微图案牵引显微镜的图案生成

摘要

我们描述了测量细胞牵引力的标准方法的改进，该方法基于微接触印刷，具有软水凝胶上细胞外基质蛋白点阵列的单个减法图案化步骤。这种方法允许更简单，更一致地制造岛状图案，这对于控制细胞簇形状至关重要。

摘要

微图案牵引显微镜允许控制单个细胞和细胞簇的形状。此外，在微米长度尺度上图案的能力允许使用这些图案化的接触区来测量牵引力，因为每个微图案点允许形成单个焦点粘附，然后使柔软的底层水凝胶变形。这种方法已被用于广泛的细胞类型，包括内皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，血小板和上皮细胞。

本综述描述了允许细胞外基质蛋白以预定大小和间距的常规点阵列印刷到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术的演变。由于微米级图案很难直接打印到软基板上，因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案，然后在凝胶化过程中使用图案转移到水凝胶上。首先，描述了在盖玻片上生成小点阵列的原始微接触打印方法。第二步是去除大部分图案以留下小点岛，以控制这些图案点阵列上细胞和细胞簇的形状。

接下来，描述了这种方法的演变，该方法允许使用单个减法图案化步骤生成点岛。这种方法对用户来说大大简化了，但缺点是制造图案所需的母模寿命缩短。最后，描述了为分析位移点图像和随后的细胞产生的牵引场而开发的计算方法，并提供了这些分析包的更新版本。

引言

大多数细胞表型对其环境施加牵引力。这些牵引力是由细胞的收缩细胞骨架产生的，这是肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白^1，2，^3，4的网络。细胞内产生的力可以传递到细胞外环境或相邻细胞，主要通过跨膜蛋白如整合素和钙粘蛋白，分别为^5，6。细胞如何扩散或收缩 - 以及与这些运动相关的牵引力的大小 - 是与其环境进行密切对话的结果，这在很大程度上取决于细胞外基质中存在的蛋白质的类型和数量（ECM）^7，8以及ECM的硬度。事实上，牵引力显微镜已成为了解细胞对局部刺激（如基底刚度，施加的机械应力和应变或与其他细胞接触）的反应的宝贵工具。该信息与癌症和哮喘等疾病的理解直接相关^{9，10，11，12}。

需要一个可用于测量已知材料特性的基板的力诱导变形的系统来计算牵引力。这些变化必须随着时间的推移而跟踪，这需要成像和图像处理技术。用于确定细胞牵引力的首批方法之一是观察和分析接种有细胞的胶原蛋白水凝胶的收缩，尽管这种方法只有半定量¹³。另一种更精细的方法是通过确定由硅胶薄片¹⁴变形引起的力来测量单个电池施加的牵引力。后来，开发了更多的定量测量技术，这些方法还允许使用软水凝胶，如聚丙烯酰胺（PAA）^12，15，16。当使用这些软材料时，牵引力可以通过嵌入水凝胶中的随机置换珠的力诱导位移和凝胶^16，17的机械性能来确定。另一个进步来自由软聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微柱阵列的发展，以便可以使用梁理论¹⁸测量其挠度并将其转换为力。

最后，开发了用于微图案化软水凝胶的方法，因为这些方法可以控制细胞粘附的接触区域。通过测量微图案在细胞接触区域内的变形，可以很容易地计算出牵引力，因为不需要无力参考图像¹⁹。该方法已被广泛采用，因为它允许将微米大小的离散荧光蛋白粘附点的常规阵列间接图案化到PAA凝胶上，以测量细胞牵引力²⁰。为了计算这些力，^{已经开发了一}种图像处理算法，该算法可以在不需要用户输入的情况下跟踪每个微图案点的运动。

虽然此方法对于创建点图案的整个网格很简单，但是当需要点的孤立补丁（或岛）图案时，它更复杂。当需要控制细胞簇的形状和一定程度的大小时，微图案化岛屿是有用的。为了创建这些岛屿，上述微接触印刷方法需要两个不同的步骤:i）使用一个PDMS图章在盖玻片上创建点的高保真图案，然后ii）使用第二个不同的PDMS图章来去除大部分这些点，留下孤立的点²¹岛。使用这种原始方法创建岛屿的难度由于在过程的第一步中制作一致的网格模式本身就具有挑战性而变得更加复杂。缩微印刷邮票由一系列圆形微柱组成，其直径对应于所需的点大小。然后将这些印章涂上均匀的蛋白质层，然后在经过处理的盖玻片上施加精确压力，以创建所需的图案。一方面，对印章施加太大的压力会导致蛋白质转移不均匀，并且由于柱子之间的屈曲或下垂导致与玻璃接触，从而导致图案保真度差。另一方面，施加太小的压力会导致蛋白质转移很少或没有，并且图案保真度差。由于这些原因，需要一种传输过程，该过程可用于在短短一步内始终如一地创建孤立的点岛的高质量微图案。

本文描述了一种将微米级荧光蛋白粘附点的岛间接微图案化到PAA凝胶上的方法，该凝胶比以前开发的方法更加一致和通用。虽然较旧的间接微图案化方法依赖于蛋白质图案从PDMS图章转移到中间底物，但这里介绍的方法使用PDMS图章代替蛋白质去除的容器，而不是添加。这是通过首先从根本上改变所使用的PDMS图章的结构来完成的。在这种方法中，邮票不是制作由均匀间隔的圆柱图案组成的邮票，而是由均匀间隔的圆孔图案组成。

有了这个新结构，这些PDMS印章的表面可以用戊二醛处理，如前所述^20，29，30，使印章能够与蛋白质共价键合。当用于均匀涂有荧光蛋白的玻璃盖玻片上时，这些经过戊二醛处理的PDMS印章用于去除盖玻片表面上的大部分蛋白质，仅留下由印章上微米大小孔的位置预先确定的所需点图案。此更改提高了生成由近乎连续的点网格组成的模式的成功率，并且只需一步即可创建孤立的点岛。

研究方案

1. 创建硅胶母带

注意:用于PDMS印章重复成型的硅母版的设计，创建和故障排除的大部分过程已在前面²¹中介绍过，因此这里将仅介绍这种新方法的关键差异。

1. 使用 AutoCAD 或类似设计软件创建光掩模的设计。在光掩模的一侧涂上一层薄薄的玻璃，涂上一层薄薄的铬，以控制紫外线的散射。设计光掩模，使紫外线穿过它照射到所选的光刻胶上，将创建一个有机硅母版，其特征与最终PDMS图章上所需的特征相反。有关此掩码的设计，请参见 图 1 。
   注意:所需的特征或它们外部的区域是否应在光掩模上透明，这取决于所选的光刻胶。这里使用的光刻胶是SU-8 2005（注意:易燃，皮肤和眼睛刺激;远离热/火焰/火花，并在处理时使用防护手套和眼镜），一种负光刻胶，能够使5μm高的特征，具有近乎垂直的侧壁。
   1. 通过将负光刻胶暴露在紫外线下并用化学溶剂除去未固化的SU-8来固化负光刻胶。因此，将蒙版的主要特征设计为透明，而蒙版的周围区域是不透明的。
   2. 对于这种新的去除方法，设计光掩模使其由两个1.5 x 1.5厘米的正方形组成（图1A），一个充满2μm圆的偶数网格，中心到中心间隔6μm，另一个由许多方形岛组成，这些方形岛是相同网格图案的较小，孤立的版本（图1B）。制作以下大小的岛屿:6 x 6 点、12 x 12 点、25 x 25 点和 42 x 42 点。
      注意:粘附点（2μm）的直径是根据先前测量细胞牵引力^22，23的研究选择的。这里使用的面罩为101.6 x 101.6 mm，一侧涂有0.06μm厚的铬层，由于母版功能小，因此建议使用。这里使用的光掩模是从一家外部光掩模印刷公司委托的。
2. 在洁净室中，用光刻胶均匀地涂覆所选的硅片。作为可选步骤，在用抗蚀剂涂覆晶圆之前，先在等离子体中对晶圆进行表面处理。
   注:这里使用直径为100 mm的晶圆。在等离子体灰泥中进行处理使晶圆更适合与SU-8结合，并有助于防止SU-8从晶圆上分层。
3. 根据光刻胶制造商的说明执行以下步骤:
   1. 旋转涂层晶圆以创建所需的特征厚度，并根据所需的厚度和光刻胶类型改变旋转时间。对于 5 μm 厚的 SU-8 2005，将推荐的自旋程序分为以下三个步骤:
      1. 用光刻胶涂覆晶圆，以500 RPM旋转10秒，斜坡为100 RPM / s。
      2. 通过将晶圆以 3，000 RPM 旋转，以 300 RPM/s 的斜坡旋转 30 s，将光刻胶厚度减小到约 5 μm。
      3. 旋转后，通过将速度降低到0 RMP，以500 RPM / s的斜坡持续1 s，缓慢减速晶圆。
   2. 通过在95°C热板上短暂烘烤来准备抗紫外线照射的抗蚀剂。根据所需的光刻胶厚度修改在加热板上花费的时间;对于 5 μm 厚的 SU-8 2005，烘烤时间为 2 分钟。
   3. 将抗蚀剂暴露在紫外线下，以完全固化所需的特征。要警惕过度曝光，因为这会使SU-8变脆并影响最终母版的整体质量。
      1. 2005 年，使用 105 mJ/cm² 的 5 μm 厚 SU-8 的曝光能量。根据可用紫外灯的功率，通过将曝光能量除以灯的功率（以mW为单位）来计算曝光时间。
         注:由于此处使用的灯的功率为8 mW，因此曝光时间应为13.1 s。
   4. 要在开发后设置SU-8功能，请在95°C热板上再次烘烤，这次烘烤3分钟。如果光刻胶正确暴露，请等待在此烘焙步骤中1分钟内出现母版的所需特征。
   5. 使用SU-8显影剂从硅片中取出未固化的SU-8。去除未固化的SU-8时要彻底，因为它可能会卡在晶圆上的微米级和间隔特征之间。
      注意:SU-8显影剂是易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花，并在处理时使用防护手套和眼镜。
   6. 开发后，用丙酮冲洗以去除晶圆上多余的显影剂，并用氮气喷枪将其完全干燥。
      注意:丙酮是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离火焰/火花，并在处理时使用防护手套和眼镜。
   7. 或者，对于SU-8 2005，在200°C热板上烘烤10分钟。
      注意:这种硬烘烤增加了光刻胶的机械强度。
4. 冷却后，将晶圆放入晶圆载体托盘中，然后将其浇铸在PDMS中。首先，在晶圆上完成硅烷化处理，使硅母体的SU-8特征不太可能与PDMS结合，从而不太可能从晶圆表面去除。
   1. 要完成硅烷化表面处理，请将主玻璃盖玻片和小玻璃盖玻片放置在仅与硅烷一起使用的干燥器内。将1-2小滴三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷滴到盖玻片上，关闭干燥器，并在4，500 Pa²⁴的压力下真空运行30分钟。
      注意:三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花，处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。
   2. 关闭真空，将主液和盖玻片在干燥器中再放置30分钟。
      注: 主控设备现在已准备好在 PDMS 中进行转换。

2. 减材微接触印刷

1. 根据制造商的说明，以固化剂与碱的正确比例混合PDMS。让它在室温和压力下静置15分钟;然后，在真空下脱气15分钟。
2. 将PDMS倒入主控中，并将其放入设置为37°C的培养箱中过夜以固化。
3. 从培养箱中取出母版，使其冷却至室温。
4. 当主卧冷却时，在乙醇中超声处理25毫米盖玻片10分钟。使用与正在准备的邮票数量一样多的盖玻片。
5. 用去离子 （DI） 水彻底冲洗 25 毫米盖玻片，并使用过滤气枪擦干。
6. 等离子体在高真空（射频功率为30 W）下使用等离子体清洁器处理盖玻片1分钟。确保在处理后缓慢释放真空，以防止盖玻片在腔内移动。
   注:玻璃表面的等离子体处理有两个目的:它清洁玻璃表面以除去污染物，并在玻璃表面产生氧基极性基团以使其疏水²⁵。这种疏水性使玻璃表面更适合蛋白质结合。
7. 在没有阳光直射/头顶照明的房间中，用100μL荧光标记的蛋白质溶液涂覆每个盖玻片，浓度至少为100μg/ mL，盖上盖子以提供额外的光保护，让它静置20分钟。
   注意:这里使用从人血浆中分离并用AlexaFluor 488染色的纤连蛋白。
   1. 要染色纤连蛋白，将已知浓度和体积的未标记纤连蛋白与1.5 mL管中适量的荧光染料结合。用铝箔覆盖管以保护染料免受光照，并在室温下孵育1小时，通过将管倒置5-10次，每10分钟轻轻混合一次。
      注意:所需的染料量因使用的染料和所使用的蛋白质质量而异。请参阅 补充文件 1 ，了解用于确定标有 Alexa 488 的纤连蛋白的适当染料量的计算器。根据制造商的说明，可以使用脱盐柱过滤掉多余的染料（见 材料表）。
8. 用去离子水彻底冲洗每个盖玻片，并通过轻轻敲击每个盖玻片的侧面到纸巾或类似吸水材料上，从表面上去除多余的水分。将盖玻片在黑暗中保持至少30分钟，以使其完全干燥。
9. 当蛋白质涂层的盖玻片干燥时，用手术刀或其他锋利的刀片切割，从母版上取下PDMS印章。
   注意:最好不要在第一次尝试时尝试切穿PDMS，因为施加如此大的压力会使硅晶片破裂并损坏母片。
10. 等离子体在高真空（射频功率为30 W）下处理PDMS印章2分钟。
11. 在通风橱内，将邮票放在带盖的容器中，并在每个印章上涂上一层非常薄的 <10%（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（3-APTMS），用100%乙醇稀释。
    注意:3-APTMS是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离火焰/火花，处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。过量的3-APTMS溶液涂层将导致在此过程中的后期形成橙色薄膜。这种3-APTMS表面处理将胺官能团纳入PDMS印章的表面，这将允许在²⁶日晚些时候进一步衍生出印章的表面。
12. 用印章盖住容器，让它们在室温下静置5分钟。
13. 使用去离子水，彻底冲洗两面的每个印章。
14. 将邮票放在干净的容器中，并在去离子水中充分涂上2.5%戊二醛。
    注意:戊二醛是有毒的;在通风橱下处理和工作时使用防护手套和眼镜）。这种戊二醛处理与先前的3-APTMS处理一起在PDMS印章的表面提供醛官能团，其可以与蛋白质中的胺基团反应以产生仲胺键，这对蛋白质去除过程^{至关重要27}。
15. 盖上印章，让它们在室温下静置30分钟，然后再次用去离子水彻底冲洗。以与盖玻片相同的方式从邮票表面去除多余的水分，并让邮票在未覆盖的情况下干燥约30分钟。
16. 30分钟后，检查蛋白质涂层盖玻片和印章是否干燥。如果其中任何一个没有完全干燥，请使用过滤气枪将其完全干燥，确保盖玻片长时间不暴露在光线下。
17. 盖玻片和盖玻片干燥后，以足够的压力将盖玻片图案一侧向下推到盖玻片上，使盖玻片与盖玻片表面完全接触。将印章与盖玻片接触15分钟。
    注意:由于戊二醛印章与玻璃盖玻片上的蛋白质层之间的共价酰胺键比蛋白质层和玻璃盖玻片之间的弱疏水相互作用强得多，蛋白质在去除后应根据PDMS印章上的图案剥离玻璃。
18. 15 分钟后，小心地从盖玻片上撕下 PDMS 印章。
    注意:如果移除过程正确，则印章不应在没有阻力的情况下从盖玻片上脱落，但也不应牢固地粘在盖玻片上，以免在没有过度用力的情况下将其移除。
19. 使用荧光显微镜上的适当滤光片检查图案盖玻片的保真度（取决于蛋白质标记的荧光染料）。
20. 立即使用带图案的盖玻片，或保存并存放，避免直射光线。

3. 激活的盖玻片

注意:在PAA凝胶的实验室中使用的底部盖玻片是在此步骤中制造的。该底部盖玻片经过特殊处理，可在图案化过程中移除顶部图案盖玻片时，使 PAA 凝胶保持牢固粘附。类似的技术也在别处^{描述10，12，15，28}。

1. 将30毫米盖玻片在100%乙醇中超声处理10分钟，用去离子水冲洗，然后用过滤的气枪彻底干燥。在6孔板中每批一次制备多达6个盖玻片。
2. 等离子体在高（射频功率为30 W）上处理盖玻片1分钟，然后将每个盖玻片放入6孔板的孔中。
3. 在通风橱中用乙醇中的非常薄的5%APTMS涂层每个盖玻片。
   注意:如果在此过程中涂层过多，将形成橙色残留物。
4. 盖上6孔板，让盖玻片静置5分钟。
5. 用去离子水彻底冲洗盖玻片（两侧）和每个孔的内部，并去除孔内多余的水。
6. 将盖玻片放回6孔板中，并在去离子水中加入约2mL 0.5%戊二醛。
7. 盖上6孔板，让盖玻片在戊二醛溶液中静置30分钟;然后，用去离子水彻底冲洗盖玻片和每个板的孔。
8. 将处理过的盖玻片储存在6孔板内的去离子水中长达两周或立即使用。使用前确保盖玻片完全干燥。

4. PAA凝胶制备和图案转移

注意:一旦制成图案化的盖玻片，必须使用它们将这些蛋白质图案转移到PAA水凝胶中（<24小时）^1，29，30。以下配方适用于杨氏模量为3.6 kPa的PAA凝胶。双丙烯酰胺、丙烯酰胺和去离子水的量可以改变以调节PAA凝胶¹²的刚度。

1. 在开始制造PAA水凝胶前体之前，从冰箱中除去丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯，使其在打开前可以达到室温。准备一个可互换的盖玻片皿，用70%乙醇灭菌，并在使用前将其置于生物安全柜中的紫外线下至少30分钟。
   注意:NHS是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。
   1. 将1.25 mL 40%丙烯酰胺加入去离子水中，加入15 mL锥形管中。
      注意:丙烯酰胺是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。
   2. 将175μL双丙烯酰胺溶液在去离子水中加入到同一管中（步骤4.1.1）。
      注意:双丙烯酰胺是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。
   3. 加入500μL10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
      注意:PBS是一种眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜。
   4. 加入2.915毫升去离子水。
2. 将969μL该前体移液到1.5mL微量离心管中，并将其余部分在4°C下储存长达两周。
3. 在另一个微量离心管中测量出〜50-100mg过硫酸铵（APS），并将其在去离子水中稀释至100mg / mL;将其放在一边供以后使用。打开罩子中的NHS酯（现在在室温下），并在微量离心管中仔细测量高达3mg的NHS。将NHS酯稀释至1mg / mL在1x PBS中。
   注意:APS是皮肤和眼睛的刺激物;处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。APS和NHS酯都会随着时间的推移而水解，导致储备溶液中化学物质的活性发生变化。因此，这两种溶液每次都必须新鲜制备（与其他前体不同）。
4. 在通风橱中执行接下来的三个步骤:
   1. 将2μL四甲基乙二胺（TEMED）加入含有969μL等分试样的PAA前体的微量离心管中。
      注意:TEMED是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花，处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。TEMED是PAA水凝胶聚合所必需的两种交联剂之一，另一种是APS。
   2. 加入15μL1M盐酸以降低水凝胶溶液的pH值并避免NHS酯的水解。
      注意:盐酸是一种腐蚀性皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜，并在通风橱下工作。
   3. 向管中加入10μLNHS酯溶液。
      注意:NHS 对图案化过程至关重要。它将与图案覆盖玻片上的蛋白质中的胺基反应以形成稳定的酰胺键，这将允许图案在聚合时从玻璃盖玻片转移到PAA凝胶的表面³¹。
5. 在生物安全柜中执行以下最后步骤:
   1. 小心地将30毫米盖玻片放在盖玻片盘组的金属部分（3-APTMS和戊二醛处理的一面朝上），并将塑料环拧在上面。设置有图案的盖玻片，以便在下一步中轻松触及，同时尽可能保护其免受光线照射。
   2. 将5μLAPS溶液移液到微量离心管中的PAA前体的其余部分中，将其倒置以混合，然后立即将35μL该溶液移液到30mm盖玻片上。
   3. 将图案化的盖玻片蛋白面朝下滴到溶液上，小心不要在水凝胶中产生气泡。保护水凝胶免受光照，并使其聚合90分钟。
   4. 一旦水凝胶聚合，使用剃须刀片或手术刀去除上盖玻片，确保盖玻片不会从凝胶上滑落或脱落到凝胶上，因为这会破坏凝胶表面的图案。
      注意:不要将凝胶暴露在气流较大的区域（如生物安全柜）。<
   5. 为了钝化水凝胶中任何剩余的NHS酯，向凝胶中加入2mL无菌PBS并在37°C下孵育45分钟。立即准备凝胶进行实验或将其在4°C的无菌PBS中储存过夜，直到使用。

5. 成像

1. 为了准备用细胞进行实验，在计划实验之前的下午在显微镜中打开热量（37°C）和湿度（70%），以使显微镜室内的设备平衡到更高的温度。
   注:此步骤可最大限度地减少由温度波动引起的 z 轴漂移。
2. 在实验开始之前，打开腔室的CO₂ 源。
3. 为了防止在实验过程中由于显微镜载物台的重复移动而引起的x-y漂移，用双面胶带将细胞接种的水凝胶固定在载物台上的可互换盖玻片培养皿集。
4. 查看凝胶以找到感兴趣的帧以进行成像，保存要成像的部分的每个阶段位置。
5. 在对应于标记蛋白质的明场视图和荧光视图中，将显微镜软件设置为每帧成像一次，每5分钟一次，持续2小时。

6. 图像分析

注意:已经开发了一种系统，可以通过确定牵引点的位置，插值变形点的初始位置，然后计算每个位置的细胞牵引力来测量图案化PAA凝胶的变形。可以使用任何能够执行图像处理和数值计算的软件系统。该程序旨在快速确定牵引力，消除用户输入和预处理程序，这些程序会导致与用户相关的错误。此处使用的代码可在此处作为 补充文件 2-10 获得，这些文件以及一对练习图像可在 www.bu.edu/mml/downloads 访问。

1. 在图像处理软件中，从使用的每个显微镜视图中按顺序打开在延时摄影实验期间拍摄的所有单个图像，从捕获的第一个图像到最后一个图像，并将它们转换为单个图像堆栈（单击 图像|堆栈|要堆叠的图像）。确保有两个单独的图像堆栈:一个是细胞的明场视图，另一个是它们所附着的图案的荧光视图。
   1. 如果荧光图像中存在漂移（即，感兴趣的岛在每个帧之间的x和/或y方向上移动了>1-2μm），则首先使用StackReg插件（P. Thévenaz，瑞士联邦理工学院洛桑）处理图像堆栈，以根据第一个图像的位置重新居中堆栈中的每个图像（单击 插件|堆栈|翻译|好的）。
      注意:这一点至关重要，因为即使是亚μm的漂移也会显著影响牵引力的最终计算，特别是在较硬的凝胶上，其中x-y漂移超出了预期噪声的范围。该代码将在漂移被删除后保存图像，然后可以将其制作成新的图像堆栈进行分析。
2. 将明场和荧光图像堆栈输入到CTFTimelapse.m（补充文件2）中。
   1. 指定图像堆栈位于第 7 行的文件目录。
   2. 在第 8 行和第 9 行上，分别指定荧光图像堆栈的名称和相应的明场荧光堆栈。
   3. 指定 PAA 凝胶刚度 （Pa）:
      1. 在第11-14行中，包括最常用的PAA水凝胶的几种不同的弹性模量，注释掉（线开始时的类型% ）除所分析图像中凝胶的弹性模量之外的所有。或者，如果弹性模量尚不存在，则添加弹性模量并注释掉其余部分（测试图像为3658.19 Pa）。
   4. 在第 15 行（1 × ^10-6 m 对于测试图像）上指定点半径 （m）。
   5. 在第 16 行（对于测试图像为 2.5 μm）上指定最大可能的点直径 （μm）。
   6. 指定像素比率（μm/像素）:
      1. 在第17-20行中，包括基于以前使用的成像设置的几个不同的图像像素比，注释掉（在行的开头键入% ）除所分析图像的像素比之外的所有图像。或者，添加使用的像素比（如果尚不存在）并注释掉其余部分（测试图像为0.1613μm/像素）。
   7. 在第 35 行和第 87 行，指定所需图像处理文件所在的文件目录。
      注:从荧光图像堆栈中，该代码确定每个荧光点的位置并跟踪每个点在堆栈²⁰中每个图像之间的移动。微接触打印点的初始位置是已知的，因为它们在正确转移到水凝胶³²时不会变形。
3. 等待程序找到点后出现两个数字和一个对话框。使用 图 1 确保程序已找到正确的点，并且没有找到许多没有点的点。使用 图 2 选择矩形网格，帮助程序定位和计算蜂窝牵引力。
   注: 图1 是细胞的明场图像，程序找到的点（将是红色的）覆盖在其上（见 图3A）。 图2 是显示 图1 所示相同点的图像，但背景中没有明场图像。
   1. 等待对话框提示在 选择点后按 Enter 键-其中每个点都是程序找到的红点之一-并且其中有一个标记为 Enter 的大按钮。
   2. 在 图 2 中选择四个不同的点，以在该图案周围创建一个矩形网格，并包括该图案上的单元/簇。 通过左键单击 鼠标逐个选择每个点，然后按上述对话框中按钮上的 Enter键 进行确认。保持第一个和第二个点以及第一个和第三个点之间有多少个点的计数，因为一旦选择了所有四角点，程序将要求这些值。在命令窗口中输入这些值（键入 点数，然后在出现提示时单击键盘上的 Enter 按钮）。
4. 选择矩形网格后，等待脚本根据荧光点的位置计算它在网格内找到的牵引力。请注意，脚本首先查找每个点的几何中心的位移矢量 （u），然后使用等式 （1） 计算相应的牵引力矢量 （F）:
   （1）
   其中 E 是PAA衬底的杨氏模量， a 是荧光点标记的半径， ν 是PAA衬底³²的泊松比。方程式（1）假设基底是一个无限弹性的半空间，在每个圆形点标记的中心施加牵引力，并且点标记之间的间距足够大，使得它们各自的位移不会相互作用²³。
   注意:在此描述的实验中，使用半径a = 1μm和6μm中心间距的点标记。单元/簇内指向单元中心的牵引力箭头应存在，而单元/簇外的区域不应存在牵引箭头（参见图3C-E）。从细胞/细胞簇内部向外的牵引箭头或细胞外存在的许多大型牵引箭头表明矩形网格选择不当。
5. 找到正确的牵引场后，选择小区/磁簇周围的适当感兴趣区域（ROI），其中包括使用光标的单元内的所有牵引箭头。
   1. 要绘制 ROI， 请根据需要多次左键单击 以绘制具有所需多条边的多边形形状，调整形状或在绘制后分别通过 左键单击 角或边缘来移动 ROI。绘制ROI后， 双击鼠标左 键以移动到堆栈中的下一个图像。对明场堆栈中的所有图像重复此操作。
      注意:代码会将每个时间点的牵引力和位移数据保存在与原始图像堆栈相同的文件夹中，然后可以进一步分析。

结果

采用减法微图案化方法制备了杨氏模量为E = 3.6 kPa，泊松比为0.445的PAA水凝胶。水凝胶的厚度约为100μm，这允许它们使用此处使用的成像设置进行成像，同时还可以防止细胞感应凝胶下方的刚性盖玻片，这将在专注于细胞刚性感测的研究中引起问题^23，33。许多其他刚度水平（高达30 kPa）的凝胶已经成功地使用间接微图案化方法^...

讨论

本文介绍了一种间接图案化PAA水凝胶的改进方法。此方法基于以前使用过的方法^{20，35，36，37，38，39，40，41，42}。主要的变化是PDMS印章现在用于去除蛋白质并将所需的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40