Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Resumo

O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.

Resumo

A terapia à base de células-tronco (LG) é uma estratégia promissora para doenças lacrimais da glândula. No entanto, a falta de um método de cultura confiável e livre de soro para obter um número suficiente de células-tronco LG (LGSCs) é um obstáculo para novas pesquisas e aplicação. O método de cultura tridimensional (3D), sem soro para LGSCs de mouse adulto é bem estabelecido e mostrado aqui. Os LGSCs poderiam ser continuamente transicionados e induzidos a diferenciar-se para células acinar ou ductais.

Para a cultura primária lgsc, os LGs de camundongos de 6-8 semanas de idade foram digeridos com despase, colagenase I, e trypsin-EDTA. Um total de 1 × 10⁴ células individuais foram semeadas em 80 μL de matriz de células-tronco de glândula gel-lacrimal (LGSCM) em cada poço de uma placa de 24 poços, pré-revestida com 20 μL de matriz de gel-LGSCM matriz. A mistura foi solidificada após a incubação por 20 min a 37 °C, e 600 μL de LGSCM adicionado.

Para a manutenção lgsc, os LGSCs cultivados por 7 dias foram desagregados em células únicas por despase e trippsin-EDTA. As células únicas foram implantadas e cultivadas de acordo com o método utilizado na cultura primária lgsc. Os LGSCs poderiam ser passagens mais de 40 vezes e expressar continuamente marcadores de células-tronco/progenitor Krt14, Krt5, P63 e nestin. Os LGSCs cultivados no LGSCM têm capacidade de auto-renovação e podem se diferenciar em células acinar ou ductais in vitro e in vivo.

Introdução

As células-tronco da glândula lacrimal (LGSCs) mantêm a renovação celular da glândula lacrimal (LG) e são a fonte de células acinar e ductais. Portanto, o transplante LGSC é considerado uma abordagem alternativa para o tratamento de danos inflamatórios graves e doença ocular seca deficiente aquosa (^ADDED)1,2,3. Vários métodos de cultura foram aplicados para enriquecer lgscs. Tiwari et al. células LG primárias separadas e cultivadas usando colágeno I e gel de matriz complementados com vários fatores de crescimento; no entanto, as células LG não poderiam ser continuamente cultivadas⁴. Usando cultura bidimensional (2D), as células-tronco derivadas do MOUSE LG foram isoladas por You et ^al.5 e Ackermann et al. ⁶, encontrado para expressar os genes marcadores de células-tronco/progenitor, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e poderia ser subcultado. No entanto, não há indicação clara de que essas células possam se diferenciar em células acinar ou ductais, e não há experimento de transplante para verificar o potencial de diferenciação in vivo.

Recentemente^{, as} células c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45- foram isoladas dos LGs do mouse por citometria de fluxo, encontradas para expressar marcadores celulares progenitores LG, como Pax6 e Runx1, e diferenciadas em dutos e acini in vitro. Em camundongos com ADICIONADO, a injeção ortotópica com essas células poderia reparar LGs danificados e restaurar a função secretary dos LGs². No entanto, o número de células-tronco isoladas por este método foi pequeno, e não há condições de cultura adequadas para a expansão dos LGSCs isolados. Em resumo, é necessário estabelecer um sistema de cultura adequado para isolar e cultivar efetivamente LGSCs adultos com expansão estável e contínua para o estudo de LGSCs no tratamento de ADDED.

Organoides derivados de células-tronco ou células-tronco pluripotentes são um grupo de células que são histologicamente semelhantes aos órgãos relacionados e podem manter sua própria renovação. Depois que o organoide do intestino do camundongo foi cultivado com sucesso por Sato et al. em 2009⁷, organoides de outros órgãos foram cultivados em sucessão, com base no sistema cultural de Sato, como vesícula^{biliar 8}, fígado⁹, pâncreas¹⁰, estômago¹¹, mama¹², pulmão¹³, próstata¹⁴ e glândula salivar¹⁵ . Devido à alta proporção de células-tronco adultas antes da diferenciação celular na cultura organoide, o método de cultura organoide tridimensional (3D) é considerado ideal para o isolamento e cultura das células-tronco adultas da LG.

Um sistema de cultura LGSC de camundongos adultos foi estabelecido no presente estudo pela otimização do método de cultura 3D, livre de soro. É comprovado que os LGSCs cultivados tanto a partir de camundongos normais quanto adicionados apresentaram uma capacidade estável de autoconexão e proliferação. Após o transplante nos LGs do mouse adicionado, os LGSCs colonizaram os LGs prejudicados e melhoraram a produção de lágrimas. Além disso, os LGSCs fluorescentes vermelhos foram isolados de camundongos ROSA26^mT/mG e cultivados. Este trabalho fornece uma referência confiável para o enriquecimento LGSC in vitro e autoenxerto LGSC na aplicação clínica para terapia adicional.

Protocolo

Todos os experimentos neste protocolo seguiram as diretrizes de cuidados com animais do Comitê Ético sobre Julgamento Animal da Universidade Sun Yat-sen. Todas as operações relacionadas à célula devem ser realizadas na bancada ultracleana na sala de operação da célula. Todas as operações usando xileno devem ser realizadas em capas de fumaça.

1. Cultura primária lgsc

1. Isolamento LG
   1. Obtenha um rato macho BALB/c de 6-8 semanas de idade, e corte a pele atrás da orelha para expor o LG e o tecido conjuntivo ao seu redor. Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova o LG.
   2. Enxágüe os LGs duas vezes com 4 mL de solução estéril de 10 mM PBS para remover sangue em um prato de 6 cm. Mergulhe os LGs em um prato de 6 cm com 4 mL de 75% de etanol para 10 s e enxágue com 10 mM PBS duas vezes imediatamente.
2. Obtenha células únicas de LG
   1. Use a solução tampão HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl em água ultrauso) para preparar 25 dispase U/mL. Prepare a solução de colagem I de 0,1% com água ultrapura.
   2. Corte os LGs em pequenos fragmentos (cerca de 1 mm³), transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril de 15 mL e trate os tecidos com 500 μL de 25 dáspase U/mL e 500 μL de colagem de 0,1% I por 1 h a 37 °C.
   3. Use 10 mM PBS para preparar a solução trypsin-EDTA (0,05 g/L trypsin, 0,04 g/L EDTA). Trate os fragmentos LG da etapa 1.2.2 com 1 mL de 0,05% de trypsin-EDTA por 10 minutos a 37 °C e dissocia os fragmentos em células únicas por pipetar repetidamente.
   4. Filtre a suspensão através de um filtro de 70 μm, colete o filtrado em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrífuga a 150 × g por 5 min.
   5. Após a centrifugação, remova o supernasce, adicione 10 mL de PBS de 10 mM para lavar a pelota celular e centrifugar a suspensão.
   6. Repita o passo 1.2.5, remova o supernasce e adicione 1 mL de DMEM/F12 (mistura 1:1 do meio modificado da Águia de Dulbecco e F-12 de Ham) para resuspensar as pelotas da célula.
3. Cultura primária lgsc
   1. Prepare o meio de célula-tronco da glândula lacrimal (LGSCM) contendo DMEM/F12, suplemento 1x N2, suplemento 1x B27, 2 mM substituto de glutamina, 0,1 mM NEAAs (aminoácidos não essenciais), 50 ng/mL fator de crescimento epidérmico murina (EGF), 100 ng/mL fator de crescimento do fibroblasto 10 (FGF10), 10 ng/mL Wnt3A e 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCHA).
   2. Adicione 20 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) no centro do poço de uma placa de 24 poços. Use uma ponta de pipeta para expandi-la para um círculo (6-8 mm de diâmetro) e incubar a mistura por 20 min a 37 °C para pré-revestimento do poço.
   3. Use um contador de células para determinar o número da célula e adicione 40 μL de LGSCM com um total de 1 ×^{10 4} células em 40 μL do gel de matriz. Misture-os suavemente com uma pipeta para obter uma mistura de gel-LGSCM matricial (gel de matriz: LGSCM= 1:1).
   4. Use uma pipeta para soltar cuidadosamente 80 μL da mistura sobre a área pré-revestida em cada poço da placa de 24 poços na etapa 1.3.2.
   5. Incubar a mistura por 20 min a 37 °C e adicionar 600 μL de LGSCM.
   6. Mude o meio de cultura em cada poço uma vez a cada dois dias. Após 7 dias de cultura, procure por esferas LGSC de 100-300 μm de diâmetro sob o microscópio invertido (ocular: 10x, objetivo: 4x).
      NOTA: Os LGSCs podem ser cultivados por mais de 14 dias no total.
4. Isolar e cultivar LGSCs primários de camundongos ROSA26^mT/mG e camundongos DED (NOD/ShiLtJ) seguindo os passos descritos acima.

2. Manutenção e passagem lgsc

1. Remova bem o meio cultural da cultura da esfera.
2. Desagregar as esferas LGSC cultivadas por 7 dias por incubação em 20 μL de dispase U/mL e 100 μL de 10 mM PBS por 30 min a 37 °C.
3. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 150 × g por 4 min. Remova o supernatante.
4. Trate as esferas com 1 mL de 0,05% trypsin-EDTA por 5 min a 37 °C. Adicione 1 mL de inibidor de trippsina (TI) e pipeta repetidamente para neutralizar a trippsina e dissociar as esferas em células únicas.
5. Centrifugar a 150 × g por 5 min e remover o supernante para obter LGSCs na pelota. Adicione 1 mL de LGSCM para resuspensar a pelota LGSC.
6. Emplaque as células únicas conforme descrito nas etapas 1.3.1 a 1.3.6.

3. Diferenciação LGSC

1. Procedimento 1: Estender o tempo de cultura dos LGSCs de 7 para 14 dias com o sistema de cultura LGSC para diferenciação aleatória.
2. Procedimento 2: Alterar a proporção da mistura matriz gel-LGSCM de 1:1 para 1:2 no início da cultura LGSC para a diferenciação das células ductais. Semente os LGSCs na matriz para indução por 14 dias (consulte a etapa 1.3).
3. Procedimento 3: Após a passagem, substitua o LGSCM pela mistura lgscm-10% de soro bovino fetal (FBS) para a diferenciação de células acinar. Induzir diferenciação por 14 dias.

4. Desidratação do tecido LG

1. Obtenha tecidos LG (passo 1.1.1) e enxágue os LGs com 4 mL de solução PBS estéril de 10 mM em um prato de 6 cm por 2 min. Mova os tecidos para solução de formalina de 10% para fixação por 24 h.
2. Enxágüe os tecidos fixos com PBS de 10 mM por 2 minutos para remover a formalina e transfira o tecido para uma caixa de incorporação de tecido. Coloque a caixa de incorporação no desidratador automático.
3. Use o desidratador automático para desidratar os tecidos da seguinte forma: 70% etanol, 2h; 80% etanol, 2h; 90% etanol, 30 min; 95% de etanol, 30 min; etanol absoluto, 30min; etanol absoluto, 2h; etanol absoluto: 100% xileno (1: 1) mistura, 30 min; 100% xileno, 30 min; 100% xileno, 2h; 100% xileno: parafina (1: 1) mistura, 30 min; parafina, 2 h; parafina, 3 h.

5. Desidratação organoide/esfera LG

1. Obtenha organoides/esferas LG (etapas 2.1-2.3) em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e enxágue os organoides/esferas LG com 1 mL de solução PBS estéril de 10 mM por 2 min.
2. Centrifugar a 100 × g por 1 min e remover o supernatante.
3. Prepare a solução de paraformaldeído de 4% (PFA) da seguinte forma: adicione 20 g de PFA a uma mistura de 400 mL de PBS de 10 mM e 40 μL de 1 M NaOH, agite bem a solução e aqueça-a em um banho de água de 65 °C por 2h até que o PFA esteja completamente dissolvido. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, use PBS de 10 mM para compensar o volume a 500 mL e armazená-lo a 4 °C.
4. Adicione 1 mL de 4% de PFA no tubo de microcentrífuga com a pelota organoide/esfera e coloque o tubo em uma geladeira de 4 °C por pelo menos 24 h para fixação.
5. Após a fixação, centrífuga a 100 × g por 1 min e remova o supernaspe. Adicione 1 mL de PBS de 10 mM no tubo de microcentrifutura com a pelota organoide/esfera e misture suavemente por pipetação por 2 minutos para enxaguar o PFA. Repita este passo duas vezes.
6. Centrifugar a 100 × g por 1 min e remover o supernaspe.
7. O hidrogel de incorporação de calor para dissolver e adicionar 50-60 μL de hidrogel de incorporação à pelota organoide/esfera e misturar. Pipete a mistura sobre o parafilme na forma de uma gota e espere 5 min para que ela se solidifique à temperatura ambiente.
8. Desidratar o gel com os organoides/esferas em um novo tubo de microcentrifutura de 1,5 mL da seguinte forma.
   1. Adicione 1 mL de 50% de etanol ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e retire o líquido do tubo por tubulação. Repita esse passo alterando a concentração de etanol para 70%, 80%, 90%, 95% sucessivamente.
   2. Adicione 1 mL de etanol absoluto ao tubo, espere 30 min em temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por tubulação. Repita este passo.
   3. Adicione 1 mL de uma mistura de 0,5 mL de etanol absoluto e 0,5 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por pipetação.
   4. Adicione 1 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por pipetação. Repita este passo.
      NOTA: As etapas 5.8.5-5.8.6 devem ser realizadas em um banho de metal a 65 °C.
   5. Adicione 1 mL de uma mistura de 0,5 mL de parafina e 0,5 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min a 65 °C e remova o líquido do tubo por pipetação.
   6. Adicione 1 mL de parafina ao tubo, espere 30 min a 65 °C e retire o líquido do tubo por pipetação. Repita esta etapa e amplie o tempo de processamento para 1h.

6. Incorporação e secção de parafina

1. Incorporação de parafina
   1. Antes de incorporar, ligue a máquina de incorporação e pré-aqueça-a para derreter a cera de parafina no tanque de parafina.
   2. Coloque o tecido desidratado ou o gel organoide/esfera na ranhura da caixa de ferro de incorporação e coloque a caixa de ferro na parafina da máquina de incorporação.
   3. Retire a tampa plástica e coloque a caixa de incorporação de plástico na caixa de ferro para cobri-la. Mova a caixa de ferro de incorporação para uma mesa de resfriamento.
   4. Depois que a parafina tiver condensado em blocos na caixa de incorporação, remova-a da caixa de ferro e corte-a diretamente ou armazene-a temporariamente em uma geladeira de 4 °C.
2. Secção de parafina
   1. Antes de cortar a parafina, pré-monte o cortador de parafina e adicione água destilada à pia do cortador para pré-aquecimento. Comece a cortar quando a temperatura da água subir para 42 °C.
   2. Fixar a amostra no slot amostral do cortador de parafina. Ajuste a espessura da seção para 5 μm durante o corte.
   3. Se se sectionia a amostra continuamente. Fixar a seção totalmente ladrilho no slide antislip no tanque do cortador.
   4. Após a secção, coloque os slides afixados com tecido amostral em uma incubadora bioquímica a 37 °C para secagem por 24 h. Armazene temporariamente os slides em uma geladeira a 4 °C.

7. Mancha de hematoxilina e eosina

1. Derreta as seções de parafina a 60 °C por 30 minutos, mergulhe as seções em 100% xileno por 15 minutos e repita.
2. Trate as seções com etanol absoluto em um agitador por 5 minutos.
3. Trate os trechos com 90% de etanol, 80% etanol e 70% de etanol em um agitador, cada um por 3 min.
4. Trate as seções com água deionizada em um agitador por 5 minutos e 2 min sucessivamente.
5. Manche as seções em uma caixa molhada por 5 minutos com solução de hematoxilina de 4 mg/mL. Enxágüe as seções em água corrente por 10 minutos.
6. Agitar as seções em um agitador primeiro com água deionizada por 2 min e depois com eosina de 0,5%-1% por 1 min.
7. Agitar os trechos com 70% de etanol, 80% de etanol e 90% de etanol em um agitador por 3 min (cada) sucessivamente. Agitar as seções com etanol absoluto em um agitador por 5 minutos.
8. Mergulhe as seções em 100% xileno por 15 minutos e repita a imersão.
9. Use uma pipeta ou caixa de vendatel para adicionar 3-4 gotas de bálsamo neutro ao slide e cubra-o lentamente com um slide de cobertura. Seque as lâminas à temperatura ambiente.

8. Coloração imunohistoquímica (IHC)

1. Derreta as seções de parafina a 60 °C por 30 minutos, mergulhe as seções em 100% xileno por 10 minutos e repita esta etapa duas vezes.
2. Agitar os trechos em um shaker primeiro com etanol absoluto, 90% etanol e 80% etanol por 2 min (cada), sucessivamente, e depois com água deionizada por 3 min. Repita a agitação com água desionizada duas vezes.
3. Agitar as seções em um shaker primeiro com uma mistura de 20 mL de 30% H₂O₂ e 180 mL de metanol por 10 min e depois água deionizada por 5 min. Repita este passo três vezes.
4. Transfira as seções para o tampão de ácido cítrico pré-cozido (1 L água deionizada com₃g de Na 3 C₆H₅O_{7.2H 2}O e 0,4 g C₆H₈O₇, pH 6.0), micro-ondas por 10 minutos para mantê-los em ponto de ebulição subcrítica, e esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos. Agitar as seções com água deionizada em um agitador por 5 minutos. Repita este passo três vezes.
5. Agitar as seções com PBS de 10 mM em um shaker por 5 minutos, e repetir esta etapa três vezes. Inclua a área de tecido na caixa molhada com um marcador repelente de água, adicione uma gota de soro de cabra não imune pronto para uso para cobrir as amostras e coloque-as em temperatura ambiente por 1h.
6. Retire o soro, adicione o anticorpo primário às amostras (veja a Tabela de Materiais) e incuba-os durante a noite a 4 °C. Remova o anticorpo primário, agitar as seções com PBS de 10 mM em um agitador por 5 minutos, e repita esta etapa de agitação com 10 mM PBS três vezes.
7. Adicione anticorpos secundários (veja a Tabela de Materiais) para cobrir as amostras e incuba-las em uma caixa molhada por 30 minutos à temperatura ambiente. Agitar as seções com PBS de 10 mM em um shaker por 5 minutos, e repetir o passo de agitação três vezes.
8. Adicione a solução recém-preparada 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para cobrir as amostras na caixa molhada e mancha para 30-90 s. Enxágüe as seções com água corrente por 10 minutos.
   NOTA: Controle o tempo de coloração observando sob um microscópio leve até que a cor amarela apareça.
9. Adicione 4 mg/mL solução de hematoxilina para cobrir as amostras, manche por 5 minutos em uma caixa molhada e enxágue as seções com água corrente por 10 minutos.
10. Agitar as seções em um agitador com 80% de etanol, 90% de etanol e etanol absoluto por 2 min cada, sucessivamente, e absorver as seções em 100% xileno por 30 min.
11. Use uma pipeta ou caixa de vendatel para adicionar 3-4 gotas de bálsamo neutro ao slide e cubra-o lentamente com um slide de cobertura. Seque as lâminas à temperatura ambiente.

9. Coloração global de imunofluorescência de organoides/esferas

NOTA: Colete os organoides/esferas fixas com solução PFA de 4% em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL (ver passos 5,1 a 5,4). Realize a rotulagem de fluorescência da seguinte forma.

1. Desidrate os organoides/esferas adicionando 1 mL de solução de sacarose de 30% ao tubo e incuba-o durante a noite em uma geladeira a 4 °C.
2. Adicione 100 μL de solução PBST (solução PBS de 10 mM com 0,1% Triton X-100) ao tubo para enxaguar os organoides/esferas por 5 min, centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min, e coletar a pelota. Repita este passo três vezes.
3. Adicione 0,5-1 mL de soro de cabra não imune pronto para uso ao tubo e sele-o à temperatura ambiente por 1h. Centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min e recolher a pelota.
4. Adicione várias gotas de anticorpo primário diluído para cobrir apenas a pelota e incubar em uma geladeira a 4 °C por 48 h. Centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min e recolher a pelota.
5. Repita o passo 9.2.
6. Adicione várias gotas de um anticorpo secundário fluorescente e 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) solução ao tubo para apenas cobrir a pelota e incubar em uma geladeira a 4 °C por 24 horas, evitando a luz.
7. Repita o passo 9.2, evitando a luz.
8. Adicione 100 μL de solução PBST ao tubo e armazene-o temporariamente em uma geladeira de 4 °C, longe da luz. Observe e fotografe os organoides/esferas usando o microscópio de varredura de folhas de luz.

10. Transfecção LGSC pLX-mCherry

NOTA: A produção de partículas lentivirais deve ser realizada em um armário de biossegurança e em um banco limpo no nível de biossegurança BSL2.

1. Cultura a célula de embalagem lentivírus 293T em uma placa de 6 poços com DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂ por 3-5 dias para atingir 80% de confluência celular.
2. Transfeito o vetor de lentivírus pLX-mCherry em LGSCs.
   NOTA: A preparação do reagente é indicada para um poço de uma placa de 6 poços.
   1. Prepare dois tubos de centrífugas estéreis de 1,5 mL e adicione 250 μL de DMEM/F12 a cada tubo.
   2. Adicione 7,5 μL de reagente de transfecção a um tubo e misture o reagente completamente por pipetação.
   3. Adicione 2 μg de plasmídeo pLX-mCherry sem endotoxina e plasmid de embalagem de lentivírus correspondente em outro tubo, e adicione o reagente de transfecção (2 μL/μg de plasmídeo).
   4. Misture o líquido em ambos os tubos de centrífuga e deixe as misturas ficarem por 5 minutos à temperatura ambiente.
   5. Remova o meio de cultura das células 293T e adicione a mistura da etapa 10.2.4 às células 293T. Mude o DMEM médio de cultura para DMEM fresco + 10% FBS após 8h.
   6. Após 48 h, colete o supernante do vírus pela primeira vez e filtre-o através de um filtro de 0,45 μm. Depois de 72 h, colete o vírus supernante pela segunda vez e filtre-o através de um filtro de 0,45 μm novamente.
      NOTA: Armazene ambos os supernacantes filtrados no gelo até a transdução do lentivírus.
3. Obtenha os LGSCs de ratos DED (NOD/ShiLtJ) (ver passo 1).
4. Adicione 1 mL do supernatante de lentivírus pLX-mCherry pré-coletado para resuspencar as células.
5. Coloque o tubo de centrífuga em um agitador na incubadora de CO₂ a 37 °C. Agite a 100 rpm para maximizar o contato entre o lentivírus e as células. Depois de 8h, centrifugar a mistura a 250 × g por 4 min e remover o sobrenante.
6. Adicione 1 mL de DMEM/F12 para resuspensar a pelota da célula. Use um contador de células para determinar o número celular e a semente um total de 1 ×^{10 4} células em 100 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) em cada poço de uma placa de 24 poços pré-requesada com 20 μL de matriz gel-LGSCM (ver passo 1.3.2).
7. Após 7 dias de cultura (ver passo 1), selecione esferas que exibem fluorescência vermelha sob um microscópio de fluorescência para expandir a cultura.

11. Transplante ortotópico LGSC

NOTA: Todas as operações cirúrgicas são realizadas em sala de cirurgia da SPF, e todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados.

1. Obtenha as esferas LGSC de camundongos ROSA26^mT/mG com fluorescência vermelha (td-Tomate) ou transfecção mCherry cultivada por 7 dias (ver passo 1).
2. Esfrie um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo uma mistura de 1:1 de gel de matriz e DMEM/F12 no gelo antes de usar. Digerir as esferas LGSC em células únicas e resuspensar as células a uma densidade de 2 × 10⁶ células/mL no tubo.
3. Anestesiar os camundongos NOD/ShiLtJ por injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital (50 mg/kg).
   NOTA: O rato NOD/ShiLtJ é um modelo ideal com sintomas adicionais idiopáticos, incluindo secreção lacrimal reduzida, infiltração inflamatória e ulceração orbital.
4. Após a anestesia, use soro fisiológico ou pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento e, em seguida, use uma tesoura oftálmica para fazer um corte de 5-8 mm na pele atrás da orelha (perto do olho) dos ratos anestésicos para expor os LGs.
   NOTA: O Iodophor deve ser estritamente utilizado para desinfecção em torno da incisão.
5. Injete 2 × 10⁴ células no lado esquerdo lg e injete a mistura sem células (ver passo 11.2) no lado direito LG como o controle.
6. Após a injeção, restaure os LGs em suas posições originais com fórceps oftálmicos e sutura a ferida. Alimente os camundongos por 2 meses e observe o efeito do tratamento.
   NOTA: O material da almofada da gaiola também deve ser estritamente esterilizado após o funcionamento, e o material da almofada deve ser substituído uma vez por dia. Após a sutura da ferida, tramadol pode ser seletivamente injetado na veia traseira de camundongos na dose padrão de 2,5 mg/kg para alcançar analgesia.
7. Anestesiar esses camundongos 2 meses após o experimento (ver passo 11.3). Filme os sintomas da região ocular.
   1. Durante a anestesia, procure os seguintes sintomas: relaxamento muscular do pescoço e dos membros; respiração profunda, lenta e constante; estreitamento pupilar; desaparecimento reflexo corneal.
   2. Durante a anestesia e operação, mantenha a temperatura corporal dos ratos a 37 °C. Após a cirurgia, adicione antibióticos apropriados à água potável para camundongos para reduzir o risco de infecção por feridas. Não deixe os camundongos sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Não devolva os camundongos que passaram por cirurgia para a companhia de outros camundongos até que esteja totalmente recuperado.
   3. Depois de filmar os sintomas da região ocular, abra o software ImageJ, clique em Arquivo | | Seleções à mão livre, segure o botão esquerdo do mouse e selecione a área de ulceração orbital na imagem. Clique em Analisar | Medida para obter a área relativa de ulceração.
8. Coloque o fio de algodão vermelho fenol no canthus lateral de ratos anestésicos por 10 s; medir e registrar o comprimento da parte descolorida do fio de algodão. Eutanize os camundongos por luxação de vértebra cervical após a medição da lágrima.
9. Disseque os camundongos e obtenha os LGs para análise de IHC.

12. Isolamento do RNA

NOTA: Antes do experimento, pré-cure a centrífuga até 4 °C e garanta que todos os reagentes e consumíveis estejam livres da contaminação rnase.

1. Colete fragmentos LGSCs ou LG em um tubo de microcentrifuuge. Adicione 1 mL de tampão de lise celular elise totalmente as células ou tecidos por oscilação de vórtice.
2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio, e deixe-o em temperatura ambiente por 10 minutos após a oscilação do vórtice por 1 min. Centrifugar por 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
   NOTA: Após a centrifugação, o líquido é dividido em três camadas, e o RNA está na fase aquosa mais transparente.
3. Pipete cuidadosamente a fase aquosa mais transparente e transfira-a para um novo tubo de centrífuga sem RNAse de 1,5 mL.
4. Adicione um volume igual de álcool isopropílico e misture delicadamente. Deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois centrífuga por 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
5. Retire o supernascente e adicione 1 mL de 75% de etanol. Inverta o tubo para lavar a pelota e centrífuga por 5 min a 4 °C, 7.500 × g. Repita este passo.
6. Retire o supernatante cuidadosamente e coloque o tubo de centrífuga na bancada ultracleana para secá-lo por cerca de 20 minutos.
   NOTA: Prossiga para o próximo passo quando a pelota branca se tornar translúcida. Realizar todas as operações no gelo.
7. Adicione 20 μL de água livre de RNAse para dissolver completamente a pelota. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (veja a Tabela de Materiais) e armazene a solução RNA a -80 °C.

13. PCR

1. Reação de transcrição reversa
   1. Adicione 1 μg de RNA total (calcule o volume da solução RNA adicionada de acordo com a concentração da solução RNA) no tubo de reação PCR e incubar a 65 °C por 5 min para desnaturação.
   2. Coloque-o no gelo por 1 min e, em seguida, adicione água sem enzimas até que o volume total atinja 12 μL. Adicione 4 μL de 4x DNA Master Mix e incuba-o a 37 °C por 5 min.
   3. Coloque o tubo no gelo, adicione 4 μL de 5x RT Master Mix e misture-o suavemente. Defina as seguintes configurações de PCR: 37 °C para 15 min, 50 °C para 5 min, 98 °C para 5 min, 4 °C para 1 min.
   4. Armazene-o a -20 °C ou prossiga para a próxima etapa após a conclusão da reação de transcrição reversa.
2. Reação do PCR
   1. Prepare a reação do PCR no tubo PCR da seguinte forma: 14,1 μL de água sem enzimas, 2 μL de dNTP, 2 μL de Buffer 10x, 0,8 μL de Primer (10 μM, 0,4 μL de Primer Dianteiro e 0,4 μL de Primer Reverso, consulte a Tabela de Materiais), 1 μL de transcrição reversa cDNA (consulte a etapa 13.1) e 0,1 μL de enzima Taq.
   2. Coloque a reação PCR preparada no aparelho PCR para PCR. Consulte as instruções do kit de enzimas Taq para o procedimento PCR (consulte a Tabela de Materiais).
3. Eletroforese de gel agarose
   1. Use um equilíbrio analítico para pesar 242 g de Tris e 37,2 g de Na₂EDTA·_{2H 2}O e adicione-os a um béquer de 1 L. Adicione ~800 mL de água deionizada e 57,1 mL de ácido acético glacial ao béquer, misture bem, adicione água deionizada a 1 L para obter 50x de tampão TAE e armazene-o à temperatura ambiente.
      NOTA: Diluir 50x tampão TAE com água desionizada antes de usar.
   2. Use um equilíbrio analítico para pesar 1,2 g de agarose e adicione-o a um frasco cônico contendo 80 mL de tampão TAE 1x. Aqueça-o repetidamente no forno de micro-ondas até dissolver completamente.
   3. Esfrie o frasco em água da torneira corrente até que a temperatura da solução caia para 60 °C. Adicione 8 μL de mancha de ácido nucleico, despeje a solução no tanque de gelatinização depois de misturar bem, coloque o pente e deixe-o em temperatura ambiente por 30 minutos.
   4. Retire o pente e carregue os produtos PCR no gel de agarose preparado. Realize eletroforese a 120 V por 30 min.
   5. Coloque o gel no sistema de imagem ECL Gel e fotografe.

Resultados

Estabelecer sistema de cultura 3D e sem soro
Neste estudo, lgscm contendo EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSCs de mouse foi desenvolvido, e LGSCs foram isolados com sucesso e cultivados por um método de cultura 3D (Figura 1A). Um sistema de cultura 3D e sem soro de LGSCs de camundongos C57BL/6, ratos NOD/ShiLtJ, ratos BALB/c e camundongos ROSA26^mT/mG foi estabelecido usando este método¹⁶. Para um rato macho, 1,5-2 × 10⁶ c...

Discussão

Existem métodos bem estabelecidos para o isolamento e cultura in vitro de células-tronco lacrimais para a cultura de células-tronco lacrimais e reparação de lesões LG. Shatos et ^al.17 e Ackermannet al. ⁶ células-tronco lacrimal cultivadas e subculturadas com sucesso de ratos e camundongos por métodos de cultura 2D, respectivamente, possibilitando o transplante de células-tronco lacrimais para o tratamento de ADDED. Estudos sobre células-tronco

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG	Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance	Sartorius
Automatic dehydrator	Thermo
Blood counting chamber	BLAU
Cell Counter	CountStar
CO2 constant temperature incubator	Thermo
ECL Gel imaging system	GE healthcare
Electric bath for water bath	Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus	BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument	Roche
Frozen tissue slicer	Lecia
Horizontal centrifuge	CENCE
Inverted fluorescence microscope	Nikon
Inverted microscope	Olympus
Laser lamellar scanning micrograph	Carl Zeiss
Liquid nitrogen container	Thermo
Low temperature high speed centrifuge	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Microwave oven	Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo	measure RNA concentration
Paraffin slicing machine	Thermo
PCR Amplifier	Eppendorf
pH value tester	Sartorius
4 °C Refrigerator	Haier
Thermostatic culture oscillator	ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument	Thermo
-80°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
-20°C Ultra-low temperature refrigerator	Thermo
Ultra pure water purification system	ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodium	Sigma	57-33-0
Cell Culture
B27	Gibco	17504044
Collagenase I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Foetal Bovine Serum	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Human FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Murine Noggin	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
Murine EGF	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondin 1	PeproTech	120-38
Trypsin Inhibitor (TI)	Sigma	T6522	Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-21202	Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-21206	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG	Thermo	A-10037	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG	Thermo	A-10042	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody	Abcam	ab104751	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody	Abcam	ab11512	Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody	Abcam	ab181595	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody	Abcam	ab15580	Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody	Abcam	ab125096	Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody	Abcam	ab167453	Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Citric Acid	Sangon Biotech	201-069-1
DAB Kit (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Formalin	Sangon Biotech	A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)	Abcam	ab6789	Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)	Abcam	ab6721	Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin	BASO	517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chemistry	KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution	Guangzhou Chemistry	7722-84-1
Methanol	Guangzhou Chemistry	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Neutral balsam	SHANGHAI YIYANG	YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum	BOSTER	AR0009
Paraffin	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldehyde	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chemistry	57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sangon Biotech	200-675-3
Sucrose	Guangzhou Chemistry	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound	SAKURA	SAKURA.4583
Triton X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xylene	Guangzhou Chemistry	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose	Sigma	9012-36-6
Alcohol	Guangzhou Chemistry	64-17-5
Chloroform	Guangzhou Chemistry	865-49-6
Ethidium Bromide	Sangon Biotech	214-984-6
Isopropyl Alcohol	Guangzhou Chemistry	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	-
Taq DNA Polymerase	TAKARA	R10T1
Goldview (nucleic acid stain)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar	OXID	-
Ampicillin	Sigma	69-52-3
Chloramphenicol	Sigma	56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit	Thermo	A36227
Kanamycin	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit	Thermo	L3000015
LR Reaction Kit	Thermo	11791019
Plasmid Extraction Kit	TIANGEN	DP103
Trans5α Chemically Competent Cell	TRANSGEN	CD201-01
Trytone	OXID	-
Yeast Extract	OXID	-
Primers and Sequence	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT	Synbio Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University