JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Трехмерный, бессывороточный метод культивирования стволовых клеток взрослой слезной железы (LG) хорошо зарекомендовал себя для индукции образования органоидов LG и дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Аннотация

Терапия на основе стволовых клеток слезных желез (LG) является перспективной стратегией для лечения заболеваний слезных желез. Однако отсутствие надежного, бессывороточного метода культивирования для получения достаточного количества стволовых клеток LG (LGSC) является одним из препятствий для дальнейших исследований и применения. Трехмерный (3D), бессывороточный метод культивирования для взрослых мышиных LGSC хорошо известен и показан здесь. LGSC могут непрерывно проходить и индуцироваться для дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Для первичной культуры LGSC ЛОГ от 6-8-недельных мышей переваривали диспазой, коллагеназой I и трипсином-ЭДТА. В общей сложности 1 × 104 одиночные клетки были засеяны в 80 мкл матричной матрицы гелеобразной среды стволовых клеток железы (LGSCM) в каждой лунке 24-луночной пластины, предварительно покрытой 20 мкл матричного геля-матрицы LGSCM. Смесь затвердевали после инкубации в течение 20 мин при 37 °C и добавляли 600 мкл LGSCM.

Для поддержания LGSC LGSC, культивируемые в течение 7 дней, были дезагрегированы на отдельные клетки путем диспазы и трипсина-ЭДТА. Одиночные клетки имплантировали и культивировали в соответствии с методом, используемым в первичной культуре LGSC. LGSC могут проходить более 40 раз и непрерывно экспрессировать маркеры стволовых / прогениторных клеток Krt14, Krt5, P63 и nestin. LGSC, культивируемые в LGSCM, обладают способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в ацинарные или протоковидные клетки in vitro и in vivo.

Введение

Стволовые клетки слезной железы (LGSC) поддерживают обновление клеток слезной железы (LG) и являются источником ацинарных и протоковых клеток. Поэтому трансплантация LGSC считается альтернативным подходом для лечения тяжелых воспалительных повреждений и водно-дефицитной болезни сухого глаза (ADD)1,2,3. Несколько методов культивирования были применены для обогащения LGSC. Tiwari et al. отделили и культивировали первичные клетки LG с использованием коллагена I и матричного геля, дополненного несколькими факторами роста; однако клетки LG нельзя было непрерывно культивировать4. Используя двумерную (2D) культуру, стволовые клетки, полученные из LG, были выделены You et al.5 и Ackermann et al. 6, было обнаружено, что он экспрессирует гены маркера стволовых клеток /предшественников, Oct4, Sox2, Nanog и nestin, и может быть субкультурирован. Тем не менее, нет четких указаний на то, что эти клетки могут дифференцироваться в ацинарные или протоковые клетки, и нет эксперимента по трансплантации для проверки потенциала дифференцировки in vivo.

Недавно c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-клетки были выделены из ЛОГ мышей с помощью проточной цитометрии, обнаружили экспрессию маркеров клеток-предшественников LG, таких как Pax6 и Runx1, и дифференцировали в протоки и ацины in vitro. У мышей с АДД ортотопическая инъекция с этими клетками может восстановить поврежденные ЛОГ и восстановить секреторную функцию ЛОГ2. Однако количество стволовых клеток, выделенных этим методом, было небольшим, и нет подходящих условий культивирования для расширения изолированных ЛГСК. Таким образом, необходимо создать соответствующую систему культивирования для эффективной изоляции и культивирования взрослых ЛГСК со стабильным и непрерывным расширением для изучения ЛГСК при лечении СДВ.

Органоиды, полученные из стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой группу клеток, которые гистологически похожи на родственные органы и могут поддерживать свое собственное обновление. После того, как органоид кишечника мыши был успешно культивирован Sato et al. в 2009году 7, органоиды из других органов культивировали последовательно, основываясь на системе культивирования Сато, таких как желчный пузырь8, печень9, поджелудочная железа10, желудок11, грудь12, легкие13, простата14 и слюнная железа15 . Из-за высокой доли взрослых стволовых клеток перед дифференцировкой клеток в органоидной культуре трехмерный (3D) метод органоидной культуры считается оптимальным для выделения и культивирования взрослых стволовых клеток LG.

Система культуры LGSC для взрослых мышей была создана в настоящем исследовании путем оптимизации метода 3D- культуры без сыворотки. Доказано, что LGSC, культивируемые как у нормальных, так и у мышей с добавленным добавлением, показали стабильную способность к самообновлению и пролиферации. После трансплантации в ДОБАВЛЕННЫЕ мышиные ЛОГ, LGSC колонизировали поврежденные ЛОГ и улучшили производство слезы. Кроме того, красные флуоресцентные LGSC были выделены из мышей ROSA26mT/mG и культивированы. Эта работа обеспечивает надежный ориентир для обогащения LGSC in vitro и аутотрансплантата LGSC в клиническом применении для терапии ADDED.

протокол

Все эксперименты в этом протоколе соответствовали руководящим принципам ухода за животными Этического комитета по испытаниям на животных Университета Сунь Ятсена. Все операции, связанные с ячейками, должны выполняться на ультрачистом верстаке в операционной ячейки. Все операции с использованием ксилола должны проводиться в вытяжных вытяжках.

1. Первичная культура LGSC

  1. Изоляция LG
    1. Возьмите 6-8-недельную самую мышь BALB / c и разрежьте кожу за ухом, чтобы обнажить LG и соединительную ткань вокруг нее. Отклейте соединительную ткань тупым рассечением с помощью пинцета и удалите LG.
    2. Дважды промойте ЛК 4 мл стерильного раствора PBS 10 мМ для удаления крови в посуде размером 6 см. Погрузите ЛК в 6 см посуду с 4 мл 75% этанола в течение 10 с и сразу же промойте 10 мМ PBS.
  2. Получение одиночных ячеек LG
    1. Используйте буферный раствор HEPES (50 мМ HEPES/KOH, рН 7,4; 150 мМ NaCl в сверхчистой воде) для приготовления диспазы 25 Ед/мл. Приготовьте 0,1% раствор коллагеназы I со сверхчистой водой.
    2. Разрезать ЛК на мелкие фрагменты (около 1мм3), перенести их в стерильную центрифужную трубку 15 мл и обработать ткани 500 мкл диспазы 25 Ед/мл и 500 мкл 0,1% коллагеназы I в течение 1 ч при 37 °C.
    3. Используйте 10 мМ PBS для приготовления раствора трипсина-ЭДТА (0,05 г/л трипсина, 0,04 г/л ЭДТА). Обрабатывают фрагменты LG со стадии 1.2.2 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 10 мин при 37 °C и диссоциируют фрагменты на одиночные клетки путем многократной пипетки.
    4. Отфильтруйте суспензию через фильтр 70 мкм, соберите фильтрат в стерильную центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 150 × г в течение 5 мин.
    5. После центрифугирования удалите супернатант, добавьте 10 мл 10 мМ PBS для промывки ячейки гранулы и центрифугируйте суспензию.
    6. Повторите шаг 1.2.5, удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM/F12 (смесь 1:1 модифицированной среды Eagle's Dulbecco и F-12 Ham) для повторного суспендирования клеточных гранул.
  3. Первичная культура LGSC
    1. Подготовьте среду стволовых клеток слезной железы (LGSCM), содержащую DMEM/F12, 1x N2 добавку, 1x B27 добавку, 2 мМ заменителя глутамина, 0,1 мМ YAAA (заменимые аминокислоты), 50 нг/мл мышиного эпидермального фактора роста (EGF), 100 нг/мл фактора роста фибробластов 10 (FGF10), 10 нг/мл Wnt3A и 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK).
    2. Добавьте 20 мкл матричного геля-матрицы LGSCM (матричный гель: LGSCM = 1:1) в центр лунки 24-луночной пластины. Используйте наконечник пипетки, чтобы расширить его до круга (диаметр 6-8 мм) и инкубировать смесь в течение 20 мин при 37 °C, чтобы предварительно покрыть лунку.
    3. Используйте счетчик клеток для определения количества клеток и добавьте 40 мкл LGSCM в общей сложности 1 × 104 клеток в 40 мкл матричного геля. Аккуратно смешайте их с пипеткой для получения матричной смеси гель-LGSCM (матричный гель: LGSCM= 1:1).
    4. Используйте пипетку, чтобы осторожно опустить 80 мкл смеси на предварительно покрытую область в каждой скважине 24-луночной пластины на стадии 1.3.2.
    5. Инкубировать смесь в течение 20 мин при 37 °C и добавить 600 мкл LGSCM.
    6. Меняйте культуральную среду в каждой лунке один раз в два дня. После 7 дней посева ищите сферы LGSC диаметром 100-300 мкм под инвертированным микроскопом (окуляр: 10x, объектив: 4x).
      ПРИМЕЧАНИЕ: LGSC можно культивировать в общей сложности более 14 дней.
  4. Изолируйте и культивируйте первичные LGSC мышей ROSA26mT/mG и мышей DED (NOD/ShiLtJ), следуя описанным выше шагам.

2. Обслуживание и прохождение LGSC

  1. Уберите культуральную среду из сферы культуры хорошо.
  2. Дезагрегировать сферы LGSC, культивируемые в течение 7 дней путем инкубации в 20 мкл диспазы 10 Ед/мл и 100 мкл 10 мМ PBS в течение 30 мин при 37 °C.
  3. Переложите суспензию в центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 150 × г в течение 4 мин. Удалите супернатант.
  4. Обрабатывайте сферы 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C. Добавляют 1 мл 0,05% ингибитора трипсина (TI) и пипетку многократно, чтобы нейтрализовать трипсин и диссоциировать сферы на отдельные клетки.
  5. Центрифугу при 150 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант для получения LGSC в грануле. Добавьте 1 мл LGSCM для повторного суспендирования гранулы LGSC.
  6. Обложите одиночные ячейки, как описано на этапах 1.3.1-1.3.6.

3. Дифференциация LGSC

  1. Процедура 1: Увеличение времени культивирования LGSC с 7 до 14 дней с помощью системы культур LGSC для случайной дифференциации.
  2. Процедура 2: Изменение соотношения матричного геля и смеси LGSCM с 1:1 до 1:2 в начале культуры LGSC для дифференцировки протоковых клеток. Поместите LGSC в матрицу для индукции в течение 14 дней (см. шаг 1.3).
  3. Процедура 3: После прохождения замените LGSCM смесью LGSCM-10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для дифференцировки ацинарных клеток. Вызывают дифференциацию в течение 14 дней.

4. Обезвоживание тканей LG

  1. Получить ткани LG (этап 1.1.1) и промыть ЛК 4 мл стерильного 10 мМ раствора PBS в посуде 6 см в течение 2 мин. Переместите ткани на 10% раствор формалина для фиксации в течение 24 ч.
  2. Промыть неподвижные ткани 10 мМ PBS в течение 2 мин, чтобы удалить формалин, и перенести ткань в коробку для встраивания тканей. Поместите встраиваемую коробку в автоматический дегидратор.
  3. Используйте автоматический дегидратор для обезвоживания тканей следующим образом: 70% этанол, 2 ч; 80% этанол - 2 ч; 90% этанол, 30 мин; 95% этанол, 30 мин; абсолютный этанол, 30мин; абсолютный этанол- 2 ч; абсолютный этанол: 100% смесь ксилола (1:1), 30 мин; 100% ксилол, 30 мин; 100% ксилол, 2 ч; 100% ксилол: парафиновая (1:1) смесь, 30 мин; парафин, 2 ч; парафин,3 ч.

5. Дегидратация органоидов/сфер LG

  1. Получить органоиды/сферы LG (этапы 2.1-2.3) в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и промыть органоиды/сферы LG 1 мл стерильного раствора PBS 10 мМ в течение 2 мин.
  2. Центрифугу при 100 × г в течение 1 мин и удаляют супернатант.
  3. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) следующим образом: добавьте 20 г PFA в смесь 400 мл 10 мМ PBS и 40 мкл 1 M NaOH, хорошо встряхните раствор и нагревайте его на водяной бане 65 °C в течение 2 ч до полного растворения PFA. После охлаждения до комнатной температуры используйте 10 мМ PBS, чтобы составить объем до 500 мл и хранить его при 4 °C.
  4. Добавьте 1 мл 4% PFA в микроцентрифужную трубку с органоидной/сферической гранулой и поместите трубку в холодильник с температурой 4 °C на срок не менее 24 ч для фиксации.
  5. После фиксации центрифугируют при 100 × г в течение 1 мин и удаляют надосадочный материал. Добавьте 1 мл 10 мМ PBS в микроцентрифужную трубку с органоидной/сферической гранулой и аккуратно перемешайте путем пипетирования в течение 2 мин, чтобы смыть PFA. Повторите этот шаг дважды.
  6. Центрифугу при 100 × г в течение 1 мин и удаляют супернатант.
  7. Нагревая встраиваемый гидрогель для растворения и добавления 50-60 мкл встраиваемого гидрогеля в органоидную/сферическую гранулу и смешивание. Пипетка смеси на парапленку в виде капли и подождите 5 мин, пока она затвердеет при комнатной температуре.
  8. Обезвоживайте гель с помощью органоидов/сфер в новой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл следующим образом.
    1. Добавьте в пробирку 1 мл 50% этанола, подождите 30 мин при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг, последовательно изменяя концентрацию этанола до 70%, 80%, 90%, 95%.
    2. Добавьте 1 мл абсолютного этанола в пробирку, подождите 30 мин при комнатной температуре и удалите жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг.
    3. Добавьте в пробирку 1 мл смеси 0,5 мл абсолютного этанола и 0,5 мл 100% ксилола, подождите 30 мин при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки.
    4. Добавьте в трубку 1 мл 100% ксилола, подождите 30 минут при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 5.8.5-5.8.6 должны выполняться в металлической ванне при температуре 65°С.
    5. Добавьте в трубку 1 мл смеси 0,5 мл парафина и 0,5 мл 100% ксилола, подождите 30 мин при 65 °C и удалите жидкость из трубки путем пипетки.
    6. Добавьте 1 мл парафина в пробирку, подождите 30 мин при 65 °C и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг и увеличьте время обработки до 1 ч.

6. Встраивание и секционирование парафина

  1. Встраивание парафина
    1. Перед встраиванием включите машину для встраивания и предварительно разогрейте ее, чтобы расплавить парафиновый воск в резервуаре для парафина.
    2. Поместите обезвоженную ткань или органоидный /сферический гель в канавку железной коробки для встраивания и поместите железную коробку в парафин машины для встраивания.
    3. Снимите пластиковую крышку и поместите пластиковую коробку для встраивания на железную коробку, чтобы покрыть ее. Переместите встраиваемую железную коробку на охлаждающий стол.
    4. После того, как парафин сконденсировался в блоки во встраиваемом ящике, извлеките его из железной коробки и нарежьте его непосредственно или временно храните в холодильнике с температурой 4 °C.
  2. Парафиновое секционирование
    1. Перед нарезкой парафина предварительно соберите слайсер парафина и добавьте дистиллированную воду в раковину слайсера для предварительного нагрева. Начинайте нарезку, когда температура воды поднимется до 42 °C.
    2. Закрепите образец на прорези образца парафинового слайсера. Отрегулируйте толщину сечения до 5 мкм во время нарезки.
    3. Секционируйте образец непрерывно. Исправьте полностью мозаичный участок на противоскользящем слайде в баке слайсера.
    4. После секционирования поместите слайды, прикрепленные к образцу ткани, в биохимический инкубатор при температуре 37 °C для сушки в течение 24 ч. Временно храните слайды в холодильнике при температуре 4 °C.

7. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Расплавьте парафиновые срезы при 60 °C в течение 30 мин, замочите срезы в 100% ксилоле в течение 15 мин и повторите.
  2. Обработать срезы абсолютным этанолом на шейкере в течение 5 мин.
  3. Обработайте секции 90% этанолом, 80% этанолом и 70% этанолом на шейкере, каждый в течение 3 мин.
  4. Обработайте участки деионизированной водой на шейкере в течение 5 мин и 2 мин последовательно.
  5. Окрашивайте срезы на влажную коробку в течение 5 мин раствором гематоксилина 4 мг/мл. Смойте участки в проточной воде в течение 10 минут.
  6. Перемешайте срезы на шейкере сначала деионизированной водой в течение 2 мин, а затем 0,5%-1% эозином в течение 1 мин.
  7. Перемешиваем участки 70% этанолом, 80% этанолом и 90% этанолом на шейкере в течение 3 мин (каждый) последовательно. Перемешайте срезы абсолютным этанолом на шейкере в течение 5 мин.
  8. Замочите срезы в 100% ксилоле на 15 мин и повторите замачивание.
  9. Используйте пипетку или капельницу, чтобы добавить 3-4 капли нейтрального бальзама на слайд, и медленно накройте его закрывающим слайдом. Высушите горки на воздухе при комнатной температуре.

8. Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание

  1. Расплавите парафиновые срезы при 60 °C в течение 30 мин, замочите срезы в 100% ксилоле в течение 10 мин и повторите этот шаг дважды.
  2. Перемешивают срезы на шейкере сначала абсолютным этанолом, 90% этанолом и 80% этанолом в течение 2 мин (каждый), последовательно, а затем деионизированной водой в течение 3 мин. Повторите перемешивание деионизированной водой дважды.
  3. Перемешивают срезы на шейкере сначала смесью 20 мл 30%H2O2 и 180 мл метанола в течение 10 мин, а затем деионизированной водой в течение 5 мин. Повторите этот шаг три раза.
  4. Переложите срезы в предварительно сваренный буфер лимонной кислоты (1 л деионизированной воды с 3 г Na3C6H5O7,2H 2O и 0,4 г C6H8O7, pH 6,0), микроволновую печь в течение 10 мин, чтобы держать их в докритической температуре кипения, и охлаждать при комнатной температуре в течение 30 мин. Перемешайте срезы деионизированной водой на шейкере в течение 5 мин. Повторите этот шаг три раза.
  5. Перемешайте срезы 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин, и повторите этот шаг три раза. Обложите область ткани на влажной коробке водоотталкивающим маркером, добавьте каплю готовой к употреблению неиммунной козьей сыворотки для покрытия образцов и поместите их при комнатной температуре на 1 ч.
  6. Удалите сыворотку, добавьте первичные антитела к образцам (см. Таблицу материалов) и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Удалите первичное антитело, перемешайте срезы с 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин и повторите этот этап перемешивания с 10 мМ PBS три раза.
  7. Добавляют вторичные антитела (см. Таблицу материалов) для покрытия образцов и инкубируют их на влажном ящике в течение 30 мин при комнатной температуре. Перемешайте срезы с 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин, и повторите шаг перемешивания три раза.
  8. Добавьте свежеприготовленный 0,03-0,05% раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB) для покрытия образцов на влажной коробке и окрашивания в течение 30-90 с. Смойте участки проточной водой в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте время окрашивания, наблюдая под световым микроскопом до появления желтого цвета.
  9. Добавьте 4 мг/мл раствора гематоксилина для покрытия образцов, окрашивайте в течение 5 мин на влажном ящике и промывайте участки проточной водой в течение 10 мин.
  10. Перемешайте секции на шейкере с 80% этанолом, 90% этанолом и абсолютным этанолом в течение 2 мин каждый, последовательно, и замочите секции в 100% ксилоле в течение 30 мин.
  11. Используйте пипетку или капельницу, чтобы добавить 3-4 капли нейтрального бальзама на слайд, и медленно накройте его закрывающим слайдом. Высушите горки на воздухе при комнатной температуре.

9. Глобальное иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов/сфер

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите органоиды/сферы, зафиксированные 4% раствором PFA в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл (см. шаги 5.1-5.4). Выполните флуоресцентную маркировку следующим образом.

  1. Обезвоживать органоиды/сферы, добавляя в пробирку 1 мл 30% раствора сахарозы и инкубировать его на ночь в холодильнике при 4 °C.
  2. Добавьте 100 мкл раствора PBST (10 мМ раствора PBS с 0,1% Triton X-100) в трубку для промывки органоидов/сфер в течение 5 мин, центрифугируйте трубку при 100 × г в течение 1 мин и соберите гранулу. Повторите этот шаг три раза.
  3. Добавить в тюбик 0,5-1 мл готовой к употреблению неиммунной козьей сыворотки и запечатать ее при комнатной температуре на 1 ч. Центрифугируют пробирку при 100 × г в течение 1 мин и собирают гранулы.
  4. Добавьте несколько капель разбавленного первичного антитела, чтобы просто покрыть гранулу и инкубировать в холодильнике при 4 °C в течение 48 ч. Центрифугируют пробирку при 100 × г в течение 1 мин и собирают гранулы.
  5. Повторите шаг 9.2.
  6. Добавьте несколько капель флуоресцентного вторичного антитела и раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в трубку, чтобы просто накрыть гранулу и инкубировать в холодильнике при 4 °C в течение 24 ч, избегая света.
  7. Повторите шаг 9.2, избегая света.
  8. Добавьте 100 мкл раствора PBST в пробирку и временно храните его в холодильнике с температурой 4 °C вдали от света. Наблюдайте и фотографируйте органоиды/сферы с помощью сканирующего микроскопа.

10. LGSC pLX-mВечерная трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Производство лентивирусных частиц должно осуществляться в шкафу биобезопасности и чистом стенде на уровне биобезопасности BSL2.

  1. Культивируйте лентивирусную упаковочную ячейку 293T в 6-луночную пластину с DMEM + 10% FBS при 37 °C, 5% CO2 в течение 3-5 дней для достижения 80% клеточной конфюентности.
  2. Трансфектируйте лентивирусный вектор pLX-mCherry в LGSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат реагента показан для одной лунки из 6-луночной пластины.
    1. Подготовьте две стерильные центрифужные трубки объемом 1,5 мл и добавьте 250 мкл DMEM/F12 в каждую трубку.
    2. Добавьте 7,5 мкл трансфекционного реагента в одну трубку и тщательно перемешайте реагент путем пипетирования.
    3. Добавьте 2 мкг плазмиды pLX-mCherry без эндотоксина и соответствующей плазмиды лентивирусной упаковки в другую трубку и добавьте трансфекционный реагент (2 мкл/мкг плазмиды).
    4. Смешайте жидкость в обеих центрифужных трубках и дайте смеси постоять 5 минут при комнатной температуре.
    5. Удалите питательную среду из клеток 293T и добавьте смесь из стадии 10.2.4 в клетки 293T. Через 8 ч изменить питательную среду на свежую ДМЭМ +10% ФБС.
    6. Через 48 ч впервые соберите супернатант вируса и отфильтруйте его через фильтр 0,45 мкм. Через 72 ч соберите супернатант вируса во второй раз и снова отфильтруйте его через фильтр 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните оба фильтрованных супернатанта на льду до трансдукции лентивируса.
  3. Получите LGSC от мышей DED (NOD/ShiLtJ) (см. шаг 1).
  4. Добавьте 1 мл предварительно собранного супернатанта pLX-mCherry lentivirus для повторного суспендирования клеток.
  5. Установите трубку центрифуги на шейкер в инкубаторе CO2 при 37 °C. Встряхните его со скоростью 100 оборотов в минуту, чтобы максимизировать контакт между лентивирусом и клетками. Через 8 ч центрифугируют смесь при 250 × г в течение 4 мин и удаляют надосадочное вещество.
  6. Добавьте 1 мл DMEM/F12 для повторного суспендирования гранулы клетки. Используйте счетчик клеток для определения количества клеток и засейте в общей сложности 1 × 104 клеток в 100 мкл матричного геля-матрицы LGSCM (матричный гель: LGSCM = 1:1) в каждую лунку из 24-луночной пластины, предварительно покрытой 20 мкл матрицы гель-LGSCM (см. шаг 1.3.2).
  7. После 7 дней культивирования (см. шаг 1) выберите сферы, демонстрирующие красную флуоресценцию под флуоресцентным микроскопом, чтобы расширить культуру.

11. Ортотопическая трансплантация LGSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические операции выполняются в операционной SPF, а все хирургические инструменты стерилизуются.

  1. Получите сферы LGSC у мышей ROSA26mT/mG с красной флуоресценцией (td-Tomato) или трансфекцией mCherry, культивируемых в течение 7 дней (см. шаг 1).
  2. Перед использованием охладите микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую смесь матричного геля 1:1 и DMEM/F12. Переваривайте сферы LGSC в отдельные клетки и повторно суспендируйте клетки с плотностью 2 × 106 клеток / мл в трубке.
  3. Анестезируют мышей NOD/ShiLtJ внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь NOD / ShiLtJ является идеальной моделью с идиопатическими симптомами ADD, включая снижение секреции слезы, воспалительную инфильтрацию и орбитальное изъязвление.
  4. После анестезии используйте физиологический раствор или ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость, а затем используйте офтальмологические ножницы, чтобы сделать 5-8 мм разрез в коже за ухом (около глаза) анестезирующих мышей, чтобы обнажить ЛОГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Йодофор следует строго использовать для дезинфекции вокруг разреза.
  5. Вводят 2 × 104 клеток в левую сторону LG и вводят смесь без клеток (см. шаг 11.2) в правую сторону LG в качестве контроля.
  6. После инъекции восстановить ЛОГ в исходное положение с помощью офтальмологических щипцов и зашить рану. Кормите мышей в течение 2 месяцев и наблюдайте за эффектом лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материал подушки клетки также должен быть строго стерилизован после операции, а материал подушки должен заменяться один раз в день. После наложения швов раны трамадол можно выборочно вводить в хвостовую вену мышей в стандартной дозе 2,5 мг/кг для достижения анальгезии.
  7. Обезболивают этих мышей через 2 месяца после эксперимента (см. шаг 11.3). Снимают симптомы глазной области.
    1. Во время анестезии ищите следующие симптомы: расслабление мышц шеи и конечностей; глубокое, медленное и устойчивое дыхание; сужение зрачка; исчезновение роговичного рефлекса.
    2. Во время анестезии и операции поддерживайте температуру тела мышей на уровне 37 °C. После операции добавьте соответствующие антибиотики в питьевую воду для мышей, чтобы снизить риск раневой инфекции. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не придут в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Не возвращайте мышей, перенесших операцию, в компанию других мышей до полного выздоровления.
    3. После съемки симптомов глазной области откройте программное обеспечение ImageJ, нажмите на Файл | Открыть | От руки выберите, удерживайте левую кнопку мыши и выберите область изъязвления орбиты на изображении. Нажмите на Анализ | Мера для получения относительной площади изъязвления.
  8. Нанесите фенольную красную хлопчатобумажную нить на боковую кантус анестезирующих мышей на 10 с; измерить и записать длину обесцвеченной части хлопчатобумажной нити. Усыпляют мышей вывихом шейного позвонка после измерения слезы.
  9. Рассекните мышей и получите ЛОГ для анализа IHC.

12. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом предварительно охладите центрифугу до 4 °C и убедитесь, что все реагенты и расходные материалы не загрязнены РНКазой.

  1. Соберите LGSC или фрагменты LG в микроцентрифужной трубке. Добавьте 1 мл буфера лизиса клеток и полностью лизируйте клетки или ткани вихревым колебанием.
  2. Добавьте 0,2 мл хлороформа, и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 10 мин после вихревого колебания в течение 1 мин. Центрифуга в течение 15 мин при 4 °C, 12 000 × г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования жидкость делится на три слоя, а РНК находится в самой верхней прозрачной водной фазе.
  3. Аккуратно выложите в пипетку самую верхнюю прозрачную водную фазу и перенесите ее в новую 1,5 мл центрифужную трубку без РНКазы.
  4. Добавьте равный объем изопропилового спирта и аккуратно перемешайте. Дайте смеси постоять при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем центрифугируйте в течение 15 мин при 4 °C, 12 000 × г.
  5. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 75% этанола. Инвертировать трубку для промывки гранул и центрифуги в течение 5 мин при 4 °C, 7 500 × г. Повторите этот шаг.
  6. Осторожно удалите супернатант и поместите трубку центрифуги в ультрачистый верстак, чтобы высушить его в течение примерно 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к следующему шагу, когда белая гранула станет полупрозрачной. Проводить все операции на льду.
  7. Добавьте 20 мкл воды без РНКА, чтобы полностью растворить гранулу. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов) и храните раствор РНК при -80 °C.

13. ПЦР

  1. Реакция обратной транскрипции
    1. Добавьте 1 мкг общей РНК (рассчитайте объем добавленного раствора РНК в соответствии с концентрацией раствора РНК) в реакционную трубку ПЦР и инкубируйте при 65 °C в течение 5 мин для денатурации.
    2. Положите его на лед в течение 1 мин, а затем добавьте воду без ферментов, пока общий объем не достигнет 12 мкл. Добавьте 4 мкл 4x DNA Master Mix и инкубируйте его при 37 °C в течение 5 мин.
    3. Положите трубку на лед, добавьте 4 мкл 5x RT Master Mix и аккуратно перемешайте. Установите следующие настройки ПЦР: 37 °C в течение 15 мин, 50 °C в течение 5 мин, 98 °C в течение 5 мин, 4 °C в течение 1 мин.
    4. Храните его при -20 °C или переходите к следующему шагу после завершения реакции обратной транскрипции.
  2. Реакция ПЦР
    1. Готовят реакцию ПЦР в ПЦР-трубке следующим образом: 14,1 мкл безферментной воды, 2 мкл dNTP, 2 мкл 10x Buffer, 0,8 мкл Primer (10 мкМ, 0,4 мкл Forward Primer и 0,4 мкл обратного праймера, см. Таблицу материалов), 1 мкл кДНК обратной транскрипции (см. стадию 13.1) и 0,1 мкл фермента Taq.
    2. Поместите подготовленную реакцию ПЦР в аппарат ПЦР для ПЦР. Обратитесь к инструкциям набора ферментов Taq для процедуры ПЦР (см. Таблицу материалов).
  3. Электрофорез агарозного геля
    1. Используйте аналитические весы для взвешивания 242 г Tris и 37,2 г Na2EDTA·2H2Oи добавьте их в стакан емкостью 1 л. Добавьте ~ 800 мл деионизированной воды и 57,1 мл ледниковой уксусной кислоты в стакан, хорошо перемешайте, добавьте деионизированную воду до 1 л, чтобы получить 50-кратный буфер TAE, и храните ее при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте 50x TAE буфер деионизированной водой перед использованием.
    2. Используйте аналитические весы, чтобы взвесить 1,2 г агарозы и добавить ее в коническую колбу, содержащую 80 мл 1x буфера TAE. Нагревайте его несколько раз в микроволновой печи до полного растворения.
    3. Охладите колбу под проточной водопроводной водой до тех пор, пока температура раствора не упадет до 60 °C. Добавить 8 мкл пятна нуклеиновой кислоты, после хорошего перемешивания влить раствор в желатинирующий бак, поместить гребень и дать ему постоять при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Вытащите гребень и загрузите продукты ПЦР в приготовленный агарозный гель. Выполняют электрофорез при 120 В в течение 30 мин.
    5. Поместите гель в систему визуализации ECL Gel и сфотографируйте.

Результаты

Создание 3D-системы культуры без сыворотки
В этом исследовании был разработан LGSCM, содержащий EGF, Wnt3A, FGF10 и Y-27632 для мышиных LGSC, и LGSC были успешно выделены и культивированы методом 3D-культуры (рисунок 1A). С помощью этого метода16 была создана успешная 3D...

Обсуждение

Существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы выделения и культивирования in vitro слезных стволовых клеток для культуры слезных стволовых клеток и восстановления повреждений LG. Шатос и др.17 и Акерманни др. 6 успешно культивируемых и субкультурных сл...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 31871413) и двумя программами гуандунской науки и техники (2017B020230002 и 2016B030231001). Мы искренне благодарны исследователям, которые помогли нам во время исследования, и сотрудникам, работающим в центре для животных, за их поддержку в уходе за животными.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Animal(Mouse)
Bal B/CModel Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6JLaboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJModel Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mGModel Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balanceSartorius
Automatic dehydratorThermo
Blood counting chamberBLAU
Cell CounterCountStar
CO2 constant temperature incubatorThermo
ECL Gel imaging systemGE healthcare
Electric bath for water bathYiheng Technology
Electrophoresis apparatusBioRad
Fluorescence quantitative PCR instrumentRoche
Frozen tissue slicerLecia
Horizontal centrifugeCENCE
Inverted fluorescence microscopeNikon
Inverted microscopeOlympus
Laser lamellar scanning micrographCarl Zeiss
Liquid nitrogen containerThermo
Low temperature high speed centrifugeEppendorf
MicropipettorGilson
Microwave ovenPanasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometerThermomeasure RNA concentration
Paraffin slicing machineThermo
PCR AmplifierEppendorf
pH value testerSartorius
4 °C RefrigeratorHaier
Thermostatic culture oscillatorZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrumentThermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigeratorThermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigeratorThermo
Ultra pure water purification systemELGA
Reagent
Animal Experiment
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
Pentobarbital SodiumSigma57-33-0
Cell Culture
B27Gibco17504044
Collagenase IGibco17018029
DispaseBD354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSOSigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
Foetal Bovine SerumGibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
Human FGF10PeproTech100-26
Matrigel (Matrix gel)BD356231
Murine NogginPeproTech250-38
Murine Wnt3APeproTech315-20
Murine EGFPeproTech315-09
NEAAGibco11140050
N2Gibco17502048
R-spondin 1PeproTech120-38
Trypsin Inhibitor (TI)SigmaT6522Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
TrypsinSigma T4799
Y-27632SelleckS1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgGThermoA-21202Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgGThermoA-21206Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgGThermoA-10037Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgGThermoA-10042Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibodyAbcamab104751Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibodyAbcamab11512Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibodyAbcamab181595Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibodyAbcamab15580Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibodyAbcamab125096Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibodyAbcamab167453Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7Sangon BiotechA501702-0500
Citric AcidSangon Biotech201-069-1
DAB Kit (20x)CWBIOCW0125
DAPIThermo62248
EosinBASO68115
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
FormalinSangon BiotechA501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP)Abcamab6789Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP)Abcamab6721Used dilution: 2 μg/mL
HematoxylinBASO517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel)ThermoHG-400-012
30% H2O2Guangzhou ChemistryKD10
30% Hydrogen Peroxide SolutionGuangzhou Chemistry7722-84-1
MethanolGuangzhou Chemistry67-56-1
Na3C6H5O7.2H2OSangon BiotechA501293-0500
Neutral balsamSHANGHAI YIYANGYY-Neutral balsam
Non-immunized Goat SerumBOSTERAR0009
ParaffinSangon BiotechA601891-0500
ParaformaldehydeDAMAO200-001-8
SaccharoseGuangzhou Chemistry57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrateSangon Biotech200-675-3
SucroseGuangzhou ChemistryIB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. CompoundSAKURASAKURA.4583
Triton X-100DINGGUO9002-93-1
XyleneGuangzhou Chemistry128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
AgaroseSigma9012-36-6
AlcoholGuangzhou Chemistry64-17-5
ChloroformGuangzhou Chemistry865-49-6
Ethidium BromideSangon Biotech214-984-6
Isopropyl AlcoholGuangzhou Chemistry67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO-
Taq DNA PolymeraseTAKARAR10T1
Goldview (nucleic acid stain)BioSharpBS357A
TRIzolMagenR4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
AgarOXID-
AmpicillinSigma69-52-3
ChloramphenicolSigma56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction KitThermoA36227
KanamycinSigma25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection KitThermoL3000015
LR Reaction KitThermo11791019
Plasmid Extraction KitTIANGENDP103
Trans5α Chemically Competent CellTRANSGENCD201-01
TrytoneOXID-
Yeast ExtractOXID-
Primers and SequenceCompany
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vectorAddgene
pENRTY-mCherryXiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

Ссылки

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены