Alcohol	Guangzhou Chemistry	64-17-5
Chloroform	Guangzhou Chemistry	865-49-6
Ethidium Bromide	Sangon Biotech	214-984-6
Isopropyl Alcohol	Guangzhou Chemistry	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	-
Taq DNA Polymerase	TAKARA	R10T1
Goldview (nucleic acid stain)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar	OXID	-
Ampicillin	Sigma	69-52-3
Chloramphenicol	Sigma	56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit	Thermo	A36227
Kanamycin	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit	Thermo	L3000015
LR Reaction Kit	Thermo	11791019
Plasmid Extraction Kit	TIANGEN	DP103
Trans5α Chemically Competent Cell	TRANSGEN	CD201-01
Trytone	OXID	-
Yeast Extract	OXID	-
Primers and Sequence	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT	Synbio Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University