JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטת התרבית התלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת דמעה בוגרת (LG) מבוססת היטב על אינדוקציה של היווצרות והתמיינות של אורגנואידים LG לתאים דמויי אצינר או צינור.

Abstract

טיפול מבוסס תאי גזע בבלוטת הדמעות (LG) הוא אסטרטגיה מבטיחה למחלות בלוטות הדמעות. עם זאת, היעדרה של שיטת תרבית אמינה ונטולת סרום להשגת מספר מספיק של תאי גזע LG (LGSCs) הוא מכשול אחד למחקר ויישום נוספים. שיטת התרבות התלת-ממדית (התלת-ממדית) ללא סרום עבור LGSCs של עכברים בוגרים מבוססת היטב ומוצגת כאן. ניתן היה להעביר את ה-LGSCs באופן רציף ולגרום להם להתמיין לתאים דמויי אצינר או דמויי צינור.

עבור התרבות העיקרית של LGSC, LGs מעכברים בני 6-8 שבועות עוכלו עם דיספנס, קולגן I וטריפסין-EDTA. בסך הכל 1 × 104 תאים בודדים נזרעו לתוך 80 μL של מטריצה ג'ל-בלוטת דמעה של מטריצה בלוטת גזע בינונית (LGSCM) בכל באר של צלחת 24 בארות, מצופה מראש עם 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה. התערובת התמצקה לאחר הדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-600 μL של LGSCM נוספו.

לצורך תחזוקת LGSC, LGSCs בתרבית במשך 7 ימים פורקו לתאים בודדים על ידי פירוק וטריפסין-EDTA. התאים הבודדים הושתלו ותרבית על פי השיטה ששימשה בתרבית הראשונית של LGSC. LGSCs יכולים לעבור למעלה מ-40 פעמים ולבטא באופן רציף סמני תאי גזע/אב Krt14, Krt5, P63 ונסטין. LGSCs בתרבית LGSCM הם בעלי יכולת התחדשות עצמית ויכולים להתמיין לתאים דמויי אצינר או צינור במבחנה וב-in vivo.

Introduction

תאי גזע של בלוטת הדמעות (LGSCs) שומרים על התחדשות תאי בלוטת הדמעות (LG) והם המקור לתאי אצינר ותאים דוקטליים. לכן, השתלת LGSC נחשבת לגישה חלופית לטיפול בנזק דלקתי חמור ובמחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי (ADDED)1,2,3. מספר שיטות תרבית יושמו כדי להעשיר את הלהט"בים. Tiwari et al. הפרידו ותרבית תאי LG ראשוניים בתרבית באמצעות קולגן I וג'ל מטריקס בתוספת מספר גורמי גדילה; עם זאת, תאי LG לא יכלו להיות בתרבית רציפה4. באמצעות תרבית דו-ממדית (דו-ממדית), תאי גזע שמקורם בעכבר LG בודדו על ידי You et al.5 ו-Ackermann et al. 6, שנמצא כמבטא את הגנים של סמן תאי גזע/אב, Oct4, Sox2, Nanog ו-nestin, וניתן היה לתת-תרבות. עם זאת, אין אינדיקציה ברורה לכך שתאים אלה יכולים להתמיין לתאי אצינר או צינור, ואין ניסוי השתלה כדי לאמת את פוטנציאל ההתמיינות in vivo.

לאחרונה, תאי c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- בודדו מתאי LGs של עכברים על ידי ציטומטריית זרימה, נמצאו כמבטאים סמני תאי אב LG, כגון Pax6 ו-Runx1, והתמיינו לתעלות ואצ'יני במבחנה. בעכברים עם ADDED, הזרקה אורתוטופית עם תאים אלה יכולה לתקן LGs פגומים ולשחזר את תפקוד ההפרשה של LGs2. עם זאת, מספר תאי הגזע שבודדו בשיטה זו היה קטן, ואין תנאי תרבית מתאימים להרחבת הלהט"בים המבודדים. לסיכום, יש להקים מערכת תרביות מתאימה כדי לבודד ולתרבות ביעילות LGSCs בוגרים עם התרחבות יציבה ומתמשכת לחקר LGSCs בטיפול ב- ADDED.

אורגנואידים המופקים מתאי גזע או מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם קבוצה של תאים הדומים מבחינה היסטולוגית לאיברים הקשורים ויכולים לשמור על התחדשות משלהם. לאחר שהאורגנואיד של מעי העכבר תרבית בהצלחה על ידי Sato et al. בשנת 20097, אורגנואידים מאיברים אחרים הועתקו ברצף, בהתבסס על מערכת התרבית של סאטו, כגון כיס המרה8, כבד9, לבלב10, קיבה11, שד12, ריאה13, ערמונית14 ובלוטת הרוק15 . בשל השיעור הגבוה של תאי גזע בוגרים לפני התמיינות תאים בתרבית אורגנואידים, שיטת תרבית האורגנואידים התלת-ממדית (3D) נחשבת אופטימלית לבידוד ולתרבית של תאי גזע בוגרים של LG.

מערכת תרבית LGSC של עכבר בוגר הוקמה במחקר הנוכחי על ידי אופטימיזציה של שיטת התרבות התלת-ממדית, ללא סרום. הוכח כי הלהט"בים שעברו תרבית הן מעכברים רגילים והן מעכברים שנוספו הראו יכולת יציבה של התחדשות עצמית והתפשטות. לאחר השתלה ב-LGs של העכברים הנוספו, LGSCs התיישבו ב-LGs הפגומים ושיפרו את ייצור הקרעים. בנוסף, LGSCs פלואורסצנטיים אדומים בודדו מעכברי ROSA26mT/mG ועברו תרבית. עבודה זו מספקת התייחסות אמינה להעשרת LGSC במבחנה ול- LGSC autograft ביישום קליני לטיפול נוסף.

Protocol

כל הניסויים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים של הוועדה האתית לניסוי בבעלי חיים של אוניברסיטת סון יאט-סן. כל הפעולות הקשורות לתאים יבוצעו על שולחן העבודה האולטרה-קליאני בחדר הניתוח של התא. כל הפעולות באמצעות קסילן אמורות להתבצע במנדפי אדים.

1. התרבות הראשונית של LGSC

  1. בידוד LG
    1. השיגו עכבר זכר BALB/c בן 6-8 שבועות, וחתכו את העור מאחורי האוזן כדי לחשוף את ה-LG ואת רקמת החיבור סביבו. מקלפים את רקמת החיבור על ידי כריתה קהה בעזרת פינצטה ומסירים את ה- LG.
    2. יש לשטוף את ה-LGs פעמיים עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM כדי להסיר דם בצלחת של 6 ס"מ. מטבלים את ה-LGs במנה של 6 ס"מ עם 4 מ"ל של 75% אתנול למשך 10 שניות ושוטפים עם 10 mM PBS פעמיים באופן מיידי.
  2. השג תאים בודדים של LG
    1. השתמש בתמיסת חיץ HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl במים אולטרה-אפורים) כדי להכין 25 U/mL dispase. הכינו את תמיסת ה-0.1% קולגן I עם מים אולטרה-פוריים.
    2. חותכים את ה-LGs לרסיסים קטנים (כ-1 מ"מ3), מעבירים אותם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל, ומטפלים ברקמות עם 500 μL של 25 U/mL dispase ו-500 μL של 0.1% collagenase I למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש ב- 10 mM PBS כדי להכין תמיסת טריפסין-EDTA (0.05 גרם / ל' טריפסין, 0.04 גרם / ל' EDTA). טפל בשברי LG משלב 1.2.2 עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ונתק את השברים לתאים בודדים על ידי צנרת שוב ושוב.
    4. מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 70 מיקרומטר, אוספים את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 5 דקות.
    5. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט, הוסף 10 מ"ל של 10 mM PBS כדי לשטוף את גלולת התא, וצנטריפוגה את המתלים.
    6. חזור על שלב 1.2.5, הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 (תערובת 1:1 של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו ו- F-12 של Ham) כדי להחיות את כדורי התא.
  3. התרבות הראשונית של LGSC
    1. הכן את מדיום תאי הגזע של בלוטת הדמעות (LGSCM) המכיל DMEM/F12, תוסף N2 1x, תוסף B27 1x, תחליף גלוטמין 2 mM, 0.1 mM NEAAs (חומצות אמינו לא חיוניות), 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי מורין מורין (EGF), 100 ננוגרם/מ"ל פיברובלסט גורם גדילה 10 (FGF10), 10 ננוגרם/מ"ל Wnt3A ו-10 μM Y-27632 (מעכב ROCK).
    2. הוסף 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) במרכז הבאר של צלחת 24 באר. השתמש בקצה פיפטה כדי להרחיב אותו לעיגול (קוטר 6-8 מ"מ) ולדגום את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעגל את הבאר.
    3. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולהוסיף 40 μL של LGSCM עם סך של 1 × 104 תאים לתוך 40 μL של ג'ל המטריצה. מערבבים אותם בעדינות עם פיפטה כדי לקבל תערובת מטריצה ג'ל-LGSCM (ג'ל מטריצה: LGSCM= 1:1).
    4. השתמשו בפיפטה כדי להפיל בזהירות 80 μL מהתערובת על פני האזור המצופה מראש בכל באר של צלחת 24 הבארות בשלב 1.3.2.
    5. דגירה של התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוספת 600 μL של LGSCM.
    6. שנה את המדיום התרבותי בכל באר פעם ביומיים. לאחר 7 ימים של תרבית, חפשו כדורי LGSC בקוטר 100-300 מיקרומטר תחת המיקרוסקופ ההפוך (עינית: 10x, מטרה: 4x).
      הערה: LGSCs יכולים להיות מתורבתים במשך יותר מ -14 ימים בסך הכל.
  4. לבודד ולתרבות LGSCs ראשוניים של עכברי ROSA26mT/mG ועכברי DED (NOD/ShiLtJ) בעקבות השלבים שתוארו לעיל.

2. תחזוקה ומעבר של LGSC

  1. הסר היטב את המדיום התרבותי מתרבות התחום.
  2. לפרק את כדורי LGSC תרבית במשך 7 ימים על ידי דגירה ב 20 μL של 10 U / mL dispase ו 100 μL של 10 mM PBS במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  3. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 4 דקות. הסר את ה-supernatant.
  4. טפל בכדורים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות ב 37 °C (74 °F). הוסיפו 1 מ"ל של מעכב טריפסין 0.05% (TI) ופיפטה שוב ושוב כדי לנטרל את הטריפסין ולנתק את הכדורים לתאים בודדים.
  5. צנטריפוגה ב 150 × g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant כדי לקבל LGSCs בכדור. הוסיפו 1 מ"ל של LGSCM כדי לבצע החייאה של גלולת LGSC.
  6. צלחת התאים הבודדים כמתואר בשלבים 1.3.1 עד 1.3.6.

3. בידול LGSC

  1. נוהל 1: הארכת זמן התרבות של LGSCs מ-7 ל-14 יום עם מערכת התרבות LGSC להבחנה אקראית.
  2. הליך 2: שנה את היחס בין תערובת המטריצה ג'ל-LGSCM מ-1:1 ל-1:2 בתחילת תרבית ה-LGSC לצורך התמיינות תאי צינור. זרעו את ה-LGSCs לתוך המטריצה לצורך אינדוקציה למשך 14 יום (עיין בשלב 1.3).
  3. הליך 3: לאחר המעבר, החליפו את ה-LGSCM בתערובת סרום בקר עוברי (FBS) LGSCM-10% לצורך התמיינות של תאים אסינאריים. לגרום להבחנה במשך 14 יום.

4. התייבשות רקמות LG

  1. להשיג רקמות LG (שלב 1.1.1) ולשטוף את LGs עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית 10 mM בצלחת 6 ס"מ במשך 2 דקות. העבירו את הרקמות לתמיסת פורמלין של 10% לקיבוע למשך 24 שעות.
  2. יש לשטוף את הרקמות הקבועות ב-10 mM PBS למשך 2 דקות כדי להסיר את הפורמלין, ולהעביר את הרקמה לתיבת הטבעת רקמות. שים את תיבת ההטבעה לתוך מייבש הכביסה האוטומטית.
  3. השתמש במתייבש האוטומטי כדי לייבש את הרקמות כדלקמן: 70% אתנול, 2 שעות; 80% אתנול, 2 שעות; 90% אתנול, 30 דקות; 95% אתנול, 30 דקות; אתנול מוחלט, 30 דקות; אתנול מוחלט, 2 שעות; אתנול מוחלט: 100% קסילן (1: 1) תערובת, 30 דקות; 100% קסילן, 30 דקות; 100% קסילן, 2 שעות; 100% קסילן: פרפין (1: 1) תערובת, 30 דקות; פרפין, 2 שעות; פרפין,3 ח.

5. התייבשות אורגנואידית/כדורית LG

  1. השג אורגנואידים/כדורים של LG (שלבים 2.1-2.3) בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל ושטוף את האורגנואידים/כדורים של LG עם 1 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM למשך 2 דקות.
  2. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
  3. הכן את הפתרון 4% paraformaldehyde (PFA) כדלקמן: להוסיף 20 גרם של PFA לתערובת של 400 מ"ל של 10 mM PBS ו 40 μL של 1 M NaOH, לנער את הפתרון היטב, ולחמם אותו באמבט מים 65 °C במשך 2 שעות עד PFA מומס לחלוטין. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, השתמש ב- 10 mM PBS כדי להגדיל את הנפח ל- 500 מ"ל ולאחסן אותו ב- 4 °C (76 °F).
  4. הוסיפו 1 מ"ל של 4% PFA לתוך צינור microcentrifuge עם הכדור האורגנואידי/כדורי והכניסו את הצינור למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לקיבוע.
  5. לאחר הקיבוע, צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של 10 mM PBS לתוך צינור microcentrifuge עם כדור האורגנואיד/כדור ומערבבים בעדינות על ידי צנרת למשך 2 דקות כדי לשטוף את ה-PFA. חזור על שלב זה פעמיים.
  6. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
  7. מחממים את ההידרוג'ל להטבעה כדי להתמוסס ומוסיפים 50-60 μL של הטבעת הידרוג'ל לכדור האורגנואיד/כדור ולתערובת. מקטרים את התערובת על הפרפילם בצורה של טיפה ומחכים 5 דקות עד שהיא תתמצק בטמפרטורת החדר.
  8. ייבשו את הג'ל עם האורגנואידים/כדורים בצינור מיקרוצנטריפוג' חדש של 1.5 מ"ל באופן הבא.
    1. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אתנול לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה על ידי שינוי ריכוז האתנול ל-70%, 80%, 90%, 95% ברצף.
    2. מוסיפים 1 מ"ל של אתנול מוחלט לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
    3. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של אתנול מוחלט ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
    4. מוסיפים 1 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
      הערה: שלבים 5.8.5-5.8.6 חייבים להתבצע באמבט מתכת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    5. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של פרפין ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
    6. מוסיפים 1 מ"ל של פרפין לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה והאריך את זמן העיבוד לשעה אחת.

6. הטבעה וחתך של פרפין

  1. הטמעת פרפין
    1. לפני ההטבעה, הפעילו את מכונת ההטבעה וחממו אותה מראש כדי להמיס את שעוות הפרפין במיכל הפרפין.
    2. מניחים את הרקמה המיובשת או את ג'ל האורגנואיד/כדור לתוך החריץ של קופסת הברזל המוטמעת, ומכניסים את קופסת הברזל לתוך הפרפין של מכונת ההטבעה.
    3. הסירו את מכסה הפלסטיק והניחו את קופסת ההטבעה מפלסטיק על קופסת הברזל כדי לכסות אותה. הזז את תיבת הברזל המוטמעת לשולחן קירור.
    4. לאחר שהפרפין התעבה לבלוקים בתיבת ההטבעה, הסר אותו מקופסת הברזל ופרוס אותו ישירות או אחסן אותו באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
  2. חתך פרפין
    1. לפני חיתוך הפרפין, הרכיבו מראש את פרוסת הפרפין והוסיפו מים מזוקקים לכיור של החתך לחימום מקדים. התחילו לחתוך כאשר טמפרטורת המים עולה ל-42 מעלות צלזיוס.
    2. תקן את המדגם בחריץ המדגם של פרוסת הפרפין. התאם את עובי המקטע ל- 5 מיקרומטר במהלך החיתוך.
    3. חתך את המדגם ברציפות. תקן את החלק המרוצפת במלואה בשקופית האנטי-סליק במיכל הפריסה.
    4. לאחר החתך, מניחים את השקופיות המודבקות עם רקמת דגימה באינקובטור ביוכימי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך 24 שעות. אחסנו באופן זמני את השקופיות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

7. צביעת המטוקסילין ואוזין

  1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות, וחוזרים על הפעולה.
  2. התייחסו לקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
  3. טפלו בקטעים עם 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול על שייקר, כל אחד למשך 3 דקות.
  4. טפלו בקטעים במים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות ו-2 דקות ברצף.
  5. הכתימו את החלקים על קופסה רטובה למשך 5 דקות בתמיסת המטוקסילין במינון 4 מ"ג/מ"ל. שוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
  6. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 2 דקות ולאחר מכן עם 0.5%-1% eosin למשך דקה אחת.
  7. התסיסו את הקטעים עם 70% אתנול, 80% אתנול ו-90% אתנול על שייקר במשך 3 דקות (כל אחד) ברצף. להתסיס את הקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
  8. משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות וחוזרים על ההשריה.
  9. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

8. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC)

  1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 10 דקות, וחוזרים על שלב זה פעמיים.
  2. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם אתנול מוחלט, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 2 דקות (כל אחד), ברצף, ולאחר מכן עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 3 דקות. חזור על התסיסה עם מים שעברו דה-יוניזציה פעמיים.
  3. תסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם תערובת של 20 מ"ל של 30% H2O2 ו-180 מ"ל של מתנול למשך 10 דקות ולאחר מכן הוציאו מים למשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  4. מעבירים את החלקים למאגר חומצה ציטרית מקודם (1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה עם 3 גרם של Na3C6H5O7.2H 2O ו-0.4 גרם C6H8O7, pH 6.0), מיקרוגל למשך 10 דקות כדי לשמור אותם בנקודת רתיחה תת-קריטית, וקירור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. התסיסו את הקטעים עם מים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  5. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב זה שלוש פעמים. צרפו את אזור הרקמה בקופסה הרטובה בטוש דוחה מים, הוסיפו טיפה של סרום עזים לא מוכן לשימוש לכיסוי הדגימות, והניחו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  6. הסירו את הסרום, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לדגימות (ראו טבלת החומרים), והדגרו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן העיקרי, התסיס את החלקים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזור על שלב התסיסה הזה עם 10 mM PBS שלוש פעמים.
  7. הוסיפו נוגדנים משניים (ראו טבלת החומרים) כדי לכסות את הדגימות ולדגום אותן על קופסה רטובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב התסיסה שלוש פעמים.
  8. הוסיפו תמיסת 0.03-0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) שהוכנה טרייה כדי לכסות את הדגימות על הקופסה הרטובה ואת הכתם במשך 30-90 שניות. שטפו את החלקים במים זורמים במשך 10 דקות.
    הערה: שלוט בזמן ההכתמה על-ידי תצפית תחת מיקרוסקופ אור עד להופעת הצבע הצהוב.
  9. מוסיפים תמיסת המטוקסילין 4 מ"ג/מ"ל לכיסוי הדגימות, מכתימים למשך 5 דקות על קופסה רטובה ושוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
  10. התסיסו את הקטעים על שייקר עם 80% אתנול, 90% אתנול ואתנול מוחלט למשך 2 דקות כל אחד, ברצף, והשרו את החלקים ב-100% קסילן למשך 30 דקות.
  11. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

9. צביעה אימונופלואורסצנטית גלובלית של אורגנואידים/כדורים

הערה: אסוף את האורגנואידים/כדורים הקבועים בתמיסת PFA של 4% בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל (ראו שלבים 5.1 עד 5.4). בצע את התיוג הפלואורסצנטי באופן הבא.

  1. לייבש את האורגנואידים/כדורים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% לצינור ולדגום אותו למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 100 μL של תמיסת PBST (תמיסת 10 mM PBS עם 0.1% Triton X-100) לצינור כדי לשטוף את האורגנואידים / הכדורים במשך 5 דקות, צנטריפוגה של הצינור ב 100 × גרם למשך דקה אחת, ולאסוף את הכדור. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  3. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של סרום עזים לא-אימוני מוכן לשימוש לצינור ואטמו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. צנטריפוגה את הצינור ב 100 × g במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
  4. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן ראשוני מדולל כדי לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. צנטריפוגה הצינור ב 100 × גרם במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
  5. חזור על שלב 9.2.
  6. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן משני פלואורסצנטי ותמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לצינור כדי פשוט לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, תוך הימנעות מאור.
  7. חזור על שלב 9.2, תוך הימנעות מאור.
  8. הוסיפו תמיסת PBST של 100 μL לצינור ואחסנו אותה באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס, הרחק מהאור. צפו וצלמו את האורגנואידים/כדורים באמצעות מיקרוסקופ סריקת יריעות האור.

10. LGSC pLX-m צ'רי טרנספקציה

הערה: ייצור של חלקיקים lentiviral חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית וספסל נקי ברמת בטיחות ביולוגית BSL2.

  1. תרבית את תא האריזה של lentivirus 293T בצלחת של 6 בארות עם DMEM + 10% FBS ב-37 °C, 5% CO2 במשך 3-5 ימים כדי להגיע ל-80% מפגש תאים.
  2. תעבירו את וקטור ה-lentivirus pLX-mCherry ל-LGSCs.
    הערה: הכנת ריאגנטים מסומנת עבור באר אחת של צלחת 6 בארות.
    1. הכינו שני צינורות צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והוסיפו 250 μL של DMEM/F12 לכל צינור.
    2. הוסיפו 7.5 μL של מגיב טרנספקציה לצינור אחד וערבבו את המגיב ביסודיות על ידי צנרת.
    3. הוסיפו 2 מיקרוגרם של פלסמיד pLX-mCherry ללא אנדוטוקסין והתאמת פלסמיד אריזת לנטי-וירוס לצינור אחר, והוסיפו את מגיב הטרנספקציה (2 μLL/μg של פלסמיד).
    4. ערבבו את הנוזל בשני צינורות הצנטריפוגה ותנו לתערובות לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את מדיום התרבית של תאי 293T והוסף את התערובת משלב 10.2.4 לתאי 293T. שנה את מדיום התרבות ל- DMEM טרי + 10% FBS לאחר 8 שעות.
    6. לאחר 48 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם הראשונה וסננו אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. לאחר 72 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם השנייה וסננו אותו שוב דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר.
      הערה: אחסן את שני הסופרנאטים המסוננים על קרח עד להתמרת נגיף הלנטי.
  3. השג את ה- LGSCs מעכברי DED (NOD / ShiLtJ) (ראה שלב 1).
  4. הוסיפו 1 מ"ל של ה-pLX-mCherry lentivirus supernatant המקדים כדי להחיות את התאים.
  5. הגדר את צינור הצנטריפוגה על שייקר בחממת CO2 ב -37 מעלות צלזיוס. מנענעים אותו ב-100 סל"ד כדי למקסם את המגע בין נגיף הלנטי לתאים. לאחר 8 שעות, צנטריפוגה התערובת ב 250 × גרם במשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
  6. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 כדי להחיות את גלולת התא. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולזרוע סך של 1 × 104 תאים לתוך 100 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) בכל באר של צלחת בת 24 בארות מקושטת מראש עם 20 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (ראה שלב 1.3.2).
  7. לאחר 7 ימים של תרבית (ראו שלב 1), בחרו כדורים המציגים פלואורסצנציה אדומה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להרחיב את התרבות.

11. השתלה אורתוטופית LGSC

הערה: כל הניתוחים מבוצעים בחדר ניתוח SPF, וכל כלי הניתוח מעוקרים.

  1. קבל את הכדורים של LGSC מעכברי ROSA26mT/mG עם פלואורסצנציה אדומה (td-Tomato) או טרנספקציה mCherry מתורבתת במשך 7 ימים (ראה שלב 1).
  2. יש לקרר שפופרת מיקרו-צנטריפוג' בגודל 1.5 מ"ל המכילה תערובת של 1:1 של ג'ל מטריקס ו-DMEM/F12 על קרח לפני השימוש. עיכלו את כדורי ה-LGSC לתאים בודדים ובצעו החייאה של התאים בצפיפות של 2 ×-106 תאים/מ"ל בצינור.
  3. מרדימים את עכברי ה-NOD/ShiLtJ על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטלי (50 מ"ג/ק"ג).
    הערה: עכבר NOD/ShiLtJ הוא מודל אידיאלי עם תסמיני ADDED אידיופטיים, כולל הפרשת דמעות מופחתת, חדירה דלקתית וכיב מסלולי.
  4. לאחר ההרדמה, השתמש במשחה מלוחה או במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש, ולאחר מכן השתמש במספריים עיניים כדי לבצע חתך של 5-8 מ"מ בעור מאחורי האוזן (ליד העין) של עכברי ההרדמה כדי לחשוף את LGs.
    הערה: יש להשתמש ביודופור אך ורק לחיטוי סביב החתך.
  5. הזריקו 2 × 104 תאים לתוך LG בצד שמאל והזיקו את התערובת ללא תאים (ראו שלב 11.2) לתוך LG בצד ימין כבקרה.
  6. לאחר ההזרקה, להחזיר את LGs למקומם המקורי עם מלקחיים עיניים ולתפור את הפצע. להאכיל את העכברים במשך 2 חודשים ולבחון את ההשפעה של הטיפול.
    הערה: חומר כרית הכלוב חייב גם להיות מעוקר בקפדנות לאחר הניתוח, ויש להחליף את חומר הכרית פעם ביום. לאחר תפירת הפצע, ניתן להזריק טרמדול באופן סלקטיבי לווריד הזנב של עכברים במינון הסטנדרטי של 2.5 מ"ג/ק"ג כדי להשיג משכך כאבים.
  7. הרדימו את העכברים האלה חודשיים לאחר הניסוי (ראו שלב 11.3). לצלם את הסימפטומים של אזור העין.
    1. במהלך ההרדמה, חפש את הסימפטומים הבאים: הרפיית שרירי הצוואר והגפיים; נשימה עמוקה, איטית ויציבה; צמצום התלמיד; היעלמות רפלקס הקרנית.
    2. במהלך ההרדמה והניתוח, שמור על טמפרטורת הגוף של עכברים ב 37 °C (74 °F). לאחר הניתוח, הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה למי השתייה לעכברים כדי להפחית את הסיכון לזיהום בפצעים. אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה. אל תחזירו את העכברים שעברו ניתוח לחברתם של עכברים אחרים עד להחלמה מלאה.
    3. לאחר צילום הסימפטומים של אזור העין, פתח את תוכנת ImageJ, לחץ על קובץ | | פתוח בחירות ביד חופשית, החזק את לחצן העכבר השמאלי ובחר את אזור הכיב המסלולי בתמונה. לחץ על נתח | למדוד כדי לקבל את האזור היחסי של כיב.
  8. שים את חוט הכותנה האדום פנול על הקנטוס הצדדי של עכברי הרדמה במשך 10 שניות; למדוד ולתעד את אורך החלק הדהוי של חוט הכותנה. המתת חסד את העכברים על ידי נקע חוליות צוואר הרחם לאחר מדידת דמעות.
  9. לנתח את העכברים ולקבל את LGs לניתוח IHC.

12. בידוד RNA

הערה: לפני הניסוי, precool את הצנטריפוגה ל 4 °C ולהבטיח שכל הריאגנטים והמתכלים נקיים מזיהום RNAse.

  1. אסוף LGSCs או שברי LG בצינור microcentrifuge. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר ליזה של תאים ושחררו באופן מלא את התאים או הרקמות על ידי תנודת מערבולת.
  2. הוסיפו 0.2 מ"ל של כלורופורם, ותנו לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לאחר תנודת המערבולת למשך דקה אחת. צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוזל מחולק לשלוש שכבות, והרנ"א נמצא בשלב מימי שקוף עליון.
  3. פשטו בזהירות את הפאזה המימית השקופה העליונה והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה חדש ללא RNAse במינון 1.5 מ"ל.
  4. מוסיפים נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל ומערבבים בעדינות. תנו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
  5. הסר את ה-supernatant, והוסף 1 מ"ל של 75% אתנול. הפוך את הצינור כדי לשטוף את הכדור והצנטריפוגה במשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, 7,500 × גרם. חזור על שלב זה.
  6. הסר את הסופרנט בזהירות והכניס את צינור הצנטריפוגה לשולחן העבודה האולטרה-קליאני כדי לייבש אותו במשך כ -20 דקות.
    הערה: המשך לשלב הבא כאשר הכדור הלבן הופך להיות שקוף. בצע את כל הפעולות על הקרח.
  7. הוסיפו 20 μL של מים נטולי RNAse כדי להמיס את הכדור לחלוטין. מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (ראה טבלת החומרים) ואחסן את תמיסת הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

13. PCR

  1. תגובת שעתוק הפוכה
    1. הוסף 1 מיקרוגרם של רנ"א כולל (חשב את נפח תמיסת הרנ"א הנוספת בהתאם לריכוז תמיסת הרנ"א) לתוך צינור תגובת ה- PCR ודגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה.
    2. שים אותו על קרח למשך דקה אחת ולאחר מכן הוסף מים ללא אנזימים עד שהנפח הכולל מגיע ל-12 μL. הוסף 4 μL של 4x DNA Master Mix ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הניחו את הצינור על קרח, הוסיפו 4 μL של 5x RT Master Mix וערבבו אותו בעדינות. הגדר את הגדרות ה- PCR הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 50 ° C למשך 5 דקות, 98 ° C למשך 5 דקות, 4 ° C למשך דקה אחת.
    4. אחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך לשלב הבא לאחר השלמת תגובת התמלול ההפוכה.
  2. תגובת PCR
    1. הכינו את תגובת ה-PCR בצינור ה-PCR באופן הבא: 14.1 μL של מים נטולי אנזימים, 2 μL של dNTP, 2 μL של 10x Buffer, 0.8 μL של פריימר (10 μM, 0.4 μL של פריימר קדמי ו-0.4 μL של פריימר הפוך, עיין בטבלת החומרים), 1 μL של cDNA שעתוק הפוך (עיין בשלב 13.1) ו-0.1 μL של אנזים Taq.
    2. מקם את תגובת ה- PCR המוכנה במנגנון ה- PCR עבור PCR. עיין בהוראות של ערכת האנזים Taq עבור הליך PCR (ראה טבלת החומרים).
  3. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
    1. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 242 גרם של Tris ו- 37.2 גרם של Na2EDTA·2H2O והוסף אותם לכוס 1 L. מוסיפים כ-800 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ו-57.1 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לכוס, מערבבים היטב, מוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה ל-1 ליטר כדי להשיג חיץ TAE של פי 50, ומאחסנים אותם בטמפרטורת החדר.
      הערה: דילול חיץ TAE 50x עם מים שעברו דה-יוניזציה לפני השימוש.
    2. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 1.2 גרם של אגרוז ולהוסיף אותו לבקבוקון חרוטי המכיל 80 מ"ל של 1x מאגר TAE. מחממים אותו שוב ושוב בתנור המיקרוגל עד שהוא מומס לחלוטין.
    3. מצננים את הבקבוקון תחת מי ברז זורמים עד שטמפרטורת התמיסה יורדת ל-60 מעלות צלזיוס. מוסיפים 8 μL של כתם חומצת גרעין, יוצקים את התמיסה למיכל הג'לטיניזציה לאחר ערבוב טוב, מניחים את המסרק ומניחים לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    4. שלפו את המסרק וטענו את מוצרי ה-PCR בג'ל האגרוז המוכן. בצע אלקטרופורזה ב 120 V במשך 30 דקות.
    5. הניחו את הג'ל במערכת ההדמיה ECL Gel ותצלמו.

תוצאות

הקמת מערכת תרביות תלת-ממדית, ללא סרום
במחקר זה פותח LGSCM המכיל EGF, Wnt3A, FGF10 ו-Y-27632 עבור LGSCs של עכברים, ו-LGSCs בודדו בהצלחה ותורבתו על ידי שיטת תרבית תלת-ממדית (איור 1A). מערכת תרבית תלת-ממדית מוצלחת ללא סרום של LGSCs מעכברי C57BL/6, עכברי NOD/ShiLtJ, עכברי BALB/c ועכברי ROSA26mT/mG הוקמה ...

Discussion

ישנן שיטות מבוססות היטב לבידוד ותרבית חוץ גופית של תאי גזע דמעתיים לתרבית תאי גזע דמעה ותיקון פציעת LG. Shatos et al.17 ו- Ackermannet al. 6 תאי גזע דמע תת-תרבותיים בתרבית ותת-תרבותית של חולדות ועכברים בהצלחה בשיטות תרבית דו-ממדיות, בהתאמה, מה שמאפשר להשתיל תאי גזע דמעות...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31871413) ושתי תוכניות של מדע וטכנולוגיה של גואנגדונג (2017B020230002 ו- 2016B030231001). אנו אסירי תודה לחוקרים שעזרו לנו במהלך המחקר ולאנשי הצוות העובדים במרכז לבעלי החיים על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Animal(Mouse)
Bal B/CModel Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6JLaboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJModel Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mGModel Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balanceSartorius
Automatic dehydratorThermo
Blood counting chamberBLAU
Cell CounterCountStar
CO2 constant temperature incubatorThermo
ECL Gel imaging systemGE healthcare
Electric bath for water bathYiheng Technology
Electrophoresis apparatusBioRad
Fluorescence quantitative PCR instrumentRoche
Frozen tissue slicerLecia
Horizontal centrifugeCENCE
Inverted fluorescence microscopeNikon
Inverted microscopeOlympus
Laser lamellar scanning micrographCarl Zeiss
Liquid nitrogen containerThermo
Low temperature high speed centrifugeEppendorf
MicropipettorGilson
Microwave ovenPanasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometerThermomeasure RNA concentration
Paraffin slicing machineThermo
PCR AmplifierEppendorf
pH value testerSartorius
4 °C RefrigeratorHaier
Thermostatic culture oscillatorZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrumentThermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigeratorThermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigeratorThermo
Ultra pure water purification systemELGA
Reagent
Animal Experiment
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
Pentobarbital SodiumSigma57-33-0
Cell Culture
B27Gibco17504044
Collagenase IGibco17018029
DispaseBD354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSOSigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
Foetal Bovine SerumGibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
Human FGF10PeproTech100-26
Matrigel (Matrix gel)BD356231
Murine NogginPeproTech250-38
Murine Wnt3APeproTech315-20
Murine EGFPeproTech315-09
NEAAGibco11140050
N2Gibco17502048
R-spondin 1PeproTech120-38
Trypsin Inhibitor (TI)SigmaT6522Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
TrypsinSigma T4799
Y-27632SelleckS1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgGThermoA-21202Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgGThermoA-21206Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgGThermoA-10037Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgGThermoA-10042Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibodyAbcamab104751Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibodyAbcamab11512Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibodyAbcamab181595Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibodyAbcamab15580Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibodyAbcamab125096Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibodyAbcamab167453Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7Sangon BiotechA501702-0500
Citric AcidSangon Biotech201-069-1
DAB Kit (20x)CWBIOCW0125
DAPIThermo62248
EosinBASO68115
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
FormalinSangon BiotechA501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)Abcamab6789Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)Abcamab6721Used dilution: 2 μg/mL
HematoxylinBASO517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)ThermoHG-400-012
30% H2O2Guangzhou ChemistryKD10
30% Hydrogen Peroxide SolutionGuangzhou Chemistry7722-84-1
MethanolGuangzhou Chemistry67-56-1
Na3C6H5O7.2H2OSangon BiotechA501293-0500
Neutral balsamSHANGHAI YIYANGYY-Neutral balsam
Non-immunized Goat SerumBOSTERAR0009
ParaffinSangon BiotechA601891-0500
ParaformaldehydeDAMAO200-001-8
SaccharoseGuangzhou Chemistry57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrateSangon Biotech200-675-3
SucroseGuangzhou ChemistryIB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. CompoundSAKURASAKURA.4583
Triton X-100DINGGUO9002-93-1
XyleneGuangzhou Chemistry128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
AgaroseSigma9012-36-6
AlcoholGuangzhou Chemistry64-17-5
ChloroformGuangzhou Chemistry865-49-6
Ethidium BromideSangon Biotech214-984-6
Isopropyl AlcoholGuangzhou Chemistry67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO-
Taq DNA PolymeraseTAKARAR10T1
Goldview (nucleic acid stain)BioSharpBS357A
TRIzolMagenR4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
AgarOXID-
AmpicillinSigma69-52-3
ChloramphenicolSigma56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction KitThermoA36227
KanamycinSigma25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection KitThermoL3000015
LR Reaction KitThermo11791019
Plasmid Extraction KitTIANGENDP103
Trans5α Chemically Competent CellTRANSGENCD201-01
TrytoneOXID-
Yeast ExtractOXID-
Primers and SequenceCompany
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vectorAddgene
pENRTY-mCherryXiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved