Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Resumo

O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.

Resumo

A terapia à base de células-tronco (LG) é uma estratégia promissora para doenças lacrimais da glândula. No entanto, a falta de um método de cultura confiável e livre de soro para obter um número suficiente de células-tronco LG (LGSCs) é um obstáculo para novas pesquisas e aplicação. O método de cultura tridimensional (3D), sem soro para LGSCs de mouse adulto é bem estabelecido e mostrado aqui. Os LGSCs poderiam ser continuamente transicionados e induzidos a diferenciar-se para células acinar ou ductais.

Para a cultura primária lgsc, os LGs de camundongos de 6-8 semanas de idade foram digeridos com despase, colagenase I, e trypsin-EDTA. Um total de 1 × 10⁴ células individuais foram semeadas em 80 μL de matriz de células-tronco de glândula gel-lacrimal (LGSCM) em cada poço de uma placa de 24 poços, pré-revestida com 20 μL de matriz de gel-LGSCM matriz. A mistura foi solidificada após a incubação por 20 min a 37 °C, e 600 μL de LGSCM adicionado.

Para a manutenção lgsc, os LGSCs cultivados por 7 dias foram desagregados em células únicas por despase e trippsin-EDTA. As células únicas foram implantadas e cultivadas de acordo com o método utilizado na cultura primária lgsc. Os LGSCs poderiam ser passagens mais de 40 vezes e expressar continuamente marcadores de células-tronco/progenitor Krt14, Krt5, P63 e nestin. Os LGSCs cultivados no LGSCM têm capacidade de auto-renovação e podem se diferenciar em células acinar ou ductais in vitro e in vivo.

Introdução

As células-tronco da glândula lacrimal (LGSCs) mantêm a renovação celular da glândula lacrimal (LG) e são a fonte de células acinar e ductais. Portanto, o transplante LGSC é considerado uma abordagem alternativa para o tratamento de danos inflamatórios graves e doença ocular seca deficiente aquosa (^ADDED)1,2,3. Vários métodos de cultura foram aplicados para enriquecer lgscs. Tiwari et al. células LG primárias separadas e cultivadas usando colágeno I e gel de matriz complementados com vários fatores de crescimento; no entanto, as células LG não poderiam ser continuame....

Protocolo

Todos os experimentos neste protocolo seguiram as diretrizes de cuidados com animais do Comitê Ético sobre Julgamento Animal da Universidade Sun Yat-sen. Todas as operações relacionadas à célula devem ser realizadas na bancada ultracleana na sala de operação da célula. Todas as operações usando xileno devem ser realizadas em capas de fumaça.

1. Cultura primária lgsc

1. Isolamento LG
   1. Obtenha um rato macho BALB/c de 6-8 semanas de idade, e corte a pele atrás da orelha para expor o LG e o tecido conjuntivo ao seu redor. Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova o LG.

Resultados

Estabelecer sistema de cultura 3D e sem soro
Neste estudo, lgscm contendo EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSCs de mouse foi desenvolvido, e LGSCs foram isolados com sucesso e cultivados por um método de cultura 3D (Figura 1A). Um sistema de cultura 3D e sem soro de LGSCs de camundongos C57BL/6, ratos NOD/ShiLtJ, ratos BALB/c e camundongos ROSA26^mT/mG foi estabelecido usando este método¹⁶. Para um rato macho, 1,5-2 × 10⁶ c.......

Discussão

Existem métodos bem estabelecidos para o isolamento e cultura in vitro de células-tronco lacrimais para a cultura de células-tronco lacrimais e reparação de lesões LG. Shatos et ^al.17 e Ackermannet al. ⁶ células-tronco lacrimal cultivadas e subculturadas com sucesso de ratos e camundongos por métodos de cultura 2D, respectivamente, possibilitando o transplante de células-tronco lacrimais para o tratamento de ADDED. Estudos sobre células-tronco

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG	Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance	Sartorius
Automatic dehydrator	Thermo
Blood counting chamber	BLAU
Cell Counter	CountStar
CO2 constant temperature incubator	Thermo
ECL Gel imaging system	GE healthcare
Electric bath for water bath	Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus	BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument	Roche
Frozen tissue slicer	Lecia
Horizontal centrifuge	CENCE
Inverted fluorescence microscope	Nikon
Inverted microscope	Olympus
Laser lamellar scanning micrograph	Carl Zeiss
Liquid nitrogen container	Thermo
Low temperature high speed centrifuge	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Microwave oven	Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo	measure RNA concentration
Paraffin slicing machine	Thermo
PCR Amplifier	Eppendorf
pH value tester	Sartorius
4 °C Refrigerator	Haier
Thermostatic culture oscillator	ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument	Thermo
-80°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
-20°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
Ultra pure water purification system	ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodium	Sigma	57-33-0
Cell Culture
B27	Gibco	17504044
Collagenase I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Foetal Bovine Serum	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Human FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Murine Noggin	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
Murine EGF	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondin 1	PeproTech	120-38
Trypsin Inhibitor (TI)	Sigma	T6522	Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-21202	Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-21206	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-10037	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-10042	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody	Abcam	ab104751	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody	Abcam	ab11512	Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody	Abcam	ab181595	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody	Abcam	ab15580	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody	Abcam	ab125096	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody	Abcam	ab167453	Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Citric Acid	Sangon Biotech	201-069-1
DAB Kit (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Formalin	Sangon Biotech	A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)	Abcam	ab6789	Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)	Abcam	ab6721	Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin	BASO	517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chemistry	KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution	Guangzhou Chemistry	7722-84-1
Methanol	Guangzhou Chemistry	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Neutral balsam	SHANGHAI YIYANG	YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum	BOSTER	AR0009
Paraffin	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldehyde	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chemistry	57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sangon Biotech	200-675-3
Sucrose	Guangzhou Chemistry	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound	SAKURA	SAKURA.4583
Triton X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xylene	Guangzhou Chemistry	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose	Sigma	9012-36-6
Alcohol	Guangzhou Chemistry	64-17-5
Chloroform	Guangzhou Chemistry	865-49-6
Ethidium Bromide	Sangon Biotech	214-984-6
Isopropyl Alcohol	Guangzhou Chemistry	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	-
Taq DNA Polymerase	TAKARA	R10T1
Goldview (nucleic acid stain)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar	OXID	-
Ampicillin	Sigma	69-52-3
Chloramphenicol	Sigma	56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit	Thermo	A36227
Kanamycin	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit	Thermo	L3000015
LR Reaction Kit	Thermo	11791019
Plasmid Extraction Kit	TIANGEN	DP103
Trans5α Chemically Competent Cell	TRANSGEN	CD201-01
Trytone	OXID	-
Yeast Extract	OXID	-
Primers and Sequence	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT	Synbio Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University